劉金蓮， 王小青， 徐勁劍， 梅煜琳， 廖芳蕾,2， 陳文榮,2， 郭衛(wèi)東,2

(1.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004；2.浙江省特色經(jīng)濟(jì)植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 金華 321004)

0 引 言

果形是園藝作物的重要生理性狀，是食用價(jià)值和觀賞價(jià)值的外在表現(xiàn)指標(biāo)之一[1]，果形建成不僅影響果實(shí)的外觀形態(tài)，也與果實(shí)質(zhì)量、果實(shí)品質(zhì)等密切相關(guān)[2]，研究果形的建成對(duì)改變果形、提高果實(shí)品質(zhì)有重要意義.花粉直感效應(yīng)對(duì)許多園藝作物的果形產(chǎn)生顯著的影響[3-4]，且花粉中的遺傳因子會(huì)對(duì)果形的發(fā)育起到重要調(diào)控作用[5-6].

目前果形發(fā)育的研究發(fā)現(xiàn)，番茄中SUN，CNR等基因分別在果實(shí)發(fā)育的不同階段調(diào)控果形建成[7].SUN，YABBY基因主要在果形建成初期，即花芽分化和發(fā)育期中起至關(guān)重要的調(diào)控作用[7-8].實(shí)驗(yàn)證明，SUN作為正向調(diào)控因子編碼影響果實(shí)伸長(zhǎng)的基因[9-10]，能夠有效控制番茄果形指數(shù)[7].SUN在授粉后開始啟動(dòng)[11].KAN2是心皮發(fā)育相關(guān)基因，該基因啟動(dòng)表示心皮發(fā)育在進(jìn)行[12].CNR是控制胎座發(fā)育的基因，PavCNR12可控制甜櫻桃果形，而與其高度相似的PbCNR6也能控制梨果形[13-14].CRC能夠抑制花的分生組織發(fā)育，并且調(diào)控雌蕊發(fā)育[15].柑橘是世界上產(chǎn)量最高的果樹，也是我國(guó)第一大水果，其果形相關(guān)基因研究領(lǐng)域存在較多空白，對(duì)花粉影響果形發(fā)育的機(jī)制和果形遺傳方面的研究相對(duì)較少.

佛手、香櫞同為蕓香科柑橘屬物種，但在果形上卻存在極大差異[16].香櫞(CitrusmedicaL.)果形一般呈現(xiàn)為橢圓形、近圓形或兩端狹的紡錘形[17]，表面粗糙.佛手(Citrusmedicavar. L.sarcodactylisSwingle)是香櫞的變種，果形頂端呈指狀開裂[18].研究果形需要對(duì)果實(shí)外觀進(jìn)行準(zhǔn)確描述，通常會(huì)采用果形指數(shù)作為參考，即測(cè)量果實(shí)橫縱徑.果形指數(shù)是衡量蘋果外觀質(zhì)量的主要指標(biāo)，通常果形指數(shù)越接近1，表明該果實(shí)越端正[19].已有研究表明，梨[20]、獼猴桃[21]等外形規(guī)則的果實(shí)，在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，果形指數(shù)會(huì)發(fā)生變化，且同一物種不同品種間果形指數(shù)同樣也存在差異[22].而對(duì)于佛手等不規(guī)則形態(tài)的果實(shí)，則需測(cè)量果實(shí)最長(zhǎng)橫徑和最寬縱徑，對(duì)果實(shí)進(jìn)行跟蹤測(cè)量.

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，佛手和香櫞果形差異從花芽發(fā)育時(shí)期開始.在佛手和香櫞開花當(dāng)天花和葉的組織中，檢測(cè)到SUN家族基因及YABBY家族基因在雌蕊上的表達(dá)差異[18]，推測(cè)上述家族其他基因也可能會(huì)參與雌蕊到果實(shí)的形態(tài)建成.通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)已檢測(cè)CNR，CRC，SUN，KAN2，YABBY2，YABBY5等基因在香櫞和佛手的花芽發(fā)育階段存在表達(dá)差異，因此，本文將以上述基因?yàn)閰⒖祭^續(xù)探討果形差異和基因表達(dá)差異的相關(guān)性.代代酸橙(C.aurantiumvar.daidaiTanaka)的果形在經(jīng)過(guò)園藝栽培后有諸多形態(tài)，本文選擇以果頂有較深的放射溝直達(dá)果基，果實(shí)表面有凹凸縱向紋路的代代酸橙為研究材料.研究以佛手、香櫞和代代酸橙這3種花粉為父本，以香櫞為母本進(jìn)行授粉，對(duì)香櫞果形發(fā)育的形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)追蹤觀測(cè)，在各授粉組香櫞的雌蕊的mRNA檢測(cè)上述5種果形建成相關(guān)基因的表達(dá).通過(guò)研究佛手、代代酸橙花粉對(duì)香櫞果形的影響，以期了解柑橘屬花粉直感對(duì)果形發(fā)育的影響及可能的作用機(jī)理，為蕓香科植物果形研究提供新的思路.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

選擇生長(zhǎng)狀況一致且無(wú)病蟲害的三年生香櫞共10株，作為本次實(shí)驗(yàn)的母本材料，對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)修剪，每株保留相同數(shù)目的花芽，進(jìn)行相同的水肥管理.收集開花當(dāng)天的佛手、香櫞及代代酸橙開放花的新鮮花粉作為本次實(shí)驗(yàn)的父本材料.實(shí)驗(yàn)于2018年2月—2018年12月在大棚內(nèi)進(jìn)行.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 組別設(shè)置

在大小合適的3組香櫞花序上用鑷子除去多余的雄花和已開的雌花，保留同樣數(shù)目的雌花，并對(duì)其進(jìn)行前期套袋處理和分組掛牌標(biāo)記，防止其他花粉對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生干擾.

每個(gè)花粉授粉組選擇3株香櫞為母本，設(shè)1，2，3株為香櫞花粉授粉組，4，5，6株為佛手花粉授粉組，7，8，9株為代代酸橙花粉授粉組，其中第3，6，9株用作觀察，其余植株用作取樣；第10株香櫞不作處理，用作空白組的取樣拍照等.

1.2.2 花粉的采集凍存和授粉套袋

在佛手、香櫞、代代酸橙開花的當(dāng)天，用鑷子剝離花藥，置于26～28 ℃條件下24 h，待花粉自然散粉后，收集成熟的花粉輕柔放入離心管中，在離心管上標(biāo)明取樣日期及花粉種類.取樣結(jié)束后迅速將花粉放入冰盒中，再放入-80 ℃的冰箱中低溫凍存.

對(duì)前期去雄套袋處理的花芽進(jìn)行授粉，將佛手、香櫞和代代酸橙花粉分別授粉香櫞柱頭(花粉在柱頭上均勻涂抹3次，盡量使每個(gè)柱頭上的花粉數(shù)量一致)，授粉處理完畢后重新套袋，并進(jìn)行掛牌標(biāo)記.

1.2.3 果形觀察及生長(zhǎng)數(shù)據(jù)追蹤記錄

定期觀察并拍照記錄3組花粉授粉組果實(shí)形態(tài)的變化,用游標(biāo)卡尺分別測(cè)量果實(shí)的橫徑和縱徑，果形指數(shù)為縱徑和橫徑的比值.觀察果實(shí)的顏色變化、突起、褶皺的有無(wú)等形態(tài)特征，及時(shí)記錄香櫞果實(shí)有落果或者生長(zhǎng)狀況不佳的情況.

1.2.4 香櫞雌蕊的收集和凍存

參考前期栽培經(jīng)驗(yàn)，將香櫞花期分為開花前7天、開花授粉當(dāng)天及授粉后7天共3個(gè)時(shí)期進(jìn)行取樣，并將樣本置于-80 ℃冰箱中冷凍保存.

1.2.5 熒光定量PCR

根據(jù)Trizol C Invitrogen試劑盒的方法提取事先凍存的3種花粉和各組花芽樣本的RNA，參照Vazyme公司的HiScript?Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄說(shuō)明書合成轉(zhuǎn)錄的特定基因的cDNA第一鏈，β-actin驗(yàn)證cDNA產(chǎn)物.

使用生物信息學(xué)技術(shù)設(shè)計(jì)果形相關(guān)基因序列，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列合成于生工生物工程有限公司(上海).

以各樣品cDNA為模板，β-actin作為內(nèi)參基因，在模板內(nèi)分別加入不同目的基因引物，按照SYBR? Premix Ex TaqTM PCR Kit試劑盒(艾德萊，北京)配制反應(yīng)體系，通過(guò)熒光定量PCR儀(型號(hào)：ABI PRISM 7000)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn).實(shí)時(shí)熒光定量的程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃ 30 s，退火溫度30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)體系為20 μL，含200 ng cDNA，10 μL SYBRGreen PCR mix，10 μM的上下游引物各0.8 μL，最后用雙蒸水補(bǔ)足.每個(gè)基因和每個(gè)樣品均進(jìn)行3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，采用2-△△CT方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量.

表1 熒光定量 PCR 引物

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，SigmaPlot 14.0繪制圖表，采用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行單因素(One-way ANOVA)方差分析(P<0.05).

2 結(jié)果與分析

2.1 香櫞、佛手、代代酸橙的果形比較

在果實(shí)成熟期，香櫞果形一般呈果頂果臍尖的紡錘形，佛手具有指狀的開裂.代代酸橙的果形具有縱向突起，全果有瘤狀褶皺，但縱向突起不分裂的形態(tài).以上3種果形如圖1所示.在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，與佛手和代代酸橙種在一起的香櫞果皮更加粗糙，因此，在第2年對(duì)該香櫞進(jìn)行去雄套袋處理，觀察不同花粉授粉后的果形是否確實(shí)發(fā)生了變化.

圖1 香櫞、佛手、代代酸橙果形圖

2.2 不同授粉組香櫞的果形差異

經(jīng)過(guò)2年授粉的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，在佛手授粉和代代酸橙授粉組，均有90%以上的果形出現(xiàn)變異.從形態(tài)外觀上比較，自交授粉香櫞果形呈現(xiàn)為中間圓，頂端狹的紡錘形，果皮表面較光滑(見(jiàn)圖2a～2b).代代酸橙花粉授粉后的香櫞表面出現(xiàn)縱向輕微褶皺突起現(xiàn)象(見(jiàn)圖2c～2d).佛手花粉授粉后的香櫞相對(duì)更加狹長(zhǎng)，表面粗糙，果皮不光滑程度大大加深，除了縱向的褶皺突起，突起部分不連續(xù)，導(dǎo)致果皮上出現(xiàn)瘤狀突起(見(jiàn)圖2e～2f).果形指數(shù)顯示，代代酸橙與佛手授粉的果實(shí)果形指數(shù)偏小(見(jiàn)圖2g)，即果形偏扁平.

a:香櫞花粉授粉組未成熟香櫞；b:香櫞花粉授粉組成熟香櫞;c:代代酸橙花粉授粉組未成熟香櫞；d:代代酸橙花粉授粉組成熟香櫞；e:佛手花粉授粉組未成熟香櫞；f:佛手花粉授粉組成熟香櫞；g:授粉后的果形指數(shù)比較

2.3 果形相關(guān)基因在花粉和授粉前后柱頭上的表達(dá)分析

在授粉前，對(duì)果形相關(guān)基因在3種花粉中的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析(見(jiàn)圖3)后發(fā)現(xiàn)，CNR基因在香櫞花粉中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他2種花粉，在佛手花粉中表達(dá)最低.CRC和YABBY5基因在佛手花粉中表達(dá)量最高，在香櫞和代代酸橙花粉中僅有微量表達(dá)；SUN基因在代代酸橙花粉中的表達(dá)量極低，在香櫞和佛手花粉中表達(dá)量稍高，但表達(dá)總量仍處較低水平.由于YABBY2僅在香櫞花粉中檢出，在佛手和代代酸橙中無(wú)法檢出，因此，對(duì)YABBY2基因的相對(duì)表達(dá)量分析未完成.KNA2在3種花粉中表達(dá)量都較低，無(wú)法分析.

觀察各基因在不同花粉授粉的雌蕊中相對(duì)表達(dá)量(見(jiàn)圖4)發(fā)現(xiàn)，CNR基因授粉后的表達(dá)量在自交組呈上調(diào)趨勢(shì)，在佛手和代代酸橙授粉后并未上調(diào)，尤其在代代酸橙組下調(diào)更明顯.CRC基因在佛手授粉當(dāng)天的表達(dá)量有突增現(xiàn)象，各組都在授粉后表達(dá)顯著下調(diào).SUN基因在自交組和佛手授粉組中授粉當(dāng)天顯著上調(diào)，自交組授粉后相對(duì)授粉當(dāng)天下調(diào)，但高于授粉前；SUN基因在代代授粉后表達(dá)量無(wú)顯著差異.KAN2基因授粉后的表達(dá)量在佛手組變化不顯著，在自交組出現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，而在代代酸橙組出現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì).3個(gè)授粉組中的YABBY2基因表達(dá)趨勢(shì)總體相同，授粉后表達(dá)量都呈上調(diào)趨勢(shì).YABBY5基因的表達(dá)在3個(gè)授粉組中均為授粉后下調(diào)，且低于授粉前；在代代酸橙授粉組中，在授粉當(dāng)天顯著增高，其余2組并未有顯著差異.

圖4 果形相關(guān)基因在不同花粉授粉的香櫞雌蕊相對(duì)表達(dá)量

3 討論與結(jié)論

為了探討花粉直感是否在柑橘屬作物果形建成中發(fā)揮作用，對(duì)不同花粉授粉后的香櫞果實(shí)形態(tài)進(jìn)行了研究.通過(guò)比較自交組香櫞花芽不同發(fā)育時(shí)期后發(fā)現(xiàn)，香櫞雌蕊授粉前的發(fā)育明顯有一個(gè)縱向快速生長(zhǎng)階段，而開花授粉后不同外源花粉的介入會(huì)影響花芽中這些基因的表達(dá)，這可能是不同花粉授粉導(dǎo)致香櫞果形變化的內(nèi)在分子機(jī)理之一.不同外源花粉介入后可能會(huì)改變香櫞橫縱軸發(fā)育的起始時(shí)間點(diǎn)，從而在一定程度上改變果形.各組授粉后的香櫞果實(shí)在橫向上出現(xiàn)快速增長(zhǎng)，導(dǎo)致果形指數(shù)發(fā)生變化.佛手花粉能使香櫞果形在橫軸上有明顯的縱裂凸起，使香櫞原本的長(zhǎng)圓形果形性狀出現(xiàn)畸變；而代代酸橙花粉會(huì)使香櫞果形變得扁平，同時(shí)也能輕微加深表皮凹痕.由此可見(jiàn)，花粉直感確實(shí)能改變香櫞果形.根據(jù)果形相關(guān)基因在花芽與花粉的mRNA表達(dá)模式分析，可總結(jié)出結(jié)果，見(jiàn)表2及圖5.

表2 果形相關(guān)基因在花芽與花粉的mRNA表達(dá)模式分析

已有研究表明，CmsSUN20在佛手和香櫞中的表達(dá)有顯著差異，可能是導(dǎo)致佛手果實(shí)長(zhǎng)度大于寬度的原因[18].SUN基因在佛手、香櫞花粉中的表達(dá)量高于代代酸橙，而佛手、香櫞花粉授粉當(dāng)天SUN表達(dá)量上調(diào)，代代酸橙授粉后并未有顯著性改變，即花粉中的SUN影響了授粉后的花柱；結(jié)合果形特征分析，SUN基因可能與果形狹長(zhǎng)呈正相關(guān).KAN2是心皮發(fā)育相關(guān)基因[12]，本實(shí)驗(yàn)在花粉中未檢測(cè)到KAN2基因的表達(dá)，推測(cè)KAN2基因可能來(lái)自母本；KAN2在自交組的3個(gè)時(shí)期表達(dá)量一直呈上升趨勢(shì)，但在佛手和代代酸橙授粉組中分別呈現(xiàn)授粉后無(wú)顯著差異或者下調(diào)趨勢(shì)，這可能導(dǎo)致佛手和代代酸橙組授粉的果實(shí)表皮特征不同.KAN2基因的表達(dá)可能與香櫞果實(shí)表皮平整相關(guān).本實(shí)驗(yàn)中CRC在佛手花粉中表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他2個(gè)物種，CRC在佛手授粉后確實(shí)引起了表達(dá)量的突增，即CRC可能與果形指狀開裂有關(guān).YABBY5在佛手花粉中表達(dá)量也高于其他2種花粉，但是香櫞、佛手花粉的授粉都未顯著改變YABBY5在授粉當(dāng)天雌蕊中的表達(dá)，僅在代代酸橙授粉當(dāng)天表達(dá)上調(diào)，授粉后表達(dá)又顯著低于授粉前，推測(cè)YABBY5可能與果形拉長(zhǎng)負(fù)相關(guān).YABBY2在除香櫞外的花粉中未檢測(cè)到表達(dá)，卻在3組授粉當(dāng)天顯著下降，授粉后表達(dá)上調(diào).上述結(jié)果暗示，YABBY2與授粉的花粉種類無(wú)關(guān)，推測(cè)該基因可能來(lái)自母本，且與果形的發(fā)育關(guān)系尚不明確，可能與香櫞果形平滑相關(guān).有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，CNR基因在胚珠中表達(dá)[23].本實(shí)驗(yàn)香櫞自交授粉后的CNR表達(dá)顯著上調(diào)，但佛手與代代酸橙花粉在授粉后并未顯著改變CNR的表達(dá)，且在代代酸橙授粉后表達(dá)顯著下調(diào)；結(jié)合佛手胚珠敗育[24]、代代酸橙種子敗育等性狀，本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了CNR與胚珠發(fā)育相關(guān)，推測(cè)其與果皮平滑相關(guān).

以果形發(fā)育的形態(tài)觀察為基礎(chǔ)，根據(jù)佛手、香櫞、代代酸橙的果實(shí)特點(diǎn)設(shè)置6個(gè)果形性狀：香櫞設(shè)紡錘形與表皮平整；代代酸橙設(shè)扁平形與表皮皺紋；佛手設(shè)狹長(zhǎng)型指狀開裂與表皮縱裂.這些特征可歸納為果皮特征和形態(tài)特征(見(jiàn)圖5).同時(shí)，總結(jié)上述果形基因表達(dá)的模式分析(見(jiàn)表2)，筆者確定了CRC，SUN，KAN2，CNR，YABBY5這5個(gè)基因在香櫞果形發(fā)育中發(fā)揮的可能作用(見(jiàn)圖5).與對(duì)照相比，佛手花粉授粉后香櫞果形的橫軸上出現(xiàn)明顯的縱裂凸起，凸起位置在果皮上隨機(jī)分布；代代酸橙花粉授粉后香櫞果形變扁平，并加深了表皮凹痕，這些形態(tài)特征可能由SUN，CRC，PbCNR6共同調(diào)控，而果皮的光滑或開裂由KAN2，CNR共同調(diào)控.SUN，YABBY5基因與果形拉長(zhǎng)相關(guān)；CRC基因表達(dá)上調(diào)可能與指狀開裂啟動(dòng)有關(guān)；推測(cè)KAN2可能與果實(shí)表皮平整相關(guān)；CNR基因與胚珠發(fā)育有關(guān).但本次實(shí)驗(yàn)尚不明確YABBY2基因與果形的關(guān)系，需要繼續(xù)開展類似實(shí)驗(yàn)來(lái)對(duì)其進(jìn)行探究.挖掘新的果形建成基因，并建立這些基因之間的關(guān)系，是未來(lái)果實(shí)形態(tài)建成的研究趨勢(shì)之一[25].后續(xù)研究將會(huì)擴(kuò)大實(shí)驗(yàn)樣本規(guī)模和基因數(shù)量，繼續(xù)發(fā)掘新的果形相關(guān)基因，并嘗試尋找不同果形相關(guān)基因之間的可能關(guān)聯(lián).

圖5 果形特征和基因關(guān)聯(lián)圖