孫立敏,王松才,朱煥慧,林賢文,管 旭,譚 莉
(廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所,廣州 510030)
近年來(lái),芬太尼類新型毒品作為一類新精神活性物質(zhì)在全世界范圍內(nèi)有濫用趨勢(shì),尤其在歐美國(guó)家[1]。芬太尼類新型毒品屬阿片類鎮(zhèn)痛藥物,其鎮(zhèn)痛作用與嗎啡類似,但鎮(zhèn)痛效果比嗎啡強(qiáng)幾百上千倍,甚至上萬(wàn)倍[2],濫用后會(huì)出現(xiàn)吸毒快感、呼吸抑制、心動(dòng)過(guò)緩等副作用,少量服食即可致人死亡。查閱文獻(xiàn),對(duì)芬太尼類的檢測(cè),主要集中在血液、尿液、毛發(fā)、唾液、呼氣、廢水、芬太尼固體粉末[2]、芬太尼制毒原料[3]等樣品中;常見(jiàn)的樣品前處理方法主要有固相萃取法(SPE)、液-液萃取法[4]等,其中SPE法是生物樣品中芬太尼類物質(zhì)提取和富集最常用的前處理方法[2];常見(jiàn)的分析檢測(cè)技術(shù)主要為分光光度法、免疫分析法、氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(UPLC)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)等[2],其中LC-MS聯(lián)用技術(shù)多采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式,具有靈敏度高、重現(xiàn)性好的特點(diǎn)[5]。近年來(lái),隨著分析儀器的不斷發(fā)展與改進(jìn),在線SPE與LC-MS聯(lián)用已發(fā)展成比較成熟的一項(xiàng)分析技術(shù),該技術(shù)通過(guò)六通閥將SPE柱與LC-MS聯(lián)接起來(lái),從而實(shí)現(xiàn)樣品處理和樣品分析的一體化[6],可以大大簡(jiǎn)化操作。當(dāng)前,關(guān)于色譜-質(zhì)譜[7-8]、固相萃取-色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[9]技術(shù)檢測(cè)芬太尼均有報(bào)道,但是關(guān)于在線固相萃取-液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)生物檢材中芬太尼的報(bào)道較少。
本文建立了血液樣品中12種芬太尼類藥物的在線固相萃取技術(shù)與液質(zhì)聯(lián)用相結(jié)合的快速檢測(cè)方法,具有操作簡(jiǎn)單方便、靈敏度高、樣品量少、檢出限低等特點(diǎn),適用于血液樣品中芬太尼類藥物的檢測(cè)分析。
1290-6470超高效液相色譜儀-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)Agilent公司),在線固相萃取模塊(美國(guó)Agilent公司),Milli-Q IQ 7003超純水儀(美國(guó)Millipore公司),離心機(jī)3-18K(德國(guó)Sigma公司)。
芬太尼、對(duì)氟芬太尼、舒芬太尼、乙酰芬太尼、戊酰芬太尼、丙烯酰芬太尼、呋喃芬太尼、丁酰芬太尼、異丁酰芬太尼、4-氟丁酰芬太尼、4-氟異丁酰芬太尼、卡芬太尼(純度99.5%,公安部第三研究所);乙腈、甲醇、甲酸、醋酸銨(色譜純,美國(guó)Fisher公司)。
準(zhǔn)確稱取上述12種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),用甲醇溶解配制成1 mg/mL的單標(biāo)儲(chǔ)備液,使用前根據(jù)需要用甲醇稀釋配制成所需濃度混標(biāo)溶液。
在線 SPE 柱:Agilent PLRP-S (15~20 μm,2.1 mm×12.5 mm),在線SPE泵為Agilent 1260四元泵,流動(dòng)相A為5%甲醇水,B為乙腈。分析柱:Agilent Poroshell 120 EC-C18(3.0 mm×150 mm×2.7 μm),分析泵為Agilent 1290二元泵,流動(dòng)相A為5 mmol/L醋酸銨緩沖液(含0.1%甲酸),B為乙腈。柱溫40 ℃,進(jìn)樣量20 μL。六通閥切換、梯度上樣及洗脫程序見(jiàn)表1,In-connection SPE-LC-MS/MS流路見(jiàn)圖1。
表1 梯度上樣及洗脫、六通閥切換程序Table 1 Programs for gradient sampling, elution and valve swithching
In-connection SPE-LC-MS/MS流路:上樣階段,SPE閥1-2位相通,檢材樣本經(jīng)由自動(dòng)進(jìn)樣器由SPE泵(四元泵)推入SPE柱,樣品進(jìn)入SPE柱后,在SPE柱上富集,同時(shí)利用SPE流路流動(dòng)相對(duì)富集SPE柱上鹽分及水溶性物質(zhì)等進(jìn)行清洗,完成樣品上樣,該階段SPE流路液體流入廢液,二元泵流路液體過(guò)色譜分析柱平衡。洗脫階段,SPE閥3 min時(shí)瞬間切換至1-6位相通,SPE柱切入由二元泵、色譜分析柱、質(zhì)譜組成的洗脫分析流路,待測(cè)組分由二元泵所推送流動(dòng)相從SPE柱上洗脫至色譜柱分離最后進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè),待測(cè)組分在SPE柱上全部洗脫后,10 min時(shí)SPE再切換至1-2位相通,通過(guò)SPE四元泵推送高有機(jī)相(可自主選擇)對(duì)SPE柱進(jìn)行進(jìn)一步洗雜活化,以備再次使用。
電噴霧正離子模式(ESI+),多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描模式(MRM);毛細(xì)管電壓3 500 V,噴嘴電壓:500 V,鞘氣溫度350 ℃,鞘氣流量11 L/min,干燥氣300 ℃,干燥氣流量5 L/min。12種芬太尼類藥物質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表2。
表2 12種芬太尼類藥物質(zhì)譜參數(shù)Table 2 MS parameters of 12 fentanyl-kind drugs
取血液0.1 mL置于15 mL離心管中,加入0.4 mL乙腈沉淀蛋白,渦旋高速離心,取上清液用純水1∶1對(duì)等稀釋,用0.45 μm濾膜過(guò)濾備檢。
圖2顯示12種芬太尼類藥物的TIC色譜圖。
在12種芬太尼類化合物中4-氟丁酰芬太尼、4-氟異丁酰芬太尼以及丁酰芬太尼、異丁酰芬太尼分別互為同分異構(gòu)體,結(jié)構(gòu)相似,色譜保留性能相差不大,色譜峰出峰時(shí)間集中,難以完全分離,通過(guò)對(duì)不同類型色譜柱優(yōu)化實(shí)驗(yàn),最后選擇了Poroshell 120 ECC18分析柱,實(shí)現(xiàn)了幾種同分異構(gòu)體的較好分離。從系統(tǒng)壓力、分離效果、靈敏度等角度考慮,本方法在甲醇、乙腈中間選擇乙腈作為流動(dòng)相。
目標(biāo)物結(jié)構(gòu)基團(tuán)能吸收電子,流動(dòng)相中加入甲酸可以適當(dāng)提高離子化效率,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明使用5 mmol/L醋酸銨緩沖液(含0.1%甲酸)、乙腈作為色譜分析流動(dòng)相,可以實(shí)現(xiàn)幾種同分異構(gòu)體較好的色譜分離。
分別使用單標(biāo)溶液,選擇ESI+電離模式,利用儀器自帶Optimizer自動(dòng)優(yōu)化軟件對(duì)12種芬太尼類藥物的母離子、子離子、碎裂電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行確定優(yōu)化,選擇強(qiáng)度最高的兩對(duì)離子作為定性分析離子,選擇強(qiáng)度最強(qiáng)的離子作為定量離子,質(zhì)譜主要參數(shù)見(jiàn)表2,MRM見(jiàn)圖3。
空白血中添加12種芬太尼類藥物混標(biāo),按1.5樣品處理方法得到待測(cè)樣品溶液,SPE泵上樣流速分別為0.5、1.0、2.0、3.0 mL/min,考察各流速條件下各組分SPE萃取回收率,結(jié)果顯示12種芬太尼類藥物在上述各流速條件下各待測(cè)組分回收率差別不大,綜合考慮后端色譜峰形、洗雜效果等因素,本實(shí)驗(yàn)SPE上樣流速選擇1.0 mL/min。
考察100%純水、水(含0.1%甲酸)、95%水(含0.1%甲酸)+5%乙腈、95%水+5%甲醇4種SPE上樣流動(dòng)相對(duì)萃取率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,12種芬太尼類物質(zhì)在SPE柱上保留效果較好,4種流動(dòng)相下各組分萃取率差別不大??紤]到樣品洗雜效果、回收率等因素,上樣SPE流動(dòng)相選擇95%水+5%甲醇。
空白血加入乙腈(體積比為1∶4)沉淀蛋白后進(jìn)樣,1.5 min后基線回落走平,所以洗雜去除鹽分、水溶性的蛋白等物質(zhì)至少需要1.5 min,六通閥上樣時(shí)間T1至少要大于1.5 min。12種芬太尼類藥物混標(biāo)進(jìn)樣,上樣時(shí)間分別設(shè)1、2、3、4、6、8 min,考察各組分SPE萃取率,結(jié)果各組分回收率無(wú)明顯影響。綜合考慮方法洗雜效果、待測(cè)組分回收率、檢測(cè)時(shí)間,本方法六通閥切換時(shí)間選擇T1=3 min。
選擇T1=3 min,SPE柱切入分析柱流路中(閥切換)后再切換回SPE流路時(shí)間分別設(shè):10、15、20、25 min,考察各組分萃取率。待測(cè)組分萃取率在上述4個(gè)時(shí)間條件下無(wú)明顯差異,即SPE柱切入分析柱流路中7 min后12種待測(cè)組分基本上都可以從SPE柱轉(zhuǎn)移至分析柱上。此時(shí)SPE柱及時(shí)切回四元泵回路,用高有機(jī)相沖洗洗雜,活化SPE柱,同時(shí)避免雜質(zhì)等污染物進(jìn)入分析柱及質(zhì)譜中,所以SPE柱通過(guò)六通閥再次切回SPE流路時(shí)間點(diǎn)選擇10 min。
實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)純有機(jī)溶劑標(biāo)樣直接進(jìn)樣,溶劑效應(yīng)明顯,峰形變寬,部分組分峰重疊,過(guò)在線SPE柱后進(jìn)樣峰形有改善,但部分峰分離度較差。水樣標(biāo)準(zhǔn)品直接進(jìn)樣、過(guò)SPE進(jìn)樣,峰形正常。100%乙腈標(biāo)樣過(guò)SPE進(jìn)樣5 μL,峰形勉強(qiáng)可用;50%乙腈過(guò)SPE進(jìn)樣10 μL,峰形尚可;40%乙腈樣品過(guò)SPE進(jìn)樣20 μL,峰形分離度正常(圖4)。綜合考慮方法檢測(cè)限、色譜分離、實(shí)際樣品等因素,確定實(shí)際案件檢驗(yàn)樣品的處理為乙腈∶血=8∶2沉淀蛋白,上清液用水相1∶1對(duì)等稀釋后過(guò)SPE進(jìn)樣分析。
在血液中分別添加12種芬太尼類藥物的混標(biāo)工作液,得到2.5、5、50、250、500、1 000 ng/mL系列濃度的加標(biāo)樣品溶液,按上述1.5節(jié)方法對(duì)樣品進(jìn)行處理。
以定量離子峰面積對(duì)目標(biāo)物濃度進(jìn)行線性回歸,建立工作曲線,考察添加濃度在2.5~1 000 ng/mL間的線性情況,實(shí)驗(yàn)表明方法R2均大于0.999 0,滿足定量分析要求。12種芬太尼類藥物回歸方程、R2、檢出限、定量限見(jiàn)表3,檢出限按3倍信噪比確定,定量限按10倍信噪比確定。
表3 12種芬太尼類藥物回歸方程、R2、檢出限、定量限Table 3 12 fentanyl-kind drugs and their related regression equations, R2, detection limits and quantification limits
在血液基質(zhì)中分別添加從低到高4個(gè)濃度的12種芬太尼類藥物混標(biāo),按優(yōu)化后的方法條件,對(duì)12種藥物含量進(jìn)行檢測(cè),測(cè)得回收率、日內(nèi)精密度、日間精密度如表4所示。
表4 血液中12種芬太尼類藥物的回收率和精密度(n=6)Table 4 Intra- and inter-day RSDs of 12 fentanyl-kind drugs in blood sample (n=6)
采用在線固相萃取技術(shù)與液質(zhì)聯(lián)用相結(jié)合的方式,通過(guò)對(duì)色譜、質(zhì)譜及在線SPE參數(shù)條件優(yōu)化,建立了12種芬太尼類藥物的在線SPE-LC-MS/MS檢驗(yàn)方法。該方法快速便捷、檢材需求量少,能夠自動(dòng)完成樣品的在線凈化富集,回收率、靈敏度高,能夠滿足實(shí)際案件檢驗(yàn)需求。