楊發(fā)震，李紹鵬,*，沈 松，蘇少明，李樹(shù)華，陳 康，魯志強(qiáng)

（1. 云南省公安廳，毒品分析及禁毒技術(shù)公安部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650228；2.玉溪市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，云南 玉溪 653100；3. 昆明醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，昆明 650500）

近年來(lái)，在實(shí)際案件的檢驗(yàn)鑒定中，經(jīng)常碰到嫌疑人將曲馬多、芬太尼和地芬諾酯等非法添加到中草藥或地芬諾酯單獨(dú)添加制成不同顏色的復(fù)方膠囊作為阿片類(lèi)毒品戒斷藥物或新型毒品銷(xiāo)售的案件，并且已發(fā)生多起吸食過(guò)量導(dǎo)致死亡的案件。

曲馬多（tramadol）是一種阿片受體激動(dòng)劑和常用的中樞性鎮(zhèn)痛藥，最早于1977年在德國(guó)上市，它易產(chǎn)生不良反應(yīng)且存在濫用的可能性[1-2]，其體內(nèi)代謝產(chǎn)物主要是O-去甲基曲馬多（ODT）、N-去甲基曲馬多（NDT）及N,O-去甲基曲馬多（NODT）成分[3-4]，由于獲取途徑方便、價(jià)格便宜，近年已被一些不法分子作為傳統(tǒng)毒品替代品來(lái)使用[5]。芬太尼（fentanyl）血漿中的治療水平可低至1 ng/mL，藥效約為嗎啡的50～100倍、海洛因的30～50倍，是一種強(qiáng)效、短效的麻醉性鎮(zhèn)痛藥，主要用于外科麻醉和癌癥患者疼痛的治療，最早于20世紀(jì)70年代中期出現(xiàn)濫用，主要代謝物為諾芬太尼[6-8]。芬太尼被添加到海洛因中的歷史可追溯到1979年，目前白色海洛因、黑焦油海洛因等中均有芬太尼及類(lèi)似物檢出的報(bào)告，僅在2013～2014年間，美國(guó)就有700多人死于芬太尼及類(lèi)似物[9-11]。地芬諾酯（diphenoxylate）長(zhǎng)期服用可形成依賴(lài)，常被吸毒人員作為海洛因替代品濫用，中毒量與治療量較接近且代謝產(chǎn)物地芬諾辛毒性更強(qiáng)，過(guò)量服用極易引起中毒甚至死亡，目前濫用的情況越來(lái)越嚴(yán)重[12-16]。有報(bào)道稱(chēng)伊朗銷(xiāo)售的許多用作阿片類(lèi)藥物戒斷藥的中草藥中，大量樣品檢出曲馬多、美沙酮和地芬諾酯成分[17]。

目前血液、血漿、尿液、毛發(fā)等生物樣品中曲馬多、芬太尼、地芬諾酯成分的檢驗(yàn)，主要采用氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS）、高效液相色譜法（HPLC）、液相色譜-高分辨質(zhì)譜法（LC-HRMS）、氣相色譜-高分辨質(zhì)譜法（GC-HRMS）及毛細(xì)管電泳法（CE）等[4-5,7,18-26]。體外樣品如片劑、針劑溶液等所含曲馬多、芬太尼、地芬諾酯的檢驗(yàn)主要采用高效液相色譜法（HPLC）、毛細(xì)管電泳法（CE）進(jìn)行[27-34]。目前尚未見(jiàn)有對(duì)繳獲的毒品樣品尤其是中草藥毒品樣品中曲馬多、芬太尼、地芬諾酯三種成分同時(shí)定量測(cè)定的方法報(bào)道。

本文建立了對(duì)繳獲毒品中曲馬多、芬太尼、地芬諾酯同時(shí)定量分析的高效液相色譜-二極管陣列（HPLC-DAD）檢驗(yàn)方法，可為相關(guān)案件的檢驗(yàn)鑒定提供方法上的支撐。該方法前處理簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，精密度、穩(wěn)定性好，已成功應(yīng)用于實(shí)際案件繳獲的不同顏色膠囊包裝的黃色粉末狀中草藥毒品和白色粉末狀毒品樣品的定量分析。圖1為曲馬多、芬太尼、地芬諾酯三種物質(zhì)的結(jié)構(gòu)式。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑和材料

Agilent 1260 Infinity II液相色譜系統(tǒng)，配二極管陣列檢測(cè)器（美國(guó)Agilent 公司），Purelab Flex純水系統(tǒng)（英國(guó)ELGA公司），MS 105分析天平（瑞士Mettler Toledo公司），KQ-50DB型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

鹽酸曲馬多（化學(xué)對(duì)照品，約100 mg，中國(guó)藥品生物制品檢定所），鹽酸地芬諾酯（化學(xué)對(duì)照品，約50 mg，中國(guó)藥品生物制品檢定所），枸櫞酸芬太尼（國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，約100 mg，中國(guó)食品藥品檢定研究院），甲醇和乙腈（HPLC級(jí)，美國(guó)Fisher Scientific公司），磷酸（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司），磷酸二氫鉀（分析純，天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司），實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

準(zhǔn)確配制濃度為1.0 mg/mL的曲馬多、芬太尼、地芬諾酯單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液及混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-20 ℃恒溫避光保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)，用甲醇稀釋成所需濃度的單標(biāo)或混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2 繳獲的毒品樣品

案件中抽取的不同顏色膠囊包裝的毒品65份，按照膠囊顏色（膠囊帽-膠囊體）分為7種顏色：藍(lán)-白色、金-金色、棕-棕色、黑-黃色、紅-白色、黑-白色、藍(lán)-藍(lán)色，其中包括41份黃色粉末狀中草藥毒品（編為S-1至S-41號(hào)）和24份白色粉末狀毒品（編為S-42至S-65號(hào)）。

41份黃色粉末狀中草藥毒品膠囊中：有16份為藍(lán)-白色、8份為金-金色、11份為棕-棕色、6份為黑-黃色包裝；24份白色粉末狀毒品膠囊中：有5份為棕-棕色、5份為紅-白色、7份為黑-白色、7份為藍(lán)-藍(lán)色包裝。選取編為S-1號(hào)黃色粉末狀中草藥毒品和S-43號(hào)白色粉末狀毒品用于相關(guān)測(cè)試。

上述均為某市公安局禁毒部門(mén)在2019年1月至2020年3月份期間在四川、重慶、陜西、云南等地繳獲并委托本實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)的樣品，樣品抽取后于室溫保存。

本實(shí)驗(yàn)室采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)上述樣品定性檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，黃色粉末狀中草藥毒品中均含有曲馬多、芬太尼和地芬諾酯成分，白色粉末狀毒品中均含有地芬諾酯成分。

1.3 樣品前處理

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取黃色粉末狀毒品50 mg、白色粉末狀毒品10 mg，加適量甲醇超聲提取20 min后，加甲醇定容至10 mL，搖勻，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，供HPLC-DAD分析。

1.4 儀器條件

色 譜 柱：Agilent Zorbax SB-C18 色 譜 柱 (4.6 mm×250 mm, 5 μm)；柱溫：30 ℃。流動(dòng)相A：12 mmol/L磷酸二氫鉀（10%稀磷酸調(diào)至pH=4），流動(dòng)相B：乙腈。梯度洗脫程序：0.0～3.0 min，23.5%B；3.0～8.0 min，37%B ；8.0～12.0 min，37%B ；12.0～18.0 min，80%B ；18.0～23.0 min，80%B ；23.0～25.0 min，23.5%B。流速：0.8 mL/min；進(jìn)樣量為5 μL。檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm，采集范圍：190～400 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)考察了以0.3%磷酸溶液/乙腈、0.3%甲酸溶液/乙腈和12 mmol/L磷酸二氫鉀溶液（10%稀磷酸調(diào)至pH=4）/乙腈等流動(dòng)相在等度及梯度洗脫條件對(duì)待測(cè)目標(biāo)物（曲馬多、芬太尼及地芬諾酯）保留時(shí)間、峰型和分離度等的影響，結(jié)果采用12 mmol/L磷酸二氫鉀溶液（10%稀磷酸調(diào)至pH=4）/乙腈為流動(dòng)相、梯度洗脫時(shí)該3種目標(biāo)物能夠成功分離。通過(guò)對(duì)該流動(dòng)相流速、梯度等條件優(yōu)化，結(jié)果在1.4所述條件下進(jìn)行測(cè)試的實(shí)際樣品中（10份黃色粉末狀中草藥毒品和10份白色粉末狀毒品樣品）目標(biāo)物與相鄰的雜質(zhì)成分色譜峰達(dá)到基線(xiàn)分離，分離度均大于1.5。在190～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描時(shí)，相同濃度曲馬多在210 nm處的吸收（峰面積）為220 nm的一半，地芬諾酯和芬太尼最大吸收均為210 nm，為了方便起見(jiàn)，最終選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。圖2為曲馬多、芬太尼和地芬諾酯的吸收波長(zhǎng)，圖3為黃色粉末狀中草藥毒品、白色粉末狀毒品樣品和混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)甲醇液（0.1 mg/mL）的典型色譜圖。

2.2 檢出限、定量限及線(xiàn)性測(cè)試

配制系列濃度的混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液對(duì)該3種目標(biāo)化合物進(jìn)行檢出限（S/N=3）、定量限（S/N=10）測(cè)試，線(xiàn)性范圍使用2～700 μg/mL濃度范圍進(jìn)行測(cè)試，每個(gè)濃度進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如表1所示，曲馬多的檢出限與定量限分別為0.5、1.0 μg/mL，芬太尼、地芬諾酯的檢出限均為0.2 μg/mL，定量限均為0.5 μg/mL；在2～700 μg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性，R2均大于0.999。

表1 曲馬多、芬太尼、地芬諾酯的線(xiàn)性方程、決定系數(shù)、線(xiàn)性范圍、檢出限和定量限（n=6）Table 1 Linear equations, determination coefficients, linearity ranges, limits of detection (LODs) and limits of quantification(LOQs) for determination of tramadol, fentanyl, diphenoxylate by HPLC-DAD (n=6)

2.3 回收率測(cè)試

回收率測(cè)試采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，并用其結(jié)果評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確性。用建立的方法測(cè)定出典型黃色粉末狀中草藥毒品（S-1）和白色粉末狀毒品（S-43）原始含量，將三種不同濃度（約為S-1和S-43中各成分原始含量的80%、100%和120%）單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液準(zhǔn)確添加到S-1和S-43樣品中，按照1.3樣品前處理后進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)濃度平行6次實(shí)驗(yàn)。按照以下公式計(jì)算回收率：回收率=（測(cè)得量-原始量）/加入量×100%，結(jié)果如表2所示，S-1號(hào)中草藥毒品中曲馬多、芬太尼和地芬諾酯的平均回收率在99.6%～105.4%間，S-43號(hào)白色粉末狀毒品中地芬諾酯的平均回收率為100.2%，所有化合物的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于1.40%，表明該方法準(zhǔn)確性好。

表2 黃色粉末狀中草藥毒品（S-1）和白色粉末狀毒品（S-43）中曲馬多、芬太尼及地芬諾酯的回收率（n=6）Table 2 Recoveries of tramadol, fentanyl and diphenoxylate derived from HPLC-DAD (Yellow powdered herbal medicine: sample 1; white powdered drug: sample 43) (n=6)

2.4 精密度測(cè)試

連續(xù)3日測(cè)定不同濃度混標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作液（濃度為10、100、700 μg/mL）的含量，每日平行測(cè)定6次，用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差評(píng)估其方法的日內(nèi)和日間精密度，結(jié)果如表3所示，該3種目標(biāo)化合物日內(nèi)精密度（RSD%,n=6）在0.64%～1.59%間，日間精密度（RSD%,n=18）在1.19%～2.11%間，表明所建方法精密度良好。

表3 三種不同濃度條件下曲馬多、芬太尼和地芬諾酯的日內(nèi)和日間精密度Table 3 Intra- and inter-day precision of three differentconcentration tramadol, fentanyl and diphenoxylate derived from HPLC-DAD

2.5 重復(fù)性測(cè)試

分別測(cè)定平行制備的黃色粉末狀中草藥毒品（S-1）和白色粉末狀毒品（S-43）溶液，用校準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算其含量，用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示方法的重復(fù)性。結(jié)果如表4所示，S-1和S-43中目標(biāo)化合物的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%,n=6）在0.31%～1.43%間，方法重復(fù)性良好。

表4 黃色粉末狀中草藥毒品(S-1)和白色粉末狀毒品(S-43)中曲馬多、芬太尼和地芬諾酯的重復(fù)性測(cè)試(n=6)Table 4 Repeatability of tramadol, fentanyl and diphenoxylate analyzed with HPLC-DAD (Yellow powdered herbal medicine: sample 1;white powdered drug: sample 43) (n=6)

2.6 穩(wěn)定性測(cè)試

分別于0、2、4、6、8、12、24 h測(cè)定制備的黃色粉末狀中草藥毒品（S-1）和白色粉末狀毒品（S-43）溶液，記錄其峰面積，用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示其穩(wěn)定性。結(jié)果如表5所示，S-1和S-43中目標(biāo)化合物的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD%,n=7）在0.29%～0.87%間，表明制備的樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表5 黃色粉末狀中草藥毒品(S-1)和白色粉末狀毒品(S-43)中曲馬多、芬太尼和地芬諾酯的24 h峰面積穩(wěn)定性Table 5 Peak area stability of tramadol, fentanyl and diphenoxylate determined within 24 hours with HPLC-DAD (Yellow powdered herbal medicine: sample 1; white powdered drug: sample 43)

2.7 實(shí)際樣品測(cè)定

應(yīng)用該方法對(duì)不同顏色膠囊包裝的65份實(shí)際案件樣品進(jìn)行了定量分析，每份樣品平行測(cè)定2次。結(jié)果如表6所示，所有黃色粉末狀中草藥毒品中，藍(lán)-白色、棕-棕色膠囊中：地芬諾酯的含量遠(yuǎn)低于曲馬多和芬太尼的含量，藍(lán)-白色膠囊中曲馬多和芬太尼兩者含量大致相似，棕-棕色膠囊中曲馬多含量均是芬太尼含量的2倍以上；金-金色、黑-黃色膠囊中：地芬諾酯遠(yuǎn)高于曲馬多和芬太尼的含量，且大部分樣品芬太尼是曲馬多含量的2倍以上。所有白色粉末毒品中，紅-白色膠囊中地芬諾酯含量均低于0.19 mg/mg，棕-棕色膠囊中地芬諾酯含量均高于0.36 mg/mg，黑-白、藍(lán)-藍(lán)色膠囊中地芬諾酯含量在0.24～0.30 mg/mg間。

表6 實(shí)際案件檢材中曲馬多、芬太尼及地芬諾酯的定量結(jié)果Table 6 Quantitation of tramadol, fentanyl and diphenoxylate analyzed from an actual forensic case

3 結(jié)論

本文建立了同時(shí)定量分析繳獲毒品及非法添加的中草藥樣品中曲馬多、芬太尼和地芬諾酯含量的HPLC-DAD方法，該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，精密度、穩(wěn)定性良好，回收率高。并將該方法成功應(yīng)用于實(shí)際案件中繳獲的毒品樣品及非法添加的中草藥樣品中曲馬多、芬太尼和地芬諾酯含量的檢驗(yàn)，因毒品樣品種類(lèi)繁多，雜質(zhì)成分差異大，該方法能否適用于其他基質(zhì)的樣品有待日后進(jìn)一步研究。