呂驚晗，辛國斌，孟令宗，石輝麗

（1. 法庭毒物分析公安部重點(diǎn)實驗室，北京 100192；2. 青島市公安局刑警支隊技術(shù)處，山東 青島 266001；3. 臨沂大學(xué)，山東 臨沂 276012）

舒芬太尼（sufentanil）是芬太尼的一種衍生產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)是在芬太尼的4位上引入極性基團(tuán)N-4取代衍生物[1]，鎮(zhèn)痛強(qiáng)度是芬太尼的5～10倍，屬于強(qiáng)效的阿片類鎮(zhèn)痛藥物，其作用對象是μ阿片受體[2]，具有起效快、藥效強(qiáng)、副作用小的特點(diǎn)，因此廣泛用于各科手術(shù)和術(shù)后鎮(zhèn)痛[3]。近年來芬太尼類物質(zhì)已逐漸成為一種新的毒品，濫用或過量致死的案例也時有報道[4]，目前國內(nèi)已有生物檢材中舒芬太尼的氣相色譜-質(zhì)譜法[5]和液相色譜-質(zhì)譜法[6-7]等檢測方法的報道，但均存在需濃縮或衍生化[8]、操作復(fù)雜等問題，且少有同時檢測其代謝產(chǎn)物的報道[9]。為此，本實驗建立了高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測人血中舒芬太尼及代謝物去甲舒芬太尼的分析方法，該方法全面、快速、簡便、準(zhǔn)確、穩(wěn)定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Qtrap5500質(zhì)譜儀配備電噴霧電離源（美國AB公司），LC30A超高壓液相色譜儀（日本島津公司）。

舒芬太尼（0.1 mg/mL甲醇液，純度：99.7%）、去甲舒芬太尼（0.1 mg/mL甲醇液，純度：95%），舒芬太尼-D5（0.1 mg/mL甲醇液，純度：99.8%），均購自美國Cerilliant公司；甲醇（德國Merck）、甲酸（≥98%，上海阿拉?。?、甲酸銨（德國Sigma）均為色譜純；枸櫞酸舒芬太尼注射液（1 mL∶50 μg，宜昌人福藥業(yè)）；空白全血（血站提供）；實驗用水為超純水；渦旋振蕩器、高速離心機(jī)、0.22 μm尼龍微孔濾膜等。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制

取舒芬太尼和去甲舒芬太尼標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0.1 mg/mL）適量，用甲醇配制成質(zhì)量濃度為100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液；取舒芬太尼-D5標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0.1 mg/mL）適量，用甲醇稀釋成質(zhì)量濃度為100 ng/mL的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液。-20 ℃保存，實驗中根據(jù)需要添加或稀釋該儲備液至測定所需的濃度。

1.3 樣本處理

取0.5 mL血樣，加入1 mL乙腈，渦旋振蕩5 min，高速離心（12 000 r/min）5 min，取上清液過0.22 μm濾膜，待分析。

1.4 分析條件

1.4.1 色譜條件

色譜 柱 為Kinetex C18（100 mm×2.1 mm×2.6 μm，美國Phenomenex公司）液相色譜柱，柱溫40 ℃，流速0.3 mL/min，進(jìn)樣量5 μL，流動相A為5 mmol/L甲酸銨和0.1%甲酸的水溶液，流動相B為甲醇，流動相梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution setup for mobile phase

1.4.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），正離子掃描，檢測模式為多反應(yīng)監(jiān)測；碰撞氣為氮?dú)猓粴夂煔猓–UR）為30 psi，噴撞氣（CAD）為Medium，離子化電壓（IS）為5 500 V，溫度（TEM）為550 ℃，噴霧氣（GS1）為60 psi，輔助加熱氣（GS2）為60 psi，碰撞室入口電壓（EP）為10 V，碰撞室出口電壓（CXP）為12 V；定性及定量離子對、去簇電壓（DP）、碰撞電壓（CE）見表2。

表2 定性/定量離子對、去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE）Table 2 Qualitative/quantitative ion pair, de-clustering voltage(DP) and collision energy (CE)

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 專屬性

準(zhǔn)備8份不同人的空白血，取其中1份空白血加混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液及內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，并將其全部按1.3項處理, 在本試驗的條件下進(jìn)行分析，考察分離度及空白血對目標(biāo)物的干擾。提取離子色譜圖見圖1?？梢娛娣姨?、去甲舒芬太尼和內(nèi)標(biāo)物舒芬太尼-D5峰形良好，分離完全，不受血漿內(nèi)源性物質(zhì)干擾，舒芬太尼與舒芬太尼-D5保留時間一致，它們和去甲舒芬太尼的保留時間分別為4.38、3.96 min。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及檢出限

取空白血分別加入混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，配制成0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、15、20 ng/mL 的系列濃度樣本，再加入內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲備液使內(nèi)標(biāo)添加濃度均為2 ng/mL，按1.3項處理后進(jìn)樣。另取空白血加混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，配制成0.2、0.1、0.05、0.02 ng/mL的低濃度混標(biāo)添加樣本，按1.3項處理后進(jìn)樣，考察檢出限。

分析系列濃度的添加樣本，以標(biāo)準(zhǔn)品及其內(nèi)標(biāo)物定量離子峰面積之比作為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)繪圖，繪制內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，經(jīng)“1/x”權(quán)重得到舒芬太尼線性回歸方程為：y=0.566 3x+0.004 34，R2=0.999 84，去甲舒芬太尼線性回歸方程為：y=0.448 74x-0.005 1，R2=0.999 73，線性范圍均為0.1～20 ng/mL。通過分析低濃度混標(biāo)添加樣本，以信噪比（S/N）≥3的添加濃度作為檢出限，信噪比（S/N）≥10的添加濃度作為定量限，測得檢出限為0.05 ng/mL，定量限為0.1 ng/mL。

2.1.3 精密度和準(zhǔn)確度

取空白血，配制濃度分別為0.1 ng/mL（定量下限）、0.2 ng/mL（低濃度）、5 ng/mL（中濃度）、15 ng/mL（高濃度）的標(biāo)準(zhǔn)添加樣本（含2 ng/mL內(nèi)標(biāo)），每個濃度配制6個樣本，在同一天分早中晚分別進(jìn)行提取分析，確定方法日內(nèi)檢測的精密度和準(zhǔn)確度；連續(xù)4 d，分別配制這四個濃度標(biāo)準(zhǔn)添加樣本，確定方法的日間檢測精密度和準(zhǔn)確度，結(jié)果見表3。不難看出，兩種化合物的準(zhǔn)確度均在90%～110%，精密度均≤5%，符合法庭科學(xué)中毒物檢測的要求。

表3 血中舒芬太尼、去甲舒芬太尼精密度和準(zhǔn)確度測試結(jié)果Table 3 Precision and accuracy of sufentanil and norsufentanil in blood

2.1.4 基質(zhì)效應(yīng)和回收率

取空白血，選擇0.1、0.2、5、15 ng/mL四個水平添加濃度，分別在樣本處理前添加混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液和2 ng/mL內(nèi)標(biāo)（RES），樣本按1.3項處理后添加混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液及2 ng/mL內(nèi)標(biāo)于過濾膜后的上清液中（RPES），在甲醇中直接添加混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液和2 ng/mL內(nèi)標(biāo)（RNES），分別測試3種處理條件下的目標(biāo)物峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，按照以下公式計算樣本前處理回收率以及基質(zhì)干擾率。

回收率%=(RES/RPES)×100%

生物基質(zhì)影響率%=［(RPES/RNES)-1]×100%

結(jié)果如表4所示，計算樣本前處理回收率在90%～120%間，基質(zhì)干擾在-10%～5%之間。方法的回收率及基質(zhì)干擾均滿足要求。

表4 血中舒芬太尼和去甲舒芬太尼回收率及生物基質(zhì)影響率測試結(jié)果Table 4 Recovery rate (%) of sufentanil and norsufentanil in blood and the effect (%) of biological matrix

2.1.5 穩(wěn)定性

取3份空白血液，配制濃度分別為0.2、4.5、15 ng/mL的舒芬太尼標(biāo)準(zhǔn)添加樣本。將血樣分別置于-20 ℃（冰箱冷凍）、0 ℃（冰箱冷藏）、20 ℃（室溫）三種溫度環(huán)境中，在0、1、4、7、11、15、25、35、50、70、90 d分別添加2 ng/mL內(nèi)標(biāo)后進(jìn)行檢測。

在-20、0、20 ℃條件下質(zhì)量濃度為0.2、4.5、15 ng/mL的舒芬太尼血樣隨時間均基本呈下降趨勢（見圖2），0.2 ng/mL（低濃度）、4.5 ng/mL（中等濃度）在三種溫度條件下保存35 d無顯著區(qū)別且含量最低下降至初始質(zhì)量濃度的81.7%，而15 ng/mL（高濃度）在-20、0、20 ℃條件下，含量下降至初始質(zhì)量濃度的80%以上的時間分別為25、11、7 d。綜合考慮，檢材血液應(yīng)于7 d內(nèi)及時送檢，盡量冷凍或冷藏保存。

2.1.6 動物實驗

兩只雄性小鼠(每只約80 g)腹股溝處皮下注射50 μg/mL枸櫞酸舒芬太尼注射液約160 μL（即注射劑量為0.1 mg/kg），于給藥后20 min、1 h分別通過內(nèi)眥靜脈采血及2 h斷頸取血各0.5 mL。按1.3方法處理、檢測。超出定量線性范圍，空白鼠血稀釋后再次分析。

經(jīng)計算得出小鼠血液中舒芬太尼及去甲舒芬太尼平均質(zhì)量濃度結(jié)果見表5。

表5 小鼠給藥后不同時間節(jié)點(diǎn)的測試結(jié)果Table 5 Sufentanil and norsufentanil tested at different time junctures from mice after administration of the two drugs

2.2 討論

舒芬太尼主要是通過肝臟代謝，據(jù)報道在肝微粒體內(nèi)由單加氧酶CYP3A4通過N-脫烷基化、O-去甲基化和羥化三種途徑而失活[10]，然后隨尿液和膽汁排出，約1%以原形經(jīng)尿排出，N-脫烷基化而形成的代謝產(chǎn)物為去甲舒芬太尼（見圖3），只有該代謝物具有藥理活性，約為舒芬太尼的10%，與芬太尼相當(dāng)[11]，鑒于其特殊的藥代學(xué)特性，代謝物亦能產(chǎn)生殘余效應(yīng)，從而達(dá)到很好的術(shù)后鎮(zhèn)痛藥物效果，因此本實驗重點(diǎn)研究代謝物為去甲舒芬太尼的機(jī)制與測定。

通過動物實驗，不難發(fā)現(xiàn)舒芬太尼體內(nèi)代謝速度較快，20 min后舒芬太尼迅速衰減，2 h時含量極低，這符合舒芬太尼再分布半衰期為15 min左右、清除半衰期為150 min左右的文獻(xiàn)報道[12]。

3 結(jié)論

近年來，國內(nèi)外對血中舒芬太尼的分析逐步向靈敏度高、檢出限低、重現(xiàn)性好、前處理簡便等方向發(fā)展，這對建立人血中舒芬太尼及代謝產(chǎn)物的定性定量檢測方法有較強(qiáng)的指導(dǎo)意義。本方法中，通過在人血中添加舒芬太尼和代謝物去甲舒芬太尼，使用舒芬太尼-D5作為內(nèi)標(biāo)，無需衍生化；采用乙腈沉淀蛋白的前處理方法直接進(jìn)樣分析，操作簡單、快速，可避免因操作繁瑣引起的誤差；通過反向C18色譜柱分離目標(biāo)物，電噴霧串聯(lián)四級桿質(zhì)譜進(jìn)行檢測，選取兩個離子對定性，準(zhǔn)確度好。經(jīng)驗證該方法特異性、準(zhǔn)確度、精密度、靈敏度、線性、基質(zhì)效應(yīng)和回收率均滿足毒物動力學(xué)和毒品檢驗的要求，且建議該檢材血液應(yīng)低溫保存并于7 d內(nèi)及時送檢，4.5 ng/mL血樣在20 ℃條件下40 d后檢測結(jié)果升高、70 d后下降，其變化較為復(fù)雜，有待于進(jìn)一步研究。本方法前處理簡便、可標(biāo)準(zhǔn)化，可用于法庭科學(xué)中舒芬太尼濫用案件的分析檢測。