趙苑余，陳 江，溫曉靜，彭光宇，王國(guó)民

（重慶海關(guān)技術(shù)中心，國(guó)家危險(xiǎn)化學(xué)品檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400020）

芬太尼類物質(zhì)是人工合成的強(qiáng)效阿片類鎮(zhèn)痛劑，其作用是嗎啡的50～100倍[1]。由于芬太尼特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)，不法分子通過(guò)結(jié)構(gòu)修飾和構(gòu)效關(guān)系研究，很容易得到一系列“策劃藥”，導(dǎo)致非法芬太尼濫用形勢(shì)嚴(yán)峻[2-4]。2019年5月，我國(guó)對(duì)芬太尼實(shí)行了整類列管，這意味著我國(guó)從“發(fā)現(xiàn)一種、列管一種”的模式，轉(zhuǎn)變?yōu)椤邦A(yù)防在前、劃清禁區(qū)”的“提前管”模式[5]。

芬太尼類物質(zhì)的檢測(cè)方法主要有免疫分析法[6]、拉曼光譜法[7]、高效液相色譜法（HPLC）[8]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS/MS）[9-11]等，研究主要側(cè)重于生物基質(zhì)中微量芬太尼的定量檢測(cè)，并且依賴于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來(lái)定性確證結(jié)構(gòu)。由于商業(yè)化譜庫(kù)的收錄及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制跟不上芬太尼類物質(zhì)泛濫的趨勢(shì)，使得新型芬太尼類毒品的檢測(cè)具有滯后性。開(kāi)發(fā)不依賴標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的篩查方法用于新型芬太尼類物質(zhì)的稽查，QE高分辨質(zhì)譜分析技術(shù)展現(xiàn)了其優(yōu)勢(shì)[12]。QE高分辨質(zhì)譜集合了軌道阱的高分辨率、四極桿的高選擇性并配備高能碰撞解離模式（HCD），能夠獲得未知樣品的精確質(zhì)量數(shù)和碎片離子信息，可對(duì)新型芬太尼類毒品進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)的鑒定[13-15]。已有文獻(xiàn)采用超高效液相色譜-四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLCQTOF-MS）和氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）[16-18]對(duì)芬太尼類質(zhì)譜裂解規(guī)律進(jìn)行研究，但基于UPLC-Q Exactive液質(zhì)聯(lián)用法方面的研究還需進(jìn)一步完善。

本文為助力海關(guān)打擊毒品犯罪，建立了針對(duì)固體疑似物、未知液體兩種基質(zhì)中25種芬太尼類物質(zhì)及2種前體化合物的UPLC-Q Exactive四極桿-軌道阱液質(zhì)聯(lián)用法，并總結(jié)芬太尼類物質(zhì)的質(zhì)譜裂解規(guī)律及特征離子碎片，為推導(dǎo)鑒定已知母核的新型芬太尼毒品可能的化學(xué)結(jié)構(gòu)提供參考，為整類列管芬太尼類物質(zhì)提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Q Exactive質(zhì)譜儀（美國(guó)ThermoFisher），Dionex UltiMate 3000超高效液相色譜儀（美國(guó)Dionex），Vortex Genius 3渦旋振蕩儀（德國(guó)IKA）、離心機(jī)（德國(guó)SIGMA3-30K）、N-EVAP-116氮?dú)獯蹈蓾饪s儀（美國(guó) Organomation Associates）；Sartorius BS210S電子天平（德國(guó)Sartorius）、Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore）。

甲醇、乙腈均為色譜純（美國(guó)Tedia/德國(guó)Merck）；甲酸為色譜純（美國(guó)Anaqua）；乙酸銨為HPLC級(jí)（德國(guó)Thermo Fisher Scientific）；氯化鈉為分析純（川東化工公司）。N-苯乙基-4-哌啶酮（NPP）、瑞芬太尼、奧芬太尼、β-羥基硫代芬太尼、乙酰-α-甲基芬太尼、β-羥基芬太尼、丙烯酰芬太尼、β-羥基-3-甲基芬太尼、3-甲基硫代芬太尼、卡芬太尼、阿芬太尼、cis-3-甲基芬太尼、異丁酰芬太尼、舒芬太尼、戊酰芬太尼濃度為100 μg/mL，α-甲基芬太尼濃度為10 μg/mL，以上購(gòu)自天津阿爾塔科技有限公司；乙酰芬太尼濃度為50 μg/mL、芬太尼濃度為1 000 μg/mL，去丙酰芬太尼（4-ANPP）、呋喃芬太尼、對(duì)氟芬太尼、丁酰芬太尼、對(duì)氟異丁酰芬太尼、對(duì)氟丁酰芬太尼濃度均為100 μg/mL，購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich；四氫呋喃芬太尼、硫代芬太尼、α-甲基硫代芬太尼濃度為100 μg/mL，購(gòu)自上海市刑事科學(xué)技術(shù)研究院。以上化合物純度均大于95%。

普魯卡因泛酸鈣（上海新亞藥業(yè)閔行有限公司）、復(fù)方對(duì)乙酰氨基酚片（太極集團(tuán)西南藥業(yè)股份有限公司）、喹啉（北京曼哈格生物科技有限公司）、肌醇（美國(guó) CFW Labs）、甘露醇（成都市科隆化學(xué)品有限公司）、乳糖（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 儀器條件

1.2.1 色譜條件

色 譜 柱：Hypersil GOLD C18色 譜 柱（150 mm×2.1 mm×1.8 μm），柱溫 30 ℃，流速 0.2 mL/min，進(jìn)樣量2 μL。A相為2 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸水溶液，B相為甲醇。梯度洗脫程序：0～12 min（30%～45% B），12～16 min（45%～55% B），16～17 min（55%B），17～17.5 min（55%～95% B），17.5～20 min（95% B），20～20.5 min（95%～30% B），20.5～25 min（30% B）。

1.2.2 質(zhì)譜條件

離子源為HESI源，正離子模式，離子源溫度320 ℃，噴霧電壓3.0 kV，鞘氣流速40 arb，輔助氣流速10 arb。掃描模式Full MS/dd-MS2，全掃描分辨率70 000，AGC設(shè)置為3×106，最大注入時(shí)間為100 ms，掃描范圍m/z150～450 ；dd-MS2分辨率 17 500，AGC設(shè)置為1×106，最大注入時(shí)間為50 ms。每一個(gè)化合物的歸一化碰撞能（NCE）見(jiàn)表1。

表1 27種化合物的分子式、保留時(shí)間、精確質(zhì)量數(shù)偏差及歸一化碰撞能Table 1 27 fentanyl-kind compounds and their respective formula, retention time, mass accuracy, and normalized collision energy

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液制備

取27種標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用甲醇稀釋為1 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18 ℃保存?zhèn)溆谩Ｈ?1 μg/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液適量，采用逐級(jí)稀釋法，以30%甲醇為稀釋劑，配制0.05～100 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 樣品溶液制備

固體疑似物：將未知樣品研磨均勻，精密稱取適量，以甲醇為溶劑，配制成 1 mg/mL溶液，超聲5 min，5 000 r/min離心 5 min，取上清液經(jīng)30%甲醇水稀釋，配制成1 μg/mL的待測(cè)溶液，過(guò)0.22 μm尼龍濾膜后供 UPLC-QE高分辨質(zhì)譜分析。

液體疑似物：取未知液體，精密移取1.0 mL，加入1.0 mL乙腈萃取，渦旋30 s，超聲5 min，加入過(guò)量氯化鈉渦旋至溶解飽和，取上清液至離心管中，重復(fù)提取1次，合并提取液，于30 ℃水浴中氮吹至干，用1.0 mL 30%甲醇水復(fù)溶，過(guò)0.22 μm尼龍濾膜后供 UPLC-QE高分辨質(zhì)譜分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

為確保同分異構(gòu)體實(shí)現(xiàn)分離，以10 ng/mL的27種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析，考察流動(dòng)相種類對(duì)同分異構(gòu)體的分離效果。結(jié)果表明，甲醇-2 mmol/L乙酸銨（含0.1%甲酸）為流動(dòng)相時(shí)，同分異構(gòu)體（異丁酰芬太尼/丁酰芬太尼；對(duì)氟異丁酰芬太尼/對(duì)氟丁酰芬太尼）的分離度優(yōu)于乙腈-水體系。為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)基線分離，考察了不同的流動(dòng)相比例，最終實(shí)現(xiàn)27種化合物的有效分離，提取離子色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

25種芬太尼類似物及兩種前體化合物均具有叔胺結(jié)構(gòu)，這類結(jié)構(gòu)的化合物在溶液中易獲得質(zhì)子形成[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰，本文選擇正離子（ESI+）模式，以濃度為 100 ng/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液為進(jìn)樣，對(duì)歸一化碰撞能（NCE電壓）進(jìn)行優(yōu)化，對(duì)比了20、25、30、35、40、50 eV系列碰撞電壓，確保母離子可見(jiàn)、碎片信息豐富、干擾小，最終確定最優(yōu)的歸一化碰撞能，獲得二級(jí)高分辨質(zhì)譜（見(jiàn)圖2、3）。分析27個(gè)化合物的理論質(zhì)量數(shù)和實(shí)測(cè)質(zhì)量數(shù)，其精確質(zhì)量數(shù)偏差均小于5 ppm，滿足標(biāo)準(zhǔn)要求[19]。

2.3 線性關(guān)系及檢測(cè)限定量限

在優(yōu)化后的色譜-質(zhì)譜分析檢測(cè)條件下，對(duì)1.3方法配制的1 μg/mL的儲(chǔ)備液進(jìn)行逐級(jí)稀釋，配制成濃度為0.5、1、5、10、20、50、100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液，以各組分化合物的濃度為橫坐標(biāo)，母離子峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合線性回歸方程，詳見(jiàn)表2。

結(jié)果顯示，各化合物的線性相關(guān)系數(shù)（R2）均大于0.995，濃度與定量離子呈良好的線性關(guān)系。以峰高響應(yīng)值在1×104～3×104對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度確定為儀器檢測(cè)限，以峰高響應(yīng)值高于3×104的濃度確定為各化合物的儀器定量限，結(jié)果列于表2中。

表2 27種芬太尼類化合物的線性方程、決定系數(shù)、檢測(cè)限、定量限Table 2 Regression equations, determination coefficients (R2), LODs and LOQs of 27 fentanyl-kind compounds

2.4 回收率實(shí)驗(yàn)

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，緝獲的芬太尼類毒品中，常常填充了普魯卡因、喹啉、甘露醇、對(duì)乙酰氨基酚、咖啡因、乳糖、肌醇等[20]。選用普魯卡因泛酸鈣、喹啉、甘露醇、復(fù)方對(duì)乙酰氨基酚片（含咖啡因）、乳糖、肌醇等按一定比例混合后，作為固體驗(yàn)證基質(zhì)。

上述化合物配制成濃度為100 ng/mL的混合水溶液，作為液體驗(yàn)證基質(zhì)。通過(guò)測(cè)定各目標(biāo)化合物線性范圍內(nèi)低、中、高三個(gè)濃度水平的加標(biāo)樣品的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)考查方法的準(zhǔn)確性。

按1.4方法，配制加標(biāo)樣品，加標(biāo)水平為0.5、5、30 μg/kg（μg/L）。每個(gè)濃度平行配制 6 份，依據(jù)測(cè)量的峰面積和線性方程，計(jì)算每個(gè)化合物的測(cè)量濃度，考查方法的準(zhǔn)確性（用回收率表示）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，3個(gè)濃度的芬太尼類化合物回收率在77.03%～115.07%之間，RSD均小于15%，表明上述基質(zhì)并未對(duì)芬太尼類物質(zhì)的檢測(cè)構(gòu)成基質(zhì)挑戰(zhàn)，方法的準(zhǔn)確度良好，滿足分析鑒定的要求（見(jiàn)表3）。

表3 固體和液體基質(zhì)中添加27種芬太尼類化合物的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 3 Recoveries and RSDs of 27 fentanyl-kind compounds that were spiked into solid and liquid matrices (n=6)

續(xù)表3

2.5 質(zhì)譜裂解規(guī)律

“芬太尼類物質(zhì)”是指化學(xué)結(jié)構(gòu)與芬太尼（N-[1-(2-苯乙基)-4-哌啶基]-N-苯基丙酰胺）類似，使用其他酰基替代丙?；?，苯乙基被其他任意非氫原子的基團(tuán)取代，哌啶環(huán)上有烷基、烯基、烷氧基、酯基、醚基、羥基、鹵素、鹵代烷基、氨基及硝基等取代基團(tuán)，用單環(huán)芳香基團(tuán)取代與氮原子直接相連的苯基而衍生出來(lái)的一系列物質(zhì)[5]。這幾處的變化，可以從芬太尼類物質(zhì)的裂解規(guī)律及碎片離子中解讀出來(lái)，從而可實(shí)現(xiàn)不依賴標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來(lái)判斷新型芬太尼類物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

芬太尼類物質(zhì)主要的裂解途徑為：1）酰胺鍵裂解形成碎片離子a和j。2）哌啶環(huán)γ碳上的H（γ-H）重排到羰基氧上，發(fā)生麥?zhǔn)现嘏牛∕cLafferty rearrangement，McL）[21]，β-鍵斷裂，形成碎片離子d（基峰）和碎片離子c。3）碎片離子d中氫原子發(fā)生遷移形成環(huán)內(nèi)雙鍵后，進(jìn)一步引發(fā)RDA裂解[21]，以及哌啶環(huán)的裂解，形成b、e、g、f等特征離子。4）哌啶環(huán)與苯乙基部分發(fā)生N-C開(kāi)裂，形成碎片離子h和i。芬太尼類物質(zhì)可能的裂解途徑見(jiàn)圖4～6。

芬太尼類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)解析運(yùn)用氮規(guī)則，即當(dāng)化合物含奇數(shù)個(gè)氮原子時(shí)，其[M+H]峰的質(zhì)量數(shù)為偶數(shù)，反之當(dāng)不含或含偶數(shù)個(gè)氮原子時(shí)，其質(zhì)量數(shù)為奇數(shù)，可實(shí)現(xiàn)快速結(jié)構(gòu)解析。

3 結(jié)論

本文建立了針對(duì)固體疑似物、未知液體兩種基質(zhì)中25種芬太尼類物質(zhì)及2種前體化合物的UPLC-Q Exactive定性定量檢測(cè)方法。該方法操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)短、靈敏度高、準(zhǔn)確度好。建立的芬太尼類物質(zhì)的二級(jí)質(zhì)譜譜庫(kù)，可實(shí)現(xiàn)27種化合物的快速定性篩查。通過(guò)分析芬太尼類物質(zhì)的質(zhì)譜裂解規(guī)律及特征離子碎片，可在不依賴標(biāo)準(zhǔn)品的前提下，推導(dǎo)已知母核的新型芬太尼類毒品的化學(xué)結(jié)構(gòu)，并快速判斷是否屬于受管制藥品。新精神活性物質(zhì)的濫用日益增多，利用該技術(shù)將潛在的新精神活性物質(zhì)扼殺在萌芽中，將有助于徹底打擊毒品的泛濫，保障人民的健康安全。

4 致謝

感謝重慶海關(guān)緝私局兩路寸灘海關(guān)緝私分局在芬太尼類標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)買中提供的幫助。