丁婷婷，曾楚雄，胡麗娜，余明華

(上海市浦東醫(yī)院，復(fù)旦大學(xué)附屬浦東醫(yī)院腫瘤科，上海 201399)

盡管結(jié)直腸癌的篩查、診斷和根治性切除術(shù)目前已取得了進(jìn)展，但其仍是全球范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[1]。大約20%～25%新確診的結(jié)直腸癌患者存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，且其中只有一小部分可以接受根治性手術(shù)[2]。此外，大約50%的結(jié)直腸癌患者具有可切除指征，其中多數(shù)會在切除后2年內(nèi)復(fù)發(fā)[3]。在過去的幾十年里，人們不斷地對腫瘤細(xì)胞的基因組和生物學(xué)變化進(jìn)行研究，識別具有不同預(yù)后和治療反應(yīng)的患者亞群，并尋找潛在的藥物治療靶點(diǎn)[4]。然而，腫瘤的惡性表型不僅由腫瘤細(xì)胞的內(nèi)在活性決定，還由腫瘤相關(guān)微環(huán)境中募集和激活的免疫細(xì)胞決定。

腫瘤浸潤性免疫細(xì)胞(tumor-infiltrating immune cells，TIICs)的功能和組成會根據(jù)宿主的免疫狀態(tài)發(fā)生微妙的變化，可被藥物有效靶向并與臨床預(yù)后相關(guān)[5]。相關(guān)機(jī)制研究證實(shí)，在TIICs與腫瘤基質(zhì)中的惡性細(xì)胞之間存在著復(fù)雜的相互作用，這種相互作用具有顯著的預(yù)后相關(guān)性，免疫系統(tǒng)可通過支持宿主防御或腫瘤進(jìn)展而發(fā)揮雙重作用[6]。然而，即使在具有相同實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的研究中，某些TIICs亞群的預(yù)后價(jià)值也不總是保持一致，比如白細(xì)胞介素-17(interleukin-17，IL-17)已被證明在腫瘤的進(jìn)展中具有雙重作用，IL-17+T細(xì)胞的功能和預(yù)后價(jià)值在不同的研究中相互矛盾[7-8]。上述有矛盾結(jié)果的研究均局限于免疫反應(yīng)觀點(diǎn)，其基于免疫組織化學(xué)方法分析評估TIICs，僅依賴于單個(gè)標(biāo)記識別一個(gè)特定的TIICs亞群，但因?yàn)樵S多標(biāo)記蛋白可在不同細(xì)胞類型中表達(dá)，該方法可能不夠全面。

CIBERSORT是一種基于基因表達(dá)的反卷積算法，其被用于評估一組基因相對于樣本中所有其他基因的相對表達(dá)變化[9-10]，可用于確定TIICs的多樣性。由于CIBERSORT的優(yōu)越性能，其在細(xì)胞異質(zhì)性研究中的應(yīng)用越來越受到關(guān)注。因此，本研究應(yīng)用CIBERSORT來量化參與結(jié)直腸癌免疫反應(yīng)的22個(gè)TIICs亞群，以研究其與5年生存率之間的關(guān)系，希望能為結(jié)直腸癌TIICs異質(zhì)性、腫瘤分子亞型及疾病進(jìn)展之間的復(fù)雜關(guān)系提供一些信息。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載與數(shù)據(jù)分析

本研究利用美國國家生物信息技術(shù)中心TCGA數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov/)，檢索條件設(shè)定如下：(1)案例選項(xiàng)：基本位點(diǎn)為“結(jié)直腸癌(設(shè)定病理分型為腺癌)”，其余條目默認(rèn)系統(tǒng)設(shè)定；(2)文件選項(xiàng)：數(shù)據(jù)分類為“轉(zhuǎn)錄組分析”，數(shù)據(jù)類型為“基因表達(dá)定量”，實(shí)驗(yàn)策略為“轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)”，工作流程類型為“HTSeq計(jì)數(shù)”，其余條目默認(rèn)系統(tǒng)設(shè)定。下載截至2020年7月1日上傳的原發(fā)性結(jié)直腸癌患者基因表達(dá)譜和臨床信息，下載得出的腫瘤組織和配對的正常組織進(jìn)行后續(xù)差異分析。

1.2 TIICs與臨床特征的關(guān)系分析

通過CIBERSORT算法預(yù)測結(jié)直腸癌組織及正常對照組織基因表達(dá)譜中22種TIICs基因的表達(dá)水平來確定其基因組成，進(jìn)行基因表達(dá)分析，再將基因的表達(dá)轉(zhuǎn)化為免疫細(xì)胞水平，得出腫瘤組織和正常組織樣本中TIICs的組成和比例，計(jì)算每個(gè)樣本的標(biāo)準(zhǔn)差和CIBERSORTP值以提高CIBERSORT的準(zhǔn)確性，并篩選出P<0.05的樣本進(jìn)行臨床分析，將過濾后的免疫細(xì)胞矩陣與臨床數(shù)據(jù)合并，探討免疫細(xì)胞與臨床特征之間的關(guān)系。最后篩選差異浸潤的免疫細(xì)胞，計(jì)算免疫細(xì)胞水平與患者生存的相關(guān)性，并繪制生存曲線圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

所有分析均通過R軟件(3.5.2版)進(jìn)行，符合正態(tài)分布的連續(xù)變量用均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差描述，非正態(tài)分布資料用中位數(shù)(P25，P75)描述，分類變量用頻數(shù)和百分?jǐn)?shù)表示。將CIBERSORTP<0.05的樣本納入下一步分析。使用Pearson相關(guān)分析得出不同免疫細(xì)胞亞型之間的相關(guān)性，通過corrplot R包評估不同類型免疫細(xì)胞之間的關(guān)系，生存R包用于執(zhí)行Kaplan-Meier曲線， 應(yīng)用Wilcoxon檢驗(yàn)分析免疫細(xì)胞和臨床特征之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌患者臨床資料

從TCGA數(shù)據(jù)庫共下載符合設(shè)定條件的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)514個(gè)(包括473例結(jié)直腸癌樣本和41個(gè)正常對照樣本)，其中結(jié)直腸癌患者中位年齡69(58，77)歲，其他基本臨床資料見表1。

2.2 結(jié)直腸癌組織TIICs的分布

共有6個(gè)正常樣本和118個(gè)腫瘤樣本符合CIBERSORTP<0.05。使用CIBERSORT對正常組織與結(jié)直腸癌組織中22個(gè)TIICs亞群進(jìn)行分析，繪制條形圖，以不同顏色顯示每個(gè)各組織樣本中免疫細(xì)胞的比例，條形的長度表示該細(xì)胞水平。從圖1可以看出，結(jié)直腸癌組織中M0、M1和M2巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的比例相對較高，約占22個(gè)TIICs亞群的60%；相反，B細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的比例相對較低，約占10%。我們推斷 TIICs比例的差異可能是個(gè)體差異的基本特征并具有預(yù)后價(jià)值。

進(jìn)一步繪制出的矩陣圖提示，濾泡輔助性T細(xì)胞和M1巨噬細(xì)胞(r=0.53)、單核細(xì)胞和靜息肥大細(xì)胞(r=0.46)、靜息自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞等呈顯著正相關(guān)，CD4+T細(xì)胞和M0巨噬細(xì)胞(r=-0.53)、M1巨噬細(xì)胞和M0巨噬細(xì)胞(r=-0.46)、CD4+T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(r=-0.42)等呈顯著負(fù)相關(guān)(圖2)。

表1 TCGA數(shù)據(jù)庫中結(jié)直腸癌患者一般臨床特征Table 1 General clinical characteristics of colorectal cancer patients in the TCGA database

2.3 結(jié)直腸癌組織TIICs比例與臨床特征的關(guān)系

部分TIICs的比例與患者的TNM分期及臨床分級顯著相關(guān)：T1～T2期患者靜息NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞水平高于T3～T4期(P<0.05)，T3～T4期患者漿細(xì)胞比例高于T1～T2期(P<0.05)；活化樹突狀細(xì)胞在N0期的比例高于N1～N2期(P<0.05)；M0期患者M(jìn)1巨噬細(xì)胞水平高于M1期患者，而M1期患者激活的肥大細(xì)胞水平更高(P<0.05)。此外，M1巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞在臨床分級Ⅰ和Ⅱ級患者中均處于高表達(dá)水平(P<0.05，圖3)。

2.4 不同TIICs表達(dá)程度與患者5年生存率之間的關(guān)系

Kaplan-Meier曲線顯示，結(jié)直腸癌患者的預(yù)后部分受個(gè)體TIICs亞型差異的影響：活化的樹突狀細(xì)胞表達(dá)越高，結(jié)直腸癌患者的5年生存率越高；但幼稚的CD4+T細(xì)胞則相反，其表達(dá)越高，患者的5年生存率越低(P<0.05，圖4)。這意味著TIICs特征可以為治療策略提供更多的預(yù)后價(jià)值。

3 討論

除了惡性腫瘤細(xì)胞，腫瘤組織也包括免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞，以及細(xì)胞因子、趨化因子、生長因子等多種分子[11]。這些成分及其復(fù)雜的相互作用形成了腫瘤相關(guān)微環(huán)境，該微環(huán)境甚至可以對侵襲性惡性腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用，但在其進(jìn)展過程中，腫瘤細(xì)胞可能會繞過這些抑制信號，而是利用免疫細(xì)胞和其他細(xì)胞為自己謀取利益，從而繼續(xù)生長、侵襲、轉(zhuǎn)移[12-14]。在腫瘤微環(huán)境中募集和激活的主要宿主細(xì)胞是各種免疫細(xì)胞，眾所周知，免疫系統(tǒng)同時(shí)具有促癌和抑癌作用，腫瘤基質(zhì)中的免疫細(xì)胞和惡性腫瘤細(xì)胞之間實(shí)際上存在著一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程，并具有顯著的預(yù)后相關(guān)性[15]。在結(jié)直腸癌中，不同類型免疫細(xì)胞的分布、組織定位、細(xì)胞類型均與腫瘤進(jìn)展顯著相關(guān)。與TIICs高浸潤組相比，低浸潤組臨床Ⅲ期結(jié)直腸癌患者5年生存率和無病生存期(disease-free survival，DFS)顯著降低[16]。此外，直腸癌活檢中TIICs的高浸潤與改善腫瘤對術(shù)前放化療的反應(yīng)相關(guān)，并與延長的DFS和總生存期(overall survival，OS)顯著相關(guān)。這些結(jié)果提供的證據(jù)表明，TIICs高浸潤不僅是一個(gè)有利的預(yù)后因素，而且還可以預(yù)測化療的結(jié)果。

作為一種免疫敏感性腫瘤，結(jié)直腸癌被異質(zhì)性的TIICs集合浸潤，包括T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞，此外，結(jié)直腸癌內(nèi)TIICs的類型、密度和位置對預(yù)后的判斷有很大價(jià)值[17]。例如，Klintrup等[18]評估了直腸癌患者的整體炎癥細(xì)胞反應(yīng)及各種TIICs密度，其免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，浸潤邊緣的炎癥反應(yīng)是OS和DFS的重要預(yù)測因子。此外，成熟T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和記憶T細(xì)胞通?？沙霈F(xiàn)在預(yù)后良好的結(jié)直腸癌患者TIICs亞群中，而免疫抑制性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞則與結(jié)直腸癌的預(yù)后不良相關(guān)[19]。最近的幾項(xiàng)研究甚至指出，與目前用于結(jié)直腸癌分期的組織病理學(xué)方法相比，免疫學(xué)數(shù)據(jù)(腫瘤樣本中免疫細(xì)胞的類型、密度和位置)可以更好地預(yù)測患者的存活期[20]。

Different colors represent different immune cells, and the length of the bars in the bar graph represents the level of immune cell populations.圖1 結(jié)直腸癌和正常組織樣本中免疫細(xì)胞比例Figure 1 The proportion of immune cells in each colorectal cancer and normal tissue sample

Some immune cells were negatively related, represented in blue, and others were positively related, represented in red. The darker the colour, the higher the correlation was.圖2 22種TIICs比例的相關(guān)矩陣Figure 2 Correlation matrix for all 22 TIICs proportions

圖3 TIICs與結(jié)直腸癌TNM分期和臨床分級的關(guān)系Figure 3 Relationship between TIICs and TNM stage and clinical stage of colorectal cancer

A, activated dendritic cells; B, na?ve CD4+T cells.圖4 與5年生存率顯著相關(guān)的特定免疫細(xì)胞群的生存曲線Figure 4 Survival curves of specific immune cell populations with significantly correlated five-year survival rate

本研究應(yīng)用CIBERSORT評估了結(jié)直腸癌及正常組織的免疫細(xì)胞浸潤模式，結(jié)果顯示結(jié)直腸癌組織中浸潤水平較高的免疫細(xì)胞類型為B細(xì)胞、漿細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、NK細(xì)胞、M0巨噬細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞、活化肥大細(xì)胞等，并發(fā)現(xiàn)活化的樹突狀細(xì)胞與結(jié)直腸癌患者的5年總生存率正相關(guān)。樹突狀細(xì)胞是體內(nèi)功能最強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞，在機(jī)體的抗腫瘤免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用。體內(nèi)未成熟樹突狀細(xì)胞在攝取外來抗原后轉(zhuǎn)化成熟，通過主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC) Ⅰ和Ⅱ分別與CD8+T細(xì)胞和CD4+T細(xì)胞相互作用，誘發(fā)免疫反應(yīng)[21]。有研究發(fā)現(xiàn)，相比藥物治療，肝癌患者在術(shù)后接受樹突狀細(xì)胞疫苗以及活化的T細(xì)胞治療，患者的OS明顯延長，以其為基礎(chǔ)的腫瘤免疫治療將有可能成為最有效的療法之一[22]。

本研究結(jié)果顯示，幼稚CD4+T細(xì)胞是結(jié)直腸癌中浸潤比例相對較高的免疫細(xì)胞，其與結(jié)直腸癌患者5年生存率呈負(fù)相關(guān)。有研究證實(shí)，機(jī)體抗腫瘤的免疫效應(yīng)主要為T細(xì)胞介導(dǎo)的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)[23]。相較于正常組織，結(jié)直腸癌組織中幼稚CD4+T細(xì)胞數(shù)量明顯減少。一方面，當(dāng)幼稚CD4+T細(xì)胞減少后，誘導(dǎo)針對腫瘤的免疫應(yīng)答減弱，利于腫瘤的生長；另一方面，腫瘤細(xì)胞通過抑制記憶性T淋巴細(xì)胞的表達(dá)，逃避機(jī)體的監(jiān)視，利于腫瘤細(xì)胞發(fā)生浸潤及轉(zhuǎn)移[24]。

盡管本研究已經(jīng)用統(tǒng)計(jì)方法來消除隊(duì)列偏差，但這些數(shù)據(jù)的異質(zhì)性仍然在一定程度上阻礙了可重復(fù)性。由于本研究選擇的病例數(shù)量有限，在對結(jié)直腸癌患者進(jìn)行生存分析時(shí)有一定的局限性。隨著數(shù)據(jù)庫的完善，可以進(jìn)一步增加樣本量并延長隨訪時(shí)間，以更準(zhǔn)確地評估預(yù)后。本研究對結(jié)直腸癌患者TIICs亞群的分析揭示了其與臨床結(jié)果的重要關(guān)聯(lián)，這些關(guān)聯(lián)將有助于識別可能從化療中受益的患者，并預(yù)測新藥的可能靶點(diǎn)。將可靠的反卷積算法與大規(guī)?；蚪M數(shù)據(jù)相結(jié)合，能進(jìn)一步揭示構(gòu)成結(jié)直腸癌腫瘤微環(huán)境的非腫瘤細(xì)胞的臨床和生物學(xué)意義。探索免疫細(xì)胞指標(biāo)的異質(zhì)性對于結(jié)直腸癌預(yù)后預(yù)測乃至未來的個(gè)體化治療勢在必行。