蘇晨露，艾連中，吳 艷，賴鳳羲,*，王 溢，張 匯，宋子波

（1.上海理工大學(xué)健康科學(xué)與工程學(xué)院，上海食品微生物工程技術(shù)研究中心，上海 200093；2.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；3.云南貓哆哩集團食品有限責(zé)任公司，云南 玉溪 653100）

植物多酚為茶飲料、功能性飲料及草藥飲料中常見的活性化合物[1]，主要有沒食子酸、(＋)-兒茶素（(＋)-catechin，CN）、黃酮類、花青素、以及相關(guān)的酯化物和聚合體，例如表兒茶素（epicatechin，EC）、沒食子酸糖苷、表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）和縮合單寧（亦稱原花青素）等[2]，賦予功能性飲料優(yōu)良的抗氧化、抗發(fā)炎、預(yù)防腫瘤、降血脂、降血糖及抑菌等活性[1,3]。因此，富集或添加特定多酚提取物以強化功能性飲料的保健功效是創(chuàng)新性研發(fā)的趨勢之一。

食品多酚提取物大多來自農(nóng)產(chǎn)加工副產(chǎn)品（種子殼、咖啡渣、茶葉或果皮），例如綠茶提取物[2-3]及種子殼提取物（如葡萄子[4]、咖啡豆殼[5]、栗子殼[6]和羅望子殼[7]）等。種子殼的多酚提取物常富含兒茶素、EGC、EGCG、原花青素等活性成分[8-9]，常具有抗氧化、抗肥胖、降血糖、抑菌和臨床上輔助治療Covid-19病毒的多重保健效益[9-11]。羅望子（Tamarindus indicaL.）又名酸角，其種子殼（即種皮）質(zhì)量約占種子的29%，以50%～75%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇水溶液提取的羅望子殼多酚提取物具有良好的體外抗氧化活性[7]，可能具有開發(fā)為功能性飲料、食品抗氧化劑和天然食用色素的商業(yè)應(yīng)用潛力。

非酶褐變現(xiàn)象是茶、果汁等富含多酚飲料常見的質(zhì)量問題[12-13]，其機理因所含多酚組成和飲料配方因素而異，酚類的降解與縮合引起的褐變[12,14-15]密切影響產(chǎn)品的保健功效、顏色、香氣、味道、安全性和貯藏期。因此，利用食品配方因素（天然產(chǎn)物保護劑、金屬離子等）來控制多酚飲料的褐變反應(yīng)速率是可行的方式[16-18]；而配方因素對多酚飲料褐變速率與多酚關(guān)鍵組成的影響鮮有系統(tǒng)性的報道。

因此，本實驗以羅望子種皮原花青素提取物（tamarind seed coat proanthocyanidins extract，TSPA）為研究對象，旨在分析常見的食品配方因素（TSPA質(zhì)量濃度、食品增稠性膠體、保護劑、低pH值和金屬陽離子（鈉、鈣、鋅）等）對原花青素類提取物系統(tǒng)（原花青素為醇溶性，故應(yīng)用乙醇系統(tǒng)）貯藏過程中褐變速率的影響，得到能有效控制多酚非酶褐變的基礎(chǔ)配方，并結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）和主成分分析解析非酶褐變中相關(guān)成分變化，以推測原花青素非酶褐變的可能機理。本研究可為原花青素提取物的功能性飲料的研發(fā)以及其非酶褐變的控制機理提供重要的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羅望子（Tamarindus indicaL.）種皮粉末 云南貓哆哩集團食品有限責(zé)任公司；沒食子酸（純度98%）、無水乙醇（分析純）、硫酸亞鐵七水合物、水楊酸、過硫酸鉀、氯化鈉、七水硫酸鋅、五水硫酸銅、無水檸檬酸、阿拉伯膠（arabic gum，AG）（分析純）上海阿達(dá)瑪斯試劑有限公司；原兒茶酸（protocatechuic acid，PCA）（純度98%）、EGC（純度大于98%）、EC（純度大于98%）、原花青素B2（procyanidin B2，PCB2，純度大于98%）、蘆丁、香蘭素（香草醛）、福林-酚、無水碳酸鈉、抗壞血酸、無水氯化鈣、β-環(huán)糊精（β-cyclodextrin，β-CD） 上海源葉生物科技有限公司；CN（純度98%） 梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；甲醇 上海安譜實驗科技股份有限公司；羧甲基纖維素（carboxymethyl cellulose，CMC） 丹尼斯克（中國）有限公司；96%伏特加基酒（乙醇體積分?jǐn)?shù)96%）波蘭帕慕斯酒業(yè)；人參花提取物（90%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇提取，富含類黃酮）、百香果皮低甲氧基果膠（passion low-methoxy pectin，PLP）（糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)78.9%、甲基酯化度31.4%）和桃膠（peach gum，PG）均為本研究室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

Avanti JXN-26冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司；冷凍干燥機 美國Labconco公司；e2695高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）、Acquity I-class超高效液相色譜和VION離子淌度四極桿飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Waters公司；725型紫外分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 羅望子種皮原花青素提取物的制備

將羅望子種皮粉末過60 目篩后稱取10 g，以液料比40∶1（V/m）加入55%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇水溶液，在50 ℃下提取105 min。提取結(jié)束后立刻離心（8 000 r/min、15 min），然后取上清液50 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)100 mL）后冷凍干燥，得到凍干的TSPA。

1.3.2 總酚含量測定

參照Sato等[19]的方法測定總酚含量。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝0.040 2x－0.012 6（R2＝0.999），按式（1）計算TSPA中總多酚含量（以沒食子酸當(dāng)量計，單位為mg/g，TSPA為基準(zhǔn)），按式（2）計算羅望子種皮粉末中總多酚含量。

式中：W為TSPA中總多酚（或總原花青素（單寧）、總黃酮）含量/（mg/g）；ρ為樣品溶液中多酚（或總原花青素（單寧）、總黃酮）的質(zhì)量濃度/（μg/mL）；D為稀釋倍數(shù)；V為提取液總體積/mL；m為TSPA的質(zhì)量/g；m0為羅望子種皮粉末的質(zhì)量/g。

1.3.3 總原花青素（單寧）含量測定

參照文獻[20]測定總原花青素（單寧）含量。以CN為標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝0.445 3x＋0.019 8（R2＝0.994），計算TSPA及羅望子種皮粉末中的總單寧含量（以每克樣品中所含CN質(zhì)量，單位為mg/g），計算方法同式（1）、（2）。

1.3.4 總黃酮含量測定

參照文獻[21]測定總黃酮含量。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y＝0.002 7x＋0.056 8（R2＝0.998），計算TSPA及羅望子種皮粉末中的總黃酮含量（每克樣品中所含蘆丁質(zhì)量計，單位為mg/g），計算方法同式（1）、（2）。

1.3.5 總花青素含量測定

參考文獻[22]測定總花青素含量。精確稱取0.030 g TSPA溶于6.0 mL濃鹽酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)36.5%）-甲醇溶液（體積比1∶99），于室溫暗處萃取2 h，4 ℃離心（1 000×g、15 min），取上清液分別測定530、657 nm波長處的吸光度A530nm、A657nm。按式（3）計算TSPA中的總花青素含量，并參考式（4）計算羅望子種皮粉末中總花青素含量/（μmol/g）。

式中：V為反應(yīng)體系體積/mL；m為TSPA的質(zhì)量/g；m0為羅望子種皮粉末的質(zhì)量/g。

1.3.6 不同TSPA溶液系統(tǒng)的制備與貯藏

選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、TSPA質(zhì)量濃度、pH值以及常見食品添加物成分的種類（包括金屬陽屬子、增稠性膠體和保護劑等）等因素進行研究，探究其對多酚系統(tǒng)穩(wěn)定性的影響，并初步解析抑制褐變的效果與機理。樣品制備方法如下，將制備的樣品進行55 ℃恒溫貯藏穩(wěn)定性的加速實驗（55 ℃貯藏6 d），測定褐色指標(biāo)并分析褐變動力學(xué)參數(shù)。

1.3.6.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)

96%（體積分?jǐn)?shù)）伏特加基酒用食品級純凈水稀釋配制成體積分?jǐn)?shù)50%乙醇溶液，作為下列樣品溶液配制所用母液，準(zhǔn)確稱取0.10 g TSPA溶于上述50%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇溶液中，再用食品級純凈水分別稀釋得到100 mL 1.0 mg/mL TSPA溶液（乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為5%、10%、25%、45%）。

1.3.6.2 TSPA質(zhì)量濃度

準(zhǔn)確稱取0.01、0.05、0.10、0.15、0.20 g樣品溶于10 mL 50%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇溶液中，再以食品級純飲用水稀釋至總體積100 mL，得TSPA 0.1～2.0 mg/mL（質(zhì)量濃度）、乙醇5%（體積分?jǐn)?shù)）的樣品溶液。所得TSPA溶液的pH值約4.8。

1.3.6.3 pH值

以10%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇水溶液配制TSPA質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL的樣品溶液50 mL，加入食品級純凈水40 mL預(yù)稀釋，再用1 mol/mL檸檬酸或0.1 mol/mL氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值，記錄滴加酸或堿的體積，最后補加純水至總體積100 mL，分別得到pH 3.0、3.8、4.8和pH 5.6的含1.0 mg/mL TSPA、5%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇的樣品溶液。

1.3.6.4 金屬離子

用10%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇水溶液配制50 mL 2.0 mg/mL TSPA溶液，然后分別取50 mL 10 mmol/L Na＋、Ca2＋、Zn2＋或Cu2＋水溶液（分別用NaCl、CaCl2、ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2O配制，后同），將TSPA溶液和金屬離子溶液等體積混合（對照組（CK）添加等體積的去離子水），得到100 mL含5%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇、5 mmol/L金屬離子的1.0 mg/mL TSPA溶液。其中含Cu2＋溶液為單寧的螯合劑[23]。

1.3.6.5 增稠性膠體

配制6.0 mg/mL的CMC、AG、PLP及PG混合體系，另用10%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇水溶液配制2.0 mg/mL的樣品溶液，將兩者等比例混合至總體積為100 mL，得TSPA 1.0 mg/mL、乙醇5%（體積分?jǐn)?shù)）、增稠性膠體3.0 mg/mL的混合體系（對照組（CK）為不含增稠性膠體的相同體系）。

1.3.6.6 保護劑

以50%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇水溶液配制質(zhì)量濃度均為20 mg/mL的TSPA溶液和人參花提取物溶液，兩者等比例混合至總體積為10 mL，加純水稀釋至100 mL，得TSPA 1.0 mg/mL、乙醇5%（體積分?jǐn)?shù)）、人參花提取物1.0 mg/mL的樣品（對照組（CK）為不添加保護劑的相同體系）。以10%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇水溶液配制TSPA質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL的樣品溶液50 mL，加入等體積的2.0 mg/mL的β-CD水溶液，混合后40 ℃水浴加熱，以200 r/min攪拌30 min溶解，得TSPA 1.0 mg/mL、乙醇5%（體積分?jǐn)?shù)）、β-CD質(zhì)量濃度1.0 mg/mL的樣品。

1.3.7 褐色指標(biāo)的測定

將1.3.6節(jié)樣品分裝于100 mL有螺旋蓋的玻璃瓶中，置于55 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置6 d，每隔24 h測定420 nm波長處吸光度A420nm，以A420nm作為褐色指標(biāo)[13]。

1.3.8 褐變動力學(xué)分析

果汁飲料的非酶褐變反應(yīng)可以褐色指標(biāo)（A420nm）進行零階或一階的動力學(xué)擬合[13,24]，模型的適用性隨所采用的指標(biāo)不同而異，褐色指標(biāo)變化適用于零階動力學(xué)[15,24]，故本研究采用零階動力學(xué)擬合，擬合方程如式（5）所示，按式（6）計算褐變程度（ΔA）。

式中：t為貯藏時間/d；A420nm，0、A420nm，6和A420nm，t分別為第0、6、t天褐色值；k0為零階動力學(xué)擬合的反應(yīng)速率常數(shù)/d－1。

1.3.9 色澤的測定

室溫下稱取TSPA樣品0.01 g溶于10 mL 50%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇水溶液，取樣品溶液5 mL于色差儀CR-400中測量L*、a*、b*值，校正白板色度為L*＝95.21、a*＝－0.33、b*＝3.41。

1.3.10 多酚組分的高效液相色譜分析

色譜條件：C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm），進樣量：10 μL，柱溫：25 ℃，流動相A：含0.1%（體積分?jǐn)?shù)）乙酸水溶液，流動相B：甲醇，流速為0.8 mL/min，檢測波長：280 nm，洗脫梯度：0～3 min，90%～85% A；3～8 min，85%～80% A；8～10 min，80% A；10～35 min，80%～70% A；35～40 min，70% A；40～50 min，70%～60% A；50～52 min，60%～90% A；52～55 min，90% A。所有溶劑都經(jīng)過0.22 μm濾膜過濾后使用。結(jié)果采用Empower軟件進行分析處理。

將標(biāo)準(zhǔn)品PCA、EGC、CN、PCB2、EC用50%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為1、3、5、7、9、11、20 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后進行HPLC分析。分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為PCA：y＝9 395.8x－3 273（R2＝0.996）；EGC：y＝2 404.4x＋313.48（R2＝0.999）；CN：y＝5 004.3x＋604.81（R2＝0.999）；PCB2：y＝4 741.1x＋361.37（R2＝0.999）；EC：y＝6 013x＋353.24（R2＝0.999）。

參考1.3.6.4節(jié)方法配制含5%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇及5 mmol/L金屬離子（Na＋、Ca2＋、Zn2＋或Cu2＋）的1.0 mg/mL TSPA溶液（對照組（CK）添加等體積的去離子水），將以上樣品常溫貯存1 d，經(jīng)過離心（12 000 r/min、20 min）后取上清液進行HPLC分析，計算主要色譜峰的峰面積百分比，同時對樣品進行褐色指標(biāo)、褐變動力學(xué)分析。

1.3.11 多酚組分的UPLC-MS/MS分析

色譜條件：流動相A為0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸水溶液，流動相B為0.1%（體積分?jǐn)?shù)）甲酸-乙腈，色譜柱為BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），柱溫45 ℃，進樣量1 μL，負(fù)離子模式。洗脫條件：0～3 min，5%～20% B；3～10 min，20%～100% B；10～12 min，100% B；12～15 min，100%～95% B；15～19 min，95% B。結(jié)果進行歸一化處理，計算主要色譜峰的峰面積百分比。

參考1.3.6.3節(jié)方法配制pH 3.0及含5%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇的1.0 mg/mL TSPA溶液，熱貯藏（55 ℃）6 d（記為AH6）；參考1.3.6.4節(jié)方法配制含5%（體積分?jǐn)?shù)）乙醇及5 mmol/L金屬離子（Na＋、Ca2＋、Zn2＋或Cu2＋）的1.0 mg/mL TSPA溶液，熱貯藏（55 ℃）1 d（分別為NaH1、CaH1、ZnH1、CuH1），含Cu2＋的TSPA溶液貯藏6 d（記為CuH6）；將不作任何處理的TSPA溶液（記為對照組C0）置于55 ℃貯藏6 d（記為CH6）。樣品經(jīng)過離心（12 000 r/min、20 min）后取上清液進行UPLC-MS/MS分析。

1.4 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計

實驗設(shè)置3 個平行，實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用Origin 2020b軟件作圖。使用SPSS Statistics軟件對數(shù)據(jù)結(jié)果進行單因素方差分析，通過Duncan多重比較分析顯著性差異，P＜0.05表示差異顯著。采用SIMCA 13.0軟件進行主成分分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 羅望子種皮原花青素提取物的多酚組成和色澤

由表1可知，TSPA中總酚含量為（397.1±3.1）mg/g，在羅望子種皮粉末中含量為（144.0±1.1）mg/g。TSPA總酚組成以總原花青素（單寧）（（218.3±3.9）mg/g）為主，總黃酮其次，總花青素較少。本研究所得TSPA的總酚含量高于山楂種子[25]和辣木籽[26]多酚提取物的總酚含量，后兩者中主要多酚為黃酮。此外，本研究的TSPA溶液（1.0 mg/mL）呈琥珀色，L*＝16.24±0.24、a*＝31.81±0.61、b*＝25.28±0.45。

表1 TSPA的多酚組成Table 1 Polyphenolic composition of TSPA

2.2 食品配方因素對TSPA溶液的褐變動力學(xué)的影響

2.2.1 TSPA的褐變動力學(xué)

圖1為TSPA樣品褐變的零階動力學(xué)擬合結(jié)果。在所探討的范圍內(nèi)，乙醇體積分?jǐn)?shù)（圖1A）對1.0 mg/mL TSPA溶液的褐變速率（斜率）無明顯影響。TSPA質(zhì)量濃度（圖1B）和pH值（圖1C）越高，褐變速率越大。圖1D顯示，與對照組CK（未添加金屬離子）相比，添加Na＋、Ca2＋和Zn2＋對1.0 mg/mL TSPA溶液的褐變速率無明顯影響，但Ca2＋和Zn2＋略降低了褐色指標(biāo)，與Zn2＋、Ca2＋促使溶液產(chǎn)生少量紅棕色沉淀有關(guān)。添加單寧的螯合劑Cu2＋[23]時褐色指標(biāo)在熱貯藏第1天上升至0.628，但第2天后隨時間的延長而線性減少，在第6天降低至0.068，與Cu2＋促使溶液生成大量的墨綠色沉淀有關(guān)。Cu2＋組初期（1 d）褐色指標(biāo)顯著上升可能是Cu2＋促進酚類物質(zhì)的氧化[27]所致。在膠體的影響方面（圖1E），與對照組CK相比，CMC、AG、PLP的添加對褐變速率具有促進作用，而PG無明顯影響，褐變速率大小為：CMC＞AG＞PLP＞CK和PG。人參花提取物和β-CD的添加（圖1F）均使褐變速率減小，雖然人參花提取物提高了初始褐色值。除了Cu2＋組（圖1D）之外，所有樣品的褐色值均隨著熱貯藏時間的延長而線性升高，符合零階動力學(xué)模型。這與曹少謙等[28]研究水蜜桃在80 ℃的褐變動力學(xué)模型一致；類似的，Yang Hua等[29]對碭山梨酒的褐變因素進行分析，得到低濃度和中濃度溶解氧條件下碭山梨酒的褐變符合零階動力學(xué)模型，而高濃度溶解氧下碭山梨酒的褐變符合一階動力學(xué)模型。

圖1 不同食品配方因素下的TSPA溶液的褐變零階動力學(xué)Fig. 1 Zero-order kinetics for browning of TSPA with different food formulation factors

不同配方因素下TSPA溶液在熱貯藏6 d的褐色指標(biāo)、褐變程度（ΔA）、褐變速率常數(shù)（k0）、決定系數(shù)（R2）如表2所示。0.1～2.0 mg/mL TSPA溶液的第0天褐色指標(biāo)（A420nm，0）為0.049～0.747，第6天褐色指標(biāo)（A420nm，6）為0.172～1.285，6 d內(nèi)褐變程度ΔA＝0.123～0.538，各個質(zhì)量濃度之間均呈現(xiàn)顯著差異（P＜0.05）。而其他食品配方因素下（TSPA質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL），A420nm，0＝0.373～0.636，A420nm，6＝0.068～1.390，ΔA＝0.177～0.991（除了Cu2＋組外）。TSPA樣品的褐變速率常數(shù)k0為0.020 7～0.158 1 d－1。Cu2＋組k0為－0.119 6 d－1，相當(dāng)于澄清速率常數(shù)。零階動力學(xué)模式擬合均呈現(xiàn)非常良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2為0.969～0.999。綜上可知，TSPA溶液的ΔA和k0主要決定于TSPA質(zhì)量濃度，其次受pH值、二價金屬離子和特定膠體所影響。在1.0 mg/mL TSPA溶液的基準(zhǔn)下，1 mg/mL人參花提取物可顯著降低褐變（以ΔA和k0為指標(biāo)）（P＜0.05），抑制程度高達(dá)40%～50%，優(yōu)于其他食品因素。pH 3.0～3.8明顯抑制褐變程度；而pH 5.6、添加CMC和PLP和AG會顯著促進褐變（P＜0.05），且促進褐變效果為CMC＞PFP＞AG。由于乙醇體積分?jǐn)?shù)對TSPA樣品褐變的影響不大，故本研究以含體積分?jǐn)?shù)5%乙醇的TSPA溶液進行后續(xù)研究。

表2 食品配方因素對TSPA溶液褐變參數(shù)和零階動力學(xué)參數(shù)的影響Table 2 Effects of food formulation factors on browning parameters and zero-order kinetic parameters of TSPA

2.2.2 TSPA質(zhì)量濃度、pH值及其他食品配方因素的影響

將表2的數(shù)據(jù)進一步作線性關(guān)系分析，以闡明褐色指標(biāo)A420nm（果汁貯藏穩(wěn)定性的指標(biāo)之一）[15]、TSPA質(zhì)量濃度及pH值與褐變程度ΔA、零階動力學(xué)擬合的反應(yīng)速率常數(shù)k0的關(guān)系以及食品配方因素的影響趨勢。結(jié)果如圖2所示。圖2A顯示單純TSPA溶液系統(tǒng)的A420nm，0和貯藏6 d的褐變程度（ΔA）都與TSPA質(zhì)量濃度呈緊密的線性關(guān)系，斜率分別為0.367 8（R2＝0.999 9）和0.214 9（R2＝0.995 5）。即A420nm，0可較準(zhǔn)確反映系統(tǒng)的TSPA質(zhì)量濃度。圖2B顯示ΔA是A420nm，0的線性函數(shù)，斜率為0.584 1（R2＝0.994 2）。在1 mg/mL TSPA質(zhì)量濃度基準(zhǔn)下，所探討的食品配方因素大都不會大幅改變?nèi)芤旱腁420nm，0（PLP除外），圖2C顯示k0是TSPA質(zhì)量濃度的線性函數(shù)：k0＝0.033 5x＋0.018 7，決定系數(shù)（R2＝0.995 0）非常高。在pH 3.8～5.6范圍內(nèi)（圖2D），k0與pH值呈線性關(guān)系，且R2＝0.999 8。

綜合表2可得，與不做任何處理的1 mg/mL TSPA溶液相比，添加CMC使ΔA和k0提高3 倍以上，添加PLP使A420nm，0、ΔA和k0提高約2 倍以上；而pH 5.6和添加AG會提高ΔA和k0約50%。人參花提取物能有效地抑制TSPA褐變的速率常數(shù)為40%～50%，可能由于人參花提取物中含有類黃酮成分，具有一定的抗氧化活性，因此可減緩TSPA的氧化褐變速率[30]。增稠膠體中PG適合用作TSPA溶液配方且能輕微減輕褐變的作用；而CMC、PLP和AG不適合添加，這可能與CMC和PLP富含羧基而AG含少量蛋白質(zhì)有關(guān)：多酚能與多糖的羧基或蛋白質(zhì)的胺基、巰基發(fā)生共價鍵和非共價作用[31]。二價的Ca2＋、Zn2＋、Cu2＋會作用TSPA溶液中特定的多酚組成，沉淀量為Cu2＋＞Ca2＋＞Zn2＋，Ca2＋和Zn2＋的沉淀作用不影響TSPA上清液的褐變程度，但Cu2＋能引起大量沉淀而降低TSPA上清液后期的褐變程度。類似地，蘋果縮合單寧的沉淀效果也是Fe2＋＞Cu2＋＞Zn2＋[23]。至于pH值的影響，與其他pH值條件相比，低pH（3.0～3.8）組的褐變程度更低，這可能與低pH值下酚酸較穩(wěn)定有關(guān)，pH值越高多酚類的自動氧化速率越高，且氧化物的醌基越容易進行親核性反應(yīng)[31]。

圖2 TSPA質(zhì)量濃度、pH和其他食品配方因素對TSPA溶液褐色指標(biāo)及速率常數(shù)的影響Fig. 2 Effect of TSPA concentration, pH, and other food formulation factors on the brown indicators and rate constant of TSPA

2.3 金屬離子沉淀對TSPA溶液多酚組成的影響

由于金屬離子會與TSPA溶液中特定多酚組成作用而沉淀，故貯藏后TSPA溶液中的褐變程度決定于其未沉淀的多酚組成。因此，進一步以HPLC法分析經(jīng)金屬離子完全作用（室溫靜置1 d）后TSPA溶液中的多酚組成，并推論可與金屬離子鍵結(jié)的多酚類化合物。圖3的HPLC圖譜顯示，CK（對照組）呈現(xiàn)8 個可辨別的峰，與標(biāo)準(zhǔn)品對照，可鑒定出最主要的3 個峰是PCA（峰2*）、PCB2（峰5*）和EC（峰6*），未檢出EGC和CN。所以TSPA主要由縮合單寧（以黃烷醇為單體）而非水解單寧（以沒食子酸為單體）構(gòu)成[9]。添加5 mmol/L Na＋或Zn2＋并室溫靜置1 d后（Na1或Zn1），TSPA溶液多酚組成分布類似對照組，為整體峰信號強度較小。但添加5 mmol/L Ca2＋或Cu2＋并室溫靜置1 d后（Ca1或Cu1），主要多酚為PCA，保留時間15 min以后的峰都消失，說明主要成分PCB2和EC以及小峰4*、7*和8*化合物可與Ca2＋和Cu2＋螯合而沉淀。

圖3 添加不同金屬離子后TSPA溶液多酚組成的HPLC圖譜Fig. 3 HPLC chromatograms for phenolic composition in TSPA added with different metal ions

如表3所示，PCA、PCB2、EC的質(zhì)量濃度范圍分別為1.93～2.88 μg/mL、0.11～4.43 μg/mL以及0.10～3.27 μg/mL。與對照組相比，4 種金屬離子都會顯著降低TSPA中PCA、PCB2、EC質(zhì)量濃度（P＜0.05），Ca2＋與Cu2＋樣品中PCA質(zhì)量濃度分別降低了33%、38%，PCB2、EC質(zhì)量濃度降低了96%～98%，遠(yuǎn)大于Na＋與Zn2＋對溶液中PCA、PCB2、EC質(zhì)量濃度的影響（降低率為10%～25%）。因此，Ca2＋沉淀法可用于富集食品用途的PCB2和EC類縮合單寧，效果與Cu2＋沉淀法相似。對蘋果縮合單寧的研究也發(fā)現(xiàn)PCB2和EC易與二價金屬離子發(fā)生螯合并產(chǎn)生沉淀，效果依次為Fe2＋＞Cu2＋＞Zn2＋[23]。

2.4 金屬離子與熱貯藏對TSPA多酚組成的影響

各種處理的樣品上清液的多酚類詳細(xì)組成的UPLCMS/MS基峰離子流圖如圖4所示。圖4A為未處理的TSPA溶液（對照組C0），多酚組成有關(guān)的主要峰3、7、10、11和小峰6、9、12～16，峰4為檸檬酸。和C0組相比較，熱貯藏6 d的樣品（CH6，圖4B）峰3相對高度減小，峰6、7、9、10、11等相對高度增加約2 倍，且新增大峰5和小峰8、17。以檸檬酸酸化至pH 3并熱貯藏6 d的樣品（AH6，圖4C），峰4、8、11的峰面積增加（峰4為檸檬酸），峰10面積減小，且數(shù)個峰（1～3、6、12～16）消失。添加Na＋并熱貯藏1 d的樣品（NaH1，圖4D）新增峰5和0.60 min峰（Na＋），多酚組成分布與C0組近似，但峰3相對高度較小些。添加Ca2＋并熱貯藏1 d的樣品（CaH1，圖4E）中與多酚相關(guān)的主要峰為峰5、7、10、11，離子強度因0.66 min峰（Ca2＋）太強而相對較小。添加Zn2＋并熱貯藏1 d的樣品（ZnH1，圖4F）的多酚組成分布（峰3～17）與NaH1近似，離子強度因0.57 min峰（Zn2＋）太強而減半。添加Cu2＋并熱貯藏1 d的樣品（CuH1，圖4G）多酚相關(guān)的主要峰是峰7、10、11、16；貯藏6 d后（CuH6，圖4H）只剩峰7（主要）和峰10；離子強度因0.66 min處的峰（Cu2＋）太強而相對較小。

圖4 不同處理后TSPA溶液上清液的多酚組成在負(fù)離子模式下的基峰離子流圖Fig. 4 Base peak ion (BPI) chromatograms in the negative ion mode for polyphenolic composition in supernatants of TSPA with different treatments

參照文獻[32-35]對圖4各峰的質(zhì)譜碎片特征進行鑒定，將質(zhì)譜碎片特征與鑒定結(jié)果列于表4中。

表4 UPLC-MS/MS分析TSPA中多酚組成結(jié)果Table 4 Polyphenolic composition of TSPA identified by UPLC-MS/MS

主要酚類（PCB2dG、PCB3及相關(guān)的化合物）分子離子峰與碎片離子的生成過程如圖5所示。圖5A顯示化合物8（分子離子峰m/z881.19）鑒定為PCB2dG，失去一個沒食子?；纬稍ㄇ嗨谺2-3’’-O-沒食子酸酯（特征碎片m/z729.14），經(jīng)過醌甲基化物（quinone methide，QM）裂變得到(－)-表兒茶素-3-O-沒食子酸酯（m/z441.08）和m/z287.06的分子離子碎片。(－)-表兒茶素-3-O-沒食子酸酯再經(jīng)過甲基化形成(－)-表兒茶素-3-(3’-O-甲基)沒食子酸酯（m/z455.10），或得到一個沒食子?；纬?－)-表兒茶素-3,5-O-雙沒食子酸酯，同化合物5的特征，其分子離子m/z為593.13，碎片離子為m/z441.08（失去沒食子?；?、m/z153.02（沒食子?；┘癿/z125.02。圖5B顯示化合物10為PCB2（m/z577.14），其碎片離子生成途徑主要包括[32]：1）醌甲基化途徑形成EC特征碎片（m/z287.05和289.07）；2）經(jīng)過逆狄爾斯-阿爾德反應(yīng)（retro Diels-Alde，RDA）裂解途徑生成m/z425.08與m/z407.08兩種離子碎片；3）經(jīng)雜環(huán)裂變（heterocyclic ring fission，HRF）途徑形成m/z451.10碎片離子?；衔?1鑒定為EC，具有m/z289.07的分子離子與m/z245.08的碎片離子?；衔?2和14可鑒定為PCB3的異構(gòu)物（皆為m/z865.2），可通過QM途徑形成PCB2和其特征離子片段。

綜合圖4和表4可知，對照組C0的主要多酚是CAH、PCA、PCB2以及EC，并有少量的PCB3、芹菜素-7-O-葡萄糖苷（apigenin-7-O-glucoside，AG）、HBA和未知化合物（可能是原花青素多聚體）。和C0組相比較，CH6樣品的CAH相對含量減少，AG、PCA、HBA、PCB2以及EC等相對含量顯著增加，新增較多的ECdG以及微量的PCB2dG和未知化合物。AH6樣品新增大量的PCB2dG，EC含量顯著提高，但PCA和PCB2含量大幅減少，而CAH和原花青素聚合體消失。NaH1和ZnH1樣品的CAH含量減少，新增ECdG，其他多酚組成分布與C0組近似。CaH1樣品的主要多酚組成有ECdG、PCA、PCB2及EC。CuH1的樣品主要有PCA、PCB2、EC及未知化合物（可能是原花青素多聚體）。CuH6樣品只有EC和PCB2。

本研究發(fā)現(xiàn)熱貯藏時會產(chǎn)生較多的ECdG、提高原花青素主要成分與多聚體含量以及減少CAH。酸性環(huán)境（pH 3）使原花青素多聚體和CAH水解消失，新增大量的PCB2dG和EC等。4 種金屬離子的添加也會使TSPA上清液的原花青素多聚體和CAH消失，但Na＋和Zn2＋不影響主要原花青素組成分布，Ca2＋和Cu2＋會顯著降低原花青素主成分。TSPA和板栗殼原花青素提取物（沒食子酸、CN、EC、PCB2）[36]都富含PCB2，但TSPA含大量CAH和PCA，沒有沒食子酸、CN和沒食子兒茶素。栗子殼原花青素提取物已被開發(fā)為功能性食品并實現(xiàn)臨床應(yīng)用[10]，表明TSPA也具有類似的開發(fā)價值。

圖5 PCB2dG（A）與PCB3（B）的主要碎片形成途徑Fig. 5 Main fragmentation pathways of procyanidin B2-3,5-digallate and procyanidin trimer

2.5 TSPA多酚組成與褐色參數(shù)的關(guān)系

對TSPA的HPLC分析結(jié)果（圖3中主要化合物的峰面積百分比）與其對應(yīng)樣品的褐色參數(shù)（ΔA、A420nm，0、A420nm，1）進行主成分分析，結(jié)果如圖6A所示，PC1和PC2的方差貢獻率分別為78.4%和18.9%，表明該模型可解釋97.3%的數(shù)據(jù)變化。由于聚類程度越接近表示正相關(guān)性越高（或貢獻度越大），可知C0、Na1和Zn1相接近，表示其酚類組成相近似，共同化合物4*～8*的峰面積百分比與A420nm，0或ΔA以及A420nm，0與ΔA都呈正相關(guān)（同在PC1正值區(qū)），其中化合物5*（PCB2）的峰面積百分比對ΔA的貢獻最大（兩者最接近且在同一象限）。Ca1和Cu1酚類組成相近似，共同化合物1*～3*的峰面積百分比與A420nm，1（第1天褐色值）呈正相關(guān)，其中化合物2*（PCA）的峰面積百分比對Cu1的高A420nm，1貢獻較大（距離較接近）。針對金屬離子作用、酸性（pH 3）及熱貯藏前后的TSPA樣品的化學(xué)組成（圖4中主要化合物的峰面積百分比）與其對應(yīng)樣品的褐色參數(shù)（表2中ΔA、A420nm，0、A420nm，1）的主成分分析結(jié)果如圖6B所示。其中，PC1和PC2的方差貢獻率分別為58.2%和17.7%，總方差貢獻率為75.9%。C0和NaH1酚組成相近似，化合物3、12～15的峰面積百分比與C0、NaH1位置較接近，說明樣品中這些化合物含量較多；而化合物5～7、9～10的峰面積百分比較接近CH6和ΔA，化合物11的峰面積百分比接近A420nm，0，即化合物5～7、9～10的峰面積百分比對CH6和ΔA的貢獻較大，而化合物11的峰面積百分比對A420nm，0貢獻較大。另外，CaH1、CuH1、CuH6的酚組成相近似且與A420nm，1呈正相關(guān)，與樣品CH6的情況相反。AH6含有較多的化合物8，另也含有化合物7～11（與CH6相似），但缺乏化合物3～5、12～15（與C0反向）。

圖6 TSPA中主要多酚組分及褐變參數(shù)的主成分分析結(jié)果Fig.6 Principal component analysis biplots for polyphenolic composition and browning parameters of TSPA

綜上，C0、Na1和Zn1酚組成相似；CaH1、CuH1和CuH6酚組成相似；CH6及AH6各具特有的酚組成。對于未加熱貯藏時的TSPA樣品，PCB2的峰面積百分比與ΔA呈正相關(guān)，PCA的峰面積百分比與A420nm，1呈正相關(guān)，與ΔA呈負(fù)相關(guān)。對于熱貯藏的TSPA樣品，化合物11（EC）的峰面積百分比與A420nm，0呈正相關(guān)，但熱處理后化合物5～7、9～10的峰面積百分比與ΔA呈正相關(guān)。因此，主成分分析結(jié)果顯示TSPA原花青素主要組成中ECdG、PCA、PCB2與EC是褐變的關(guān)鍵因素，AG和HBA因含量少故不予考慮，這與楊子涵等[37]研究歸納出的鄰苯二酚（CN/EC等）、鄰苯三酚（EGC等）等多酚類結(jié)構(gòu)易被氧化的結(jié)果相符。

2.6 TSPA原花青素組成變化機理的初步推斷

綜上，可歸納出TSPA系統(tǒng)在熱、酸化與添加Na＋或Zn2＋時酚類組成變化的初步反應(yīng)機理，如表5所示。將酚類化合物根據(jù)結(jié)構(gòu)特性分為兩類：羥基酚酸類（CAH、PCA和HBA）和黃酮類（AG、EC、PCB2和多聚體）[9]，所涉及的可能反應(yīng)機理與其結(jié)構(gòu)特性有關(guān)。歸納如下：1）PCB3與多聚體會降解生成PCB2、EC和苯酚等，產(chǎn)物進一步氧化縮合反應(yīng)形成ECdG、PCB2dG和EC等，熱催化會促進ECdG形成，酸催化會促進PCB2dG形成，苯酚經(jīng)熱催化氧化形成PCA和HBA；2）PCB2會氧化聚合形成PCB3和多聚體。3）CAH分解脫去糖基形成咖啡酸（citric acid，CA）（酸催化），易與其他酚化合物氧化聚合而沉淀；4）Na＋或Zn2＋會沉淀部分PCA、PCB2、EC和PCB多聚體，催化EC進行ECdG形成路徑。所涉及ECdG、PCA、PCB2dG、PCB2與EC的形成與含量決定了該條件下的褐變程度。

表5 TSPA系統(tǒng)中酚類組成變化的可能反應(yīng)機理Table 5 Possible reaction mechanisms for polyphenolic composition changes of TSPA

3 結(jié) 論

本研究鑒定了TSPA中主要多酚的組成，發(fā)現(xiàn)不同食品配方因素下的TSPA系統(tǒng)的非酶褐變符合零階動力學(xué)模型，并初步解析得到原花青素關(guān)鍵主成分變化及褐變的可能機理。以酒精系統(tǒng)為應(yīng)用系統(tǒng)，在各種食品配方因素（TSPA質(zhì)量濃度、食品增稠性膠體、保護劑、低pH值和金屬陽離子（除了Cu2＋外））中，所有樣品的褐變均符合零階動力學(xué)模型。TSPA溶液的ΔA和k0主要決定于TSPA質(zhì)量濃度，其次受pH值、二價金屬離子和特定膠體所影響。UPLC-MS/MS分析結(jié)果顯示，TSPA主要含PCB2、EC、PCA和CAH，添加金屬離子會顯著降低TSPA溶液上清液的主要酚類含量，尤其是Ca2＋和Cu2＋所致降低率為96%～98%（PCB2和EC）。本研究發(fā)現(xiàn)TSPA原花青素主要組成中ECdG、PCA、PCB2與EC是非酶褐變的關(guān)鍵因素，并推測了TSPA非酶褐變的可能機理。TSPA溶液呈琥珀色，具有作為功能性飲料的基材和天然食品色素的潛力。本實驗為評估和研究植物多酚的非酶褐變關(guān)鍵成分提供了理論參考，為工業(yè)應(yīng)用中羅望子原花青素提取物提供了依據(jù)。未來需進一步研究羅望子原花青素提取物飲料的綜合配方、功能性及長期貯藏穩(wěn)定性，以實現(xiàn)其在食品飲料上的應(yīng)用。