布鑫榮，王惠惠，宋艷艷，余群力，韓 玲，張 麗,*，郭兆斌，陳 騁

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.陜西雙匯食品有限公司，陜西 咸陽(yáng) 712000)

蛋白質(zhì)氧化是由血紅素色素、金屬催化劑和其他氧化劑作用引起的一個(gè)復(fù)雜的生理生化過(guò)程[1-2]，經(jīng)常發(fā)生在肉類、牛奶和雞蛋等富含蛋白質(zhì)的食物中[3]。引起肉類和肉制品蛋白氧化的3 種途徑（羥自由基氧化、高鐵肌紅蛋白氧化和脂質(zhì)氧化）中，羥自由基氧化和高鐵肌紅蛋白氧化是直接影響蛋白質(zhì)氧化的兩種主要途徑[1,4-6]。此外，不同氧化途徑和強(qiáng)度會(huì)對(duì)肌原纖維蛋白的氨基酸組成和含量產(chǎn)生不同程度的影響[7-11]。肉類是人體必需氨基酸（essential amino acid，EAA）的重要來(lái)源[12]，然而，肉和肉制品在宰后成熟、運(yùn)輸和貯存等過(guò)程中因發(fā)生不可避免的蛋白氧化反應(yīng)而破壞肌肉中的氨基酸，促使氨基酸側(cè)鏈結(jié)構(gòu)發(fā)生氧化修飾，進(jìn)而導(dǎo)致肉類蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的損失[13-15]。

氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的氧化修飾是蛋白質(zhì)氧化的主要結(jié)果之一[14]。蛋白質(zhì)中幾乎所有的氨基酸側(cè)鏈都可以被氧化修飾，例如脂肪族和芳香族氨基酸的羥基化、芳香族氨基酸殘基的硝基化、甲硫氨酰殘基的磺化氧化、巰基的亞硝?；约耙恍┌被釟埢缇彼?、賴氨酸、脯氨酸和蘇氨酸的羰基化等[3,16-17]。已有研究表明，蛋白質(zhì)中游離氨基酸和氨基酸殘基極易被一種或多種活性物質(zhì)氧化[16]，且不同氧化體系對(duì)氨基酸的氧化具有選擇性[18-20]。Park等[21]通過(guò)研究3 種不同的氧化體系對(duì)豬肉肌原纖維蛋白氨基酸的氧化修飾發(fā)現(xiàn)，在3 種氧化體系中，含硫氨基酸如半胱氨酸和蛋氨酸最容易被氧化；半胱氨酸、蛋氨酸和酪氨酸在羥自由基氧化體系（ironcatalyzed oxidizing system，IOS）中更易被氧化；而在高鐵肌紅蛋白氧化體系（metmyoglobin oxidizing system，MOS）中則是丙氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、組氨酸、亮氨酸和賴氨酸較易發(fā)生氧化。李銀等[22]研究也發(fā)現(xiàn)，豬肉肌原纖維蛋白的半胱氨酸、蛋氨酸及酪氨酸等敏感性氨基酸在IOS中易被氧化。而Refsgaard等[23]卻發(fā)現(xiàn)，將牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）孵育在IOS中，賴氨酸、半胱氨酸和組氨酸易發(fā)生氧化修飾。此外，Dorta等[24]研究過(guò)氧化自由基誘導(dǎo)的牛肉肌原纖維蛋白氧化對(duì)氨基酸產(chǎn)生的影響發(fā)現(xiàn)，氧化4 h后，酪氨酸、色氨酸、蛋氨酸和賴氨酸含量顯著下降。綜上所述，自由基攻擊氨基酸的偏好和選擇不僅取決于氧化體系，而且和動(dòng)物種屬有關(guān)。肉類在宰后自然成熟過(guò)程中，氧化也可能使蛋白質(zhì)發(fā)生降解或聚集，進(jìn)而導(dǎo)致EAA的損失等[8]，目前，有關(guān)不同氧化體系及牦牛肉成熟過(guò)程中因氧化引起的氨基酸含量變化的研究較少，且主要集中于不同氧化體系和成熟過(guò)程中牦牛肉生化特性的研究。

因此，本實(shí)驗(yàn)研究在IOS和MOS下，不同氧化強(qiáng)度對(duì)牦牛肉肌原纖維蛋白氨基酸含量的影響，并探究在不同氧化強(qiáng)度下牦牛肉成熟過(guò)程中肌原纖維蛋白氨基酸含量的變化，以期為探索氧化對(duì)牦牛肉品質(zhì)的影響提供一定的科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)選用甘肅省甘南藏族自治州3～4 歲（體質(zhì)量約（300±50）kg）、健康無(wú)病的公牦牛6 頭。在商業(yè)屠宰廠屠宰后，于30 min內(nèi)取背最長(zhǎng)肌（第12胸椎至第5腰椎），剔除表面筋膜、脂肪，切成3 cm×3 cm×3 cm大小的肉塊。樣品立即用液氮速凍；左側(cè)背最長(zhǎng)肌分別注射不同濃度的氧化劑，真空包裝，于4 ℃條件成熟1、5、7、14 d（原位肉實(shí)驗(yàn)）；右側(cè)背最長(zhǎng)?。?0 ℃下凍藏，并在不同氧化強(qiáng)度的IOS和MOS中進(jìn)行孵育（體外實(shí)驗(yàn)）。

KCl、K2HPO4、KH2PO4、NaCl、乙二醇-雙-(2-氨基乙醚)四乙酸（ethylene glycol bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid，EGTA）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）、FeCl3、H2O2、抗壞血酸（vitamin C，VC）、哌嗪-N,N’-雙(2-乙磺酸) 天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；標(biāo)準(zhǔn)BSA、肌紅蛋白 美國(guó)Sigma公司；其他試劑均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TGL-16PC臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀集團(tuán)；SP-756P紫外-可見分光光度計(jì) 上海美譜達(dá)儀器有限公司；L-8900氨基酸自動(dòng)分析儀 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 原位模型構(gòu)建

前期研究發(fā)現(xiàn)，H2O2濃度分別為50 mmol/L（低濃度）、200 mmol/L（中濃度）和500 mmol/L（高濃度）時(shí)，牦牛肉肌原纖維蛋白羰基含量差異顯著（P＜0.05）。本實(shí)驗(yàn)選取左側(cè)背最長(zhǎng)肌，部分樣品立即用液氮速凍，將剩余樣品隨機(jī)分成4 份，分別注射0 mmol/L H2O2和5 mmol/L NaCl（對(duì)照組）、50 mmol/L H2O2和5 mmol/L NaCl、200 mmol/L H2O2和5 mmol/L NaCl以及500 mmol/L H2O2和5 mmol/L NaCl，注射量為肉質(zhì)量的5%，真空包裝，在4 ℃成熟1、5、7、14 d取樣，用鋁箔紙包裹，－80 ℃保存，用于構(gòu)建原位模型。

1.3.2 體外模型構(gòu)建

在原位模型基礎(chǔ)上，測(cè)定不同濃度（50、200、500 mmol/L）H2O2處理后肌原纖維蛋白羰基含量，用羰基含量分別逆向確定IOS和MOS中的H2O2濃度。其中，IOS中，H2O2濃度分別為0.3、0.4 mmol/L和0.5 mmol/L，MOS中，高鐵肌紅蛋白（metmyoglobin，MetMb）和H2O2濃度均為0.01、0.03 mmol/L和0.05 mmol/L。

1.3.3 肌原纖維蛋白的提取

參考Park等[21]的方法并略作修改。稱取1 g肉樣，加10 倍體積標(biāo)準(zhǔn)鹽溶液（20 mmol/L磷酸鉀緩沖液、0.1 mol/L KCl、2 mmol/L EGTA、2 mmol/L MgCl2、pH 6.8）均質(zhì)，于1 000×g條件下離心10 min（4 ℃），棄去上清液，沉淀用8 倍體積標(biāo)準(zhǔn)鹽溶液溶解后，4 ℃離心10 min棄上清液，重復(fù)兩次。沉淀用8 倍體積100 mmol/L KCl溶液溶解后，4 ℃離心10 min棄上清液，重復(fù)兩次。采用雙縮脲法定量蛋白，以吸光度為橫坐標(biāo)，以牛血清蛋白質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，方程為y＝0.061 3x－0.000 6（R2＝0.999 7）。

1.3.4 體外氧化體系的建立

取置于－80℃凍藏的牦牛肉右側(cè)背最長(zhǎng)肌，按1.3.3節(jié)的方法提取肌原纖維蛋白用于體外孵化，建立體外氧化體系。

1.3.4.1 IOS的建立

參考Xiong Youling L.等[1]的方法并略作修改。將肌原纖維蛋白懸浮于H2O2濃度分別為0.3、0.4 mmol/L和0.5 mmol/L的15 mmol/L 1,4-哌嗪二乙磺酸（1,4-piperazinediethane sulfonic acid，PIPES）緩沖液（含0.6 mol/L NaCl、0.01 mmol/L FeCl3、0.1 mmol/L VC、pH 6.0）中，將蛋白質(zhì)量濃度調(diào)至15 mg/mL，置于4 ℃下氧化24 h，用1 mmol/L EDTA終止反應(yīng)，于2 000×g離心15 min（4 ℃），棄上清液。沉淀用孵育緩沖液洗滌兩次，最后得到的沉淀重新懸浮在孵育緩沖液中，然后采用雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度。對(duì)照組為未加氧化劑直接于4 ℃放置24 h的肌原纖維蛋白。

1.3.4.2 MOS的建立

參考Park等[7]的方法略作修改。將肌原纖維蛋白懸浮于MetMb/H2O2濃度分別為0.01、0.03 mmol/L和0.05 mmol/L的15 mmol/L PIPES緩沖液（含0.6 mol/L NaCl、pH 6.0）中，將蛋白質(zhì)量濃度調(diào)至5 mg/mL，置于4 ℃氧化2 h，用1 mmol/L EDTA終止反應(yīng)，于2 000×g離心15 min（4 ℃），棄上清液。沉淀用孵育緩沖液洗滌兩次，最后得到的沉淀重新懸浮在孵育緩沖液中，然后采用雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度。對(duì)照組為未加氧化劑直接于4 ℃放置24 h的肌原纖維蛋白。

1.3.5 氨基酸含量的測(cè)定

參考GB 5009.124－2016《食品中氨基酸的測(cè)定》[25]和Park等[26]的方法測(cè)定氨基酸含量。在原位模型中，分別在肉樣中注射0 mmol/L H2O2和5 mmol/L NaCl（對(duì)照組）、50 mmol/L H2O2和5 mmol/L NaCl、200 mmol/L H2O2和5 mmol/L NaCl以及500 mmol/L H2O2和5 mmol/L NaCl的氧化劑后提取肌原纖維蛋白，并取2 mL 10 mg/mL肌原纖維蛋白溶液和8 mL 6 mol/L HCl溶液混合后，緩慢加入水解管中，在體外模型中，從體外肉樣提取肌原纖維蛋白，并將肌原纖維蛋白分別置于IOS（0.3、0.4 mmol/L和0.5 mmol/L的H2O2）和MOS（0.01、0.03 mmol/L和0.05 mmol/L的MetMb/H2O2）孵育，并分別取2 mL 10 mg/mL孵育后的肌原纖維蛋白溶液和8 mL 6 mol/L HCl溶液混合后，緩慢加入水解管中。后將原位和體外模型的水解樣品均置于恒溫箱中（110 ℃）水解24 h，冷卻至室溫。將水解液轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中，去離子水定容。之后分別經(jīng)雙層濾紙和0.22 μm水系微孔濾頭過(guò)濾，并取濾液2 mL，采用氨基酸分析儀分別測(cè)定其原位和體外氨基酸組成。牦牛肉肌原纖維蛋白氨基酸含量單位為g/100 g pro。

1.3.6 氨基酸營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)

1.3.6.1 氨基酸評(píng)分

依據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織（United Nations Food Agriculture Organization/World Health Organization，F(xiàn)AO/WHO）修訂的人體EAA模式[27]進(jìn)行比較，按公式（1）計(jì)算氨基酸評(píng)分（amino acid score，AAS）。

1.3.6.2 化學(xué)評(píng)分

采用FAO推薦的方法[28]，按公式（2）計(jì)算化學(xué)評(píng)分（chemical score，CS）。

式中：Ai為待評(píng)蛋白質(zhì)中某一EAA的含量/（g/100 g pro）；Aj為待評(píng)蛋白質(zhì)中EAA的總含量/（g/100 g pro）；Ei為標(biāo)準(zhǔn)雞蛋白中相應(yīng)某一EAA的含量/（mg/g）；Ej為標(biāo)準(zhǔn)全雞蛋蛋白中EAA的總含量/（mg/g）。

1.3.6.3 必需氨基酸指數(shù)

采用FAO的方法[28]，按公式（3）計(jì)算必需氨基酸指數(shù)（essential amino acid index，EAAI）。

式中：n為被比較的EAA個(gè)數(shù)；At、Bt、Ct、…、Zt為牦牛肉肌原纖維蛋白EAA含量/（g/100 g pro）；As、Bs、Cs、…、Zs為全雞蛋蛋白質(zhì)的EAA含量/（mg/g）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，利用SPSS 21.0軟件采用Duncan’s法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較分析，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，選用因子分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行交互作用分析和主成分分析，并運(yùn)用Origin 2017軟件繪制主成分分析的載荷圖和因子得分圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氧化強(qiáng)度下牦牛肉成熟過(guò)程中肌原纖維蛋白氨基酸含量的變化

2.1.1 不同氧化強(qiáng)度下牦牛肉成熟過(guò)程中氨基酸含量的變化

肉中氨基酸的種類和數(shù)量是評(píng)價(jià)蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高低的重要指標(biāo)[29]。不同氧化強(qiáng)度下牦牛肉成熟過(guò)程中氨基酸含量差異顯著，且氧化強(qiáng)度與成熟時(shí)間二者有交互作用，分析結(jié)果如表1所示。

表1 不同氧化強(qiáng)度下牦牛肉成熟過(guò)程中氨基酸含量的變化Table 1 Changes in amino acid contents during aging process of yak meat with different oxidation intensities

續(xù)表1

由表1可知，在同一氧化強(qiáng)度下，隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，所檢出的17 種氨基酸中蘇氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、酪氨酸和賴氨酸的含量均顯著下降（P＜0.05），且依次下降約50%、19%、42%、10%、8%、38%、8%和7%；而在成熟的第0～5天時(shí)，絲氨酸、亮氨酸和組氨酸含量呈上升趨勢(shì)，隨后逐漸下降。此外，同一成熟時(shí)間，隨氧化強(qiáng)度的增加，絲氨酸、甘氨酸、纈氨酸和酪氨酸含量均極顯著下降（P＜0.01）。同時(shí)，不同氧化強(qiáng)度和成熟時(shí)間二因素的交互作用對(duì)蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、組氨酸、精氨酸和脯氨酸均有極顯著的影響（P＜0.01）。

同一氧化強(qiáng)度下，隨成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，總氨基酸含量、呈味氨基酸總量以及鮮味和甜味氨基酸含量均顯著下降（P＜0.05）（表1、2）。且在成熟的第0～5天時(shí)，EAA總量顯著上升（P＜0.05），而非EAA總量顯著下降（P＜0.05）。此外，在成熟的第14天，隨氧化強(qiáng)度的增加，總氨基酸含量、EAA、NEAA和呈味氨基酸總量均顯著下降。同時(shí)，不同氧化強(qiáng)度和成熟時(shí)間的交互作用對(duì)EAA、呈味氨基酸總量以及各呈味氨基酸（鮮味、甜味和苦味氨基酸）含量均有顯著的影響（P＜0.05）（表1、2）。根據(jù)FAO/WHO標(biāo)準(zhǔn)，優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的EAA/TAA在40%左右，EAA/NEAA在60%以上[31-32]，本實(shí)驗(yàn)各處理組EAA/TAA均大于40%，且在成熟5 d后EAA/NEAA也均大于60%，滿足FAO/WHO標(biāo)準(zhǔn)。

表2 牦牛肉成熟過(guò)程中呈味氨基酸含量的變化Table 2 Changes in taste-active amino acid contents during aging process of yak meat

2.1.2 兩種氧化體系下不同氧化強(qiáng)度對(duì)牦牛肉肌原纖維蛋白氨基酸含量的影響

兩種氧化體系、不同氧化強(qiáng)度處理牦牛肉肌原纖維蛋白氨基酸含量變化如表3所示。在兩種氧化體系下，牦牛肉肌原纖維蛋白中蘇氨酸、半胱氨酸和精氨酸的含量均隨氧化強(qiáng)度的增加而顯著降低（P＜0.05），其中，與對(duì)照組相比，在高氧化強(qiáng)度下，蘇氨酸、精氨酸和半胱氨酸含量在IOS中分別下降50.63%、47.05%和21.50%，而在MOS中蘇氨酸、精氨酸和半胱氨酸含量分別下降33.28%、47.88%和62.00%。本研究還發(fā)現(xiàn)，蛋氨酸、酪氨酸、甘氨酸、亮氨酸和賴氨酸的含量在兩個(gè)氧化體系中的變化不同，其中，在IOS中，蛋氨酸和酪氨酸含量隨氧化強(qiáng)度的增加而顯著下降（P＜0.05），而在MOS中這兩種氨基酸含量無(wú)顯著差異（P＜0.05）。與之相反的是，在MOS中，甘氨酸、亮氨酸和賴氨酸含量隨氧化強(qiáng)度的增加而顯著降低（P＜0.05），而在IOS中三者變化不顯著（P＞0.05）。以上結(jié)果表明，蛋氨酸和酪氨酸在IOS中敏感而亮氨酸和賴氨酸在MOS中敏感。此外，在同一氧化強(qiáng)度下，不同氧化體系對(duì)天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和賴氨酸有顯著影響（P＜0.05）。同時(shí)，兩種氧化體系和不同氧化強(qiáng)度的交互作用對(duì)天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、亮氨酸和賴氨酸含量均有顯著影響（P＜0.05）。

表3 兩種氧化體系不同氧化強(qiáng)度下牦牛肉肌原纖維蛋白的氨基酸組成Table 3 Amino acid composition of yak meat myofibrillar protein as a function of oxidation intensity in two oxidizing systems

在同一氧化體系中，隨著氧化強(qiáng)度的增加，氨基酸總量、EAA、NEAA和呈味氨基酸總量以及各呈味氨基酸含量（鮮味、甜味和苦味氨基酸）均顯著下降（P＜0.05）（表3、4），并且在相同氧化強(qiáng)度下，MOS中氨基酸總量、EAA、NEAA和呈味氨基酸含量均顯著低于IOS。此外，兩種氧化體系和不同強(qiáng)度二因素對(duì)總氨基酸含量、EAA、鮮味、甜味和苦味氨基酸含量均有極顯著的互作影響。

表4 兩種氧化體系不同氧化強(qiáng)度下牦牛肉肌原纖維蛋白的呈味氨基酸組成Table 4 Taste-active amino acid composition of yak meat myofibrillar protein as a function of oxidation intensity in two oxidizing systems

2.2 氨基酸營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)

兩種國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)模式下氨基酸含量如表5所示。

表5 FAO/WHO模式及全雞蛋蛋白模式中EAA含量Table 5 EAA contents in FAO/WHO pattern and whole egg protein pattern

2.2.1 不同氧化強(qiáng)度下牦牛肉成熟過(guò)程中氨基酸營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)

AAS、CS和EAAI越接近100%，則蛋白與評(píng)分模式氨基酸的組成越接近，越符合理想蛋白模式[33]。不同氧化強(qiáng)度下牦牛肉成熟過(guò)程中肌原纖維蛋白的AAS、CS和EAAI見表6。在牦牛肉成熟過(guò)程中，CS保持不變，第一限制性氨基酸始終為異亮氨酸。而AAS發(fā)生變化，在成熟第5天后不同氧化強(qiáng)度下第一限制性氨基酸由纈氨酸變?yōu)楫惲涟彼幔@與異亮氨酸在牦牛肉成熟過(guò)程中被氧化形成羰基化合物有關(guān)。同時(shí)，不同氧化強(qiáng)度下牦牛肉宰后成熟過(guò)程中EAAI均高于100%。

2.2.2 兩種氧化體系、不同氧化強(qiáng)度牦牛肉牛肌原纖維蛋白氨基酸營(yíng)養(yǎng)價(jià)值評(píng)價(jià)

兩種氧化體系、不同氧化強(qiáng)度牦牛肉肌原纖維蛋白的AAS、CS和EAAI見表7。將牦牛肌原纖維蛋白于IOS和MOS中進(jìn)行體外孵育實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，兩種氧化體系中不同氧化強(qiáng)度的CS始終保持不變，第一限制性氨基酸均為異亮氨酸。AAS結(jié)果顯示，IOS中的牦牛肉的第一限制性氨基酸均為纈氨酸，而MOS中，隨著氧化強(qiáng)度的增加，第一限制性氨基酸由纈氨酸變?yōu)榱涟彼?，這是因?yàn)镸OS對(duì)亮氨酸的氧化作用較強(qiáng)而使其含量顯著降低（P＜0.05）。同時(shí)，兩種氧化體系不同氧化強(qiáng)度牦牛肉EAAI也均大于100%。

表7 兩種氧化體系不同氧化強(qiáng)度牦牛肉肌原纖維蛋白AAS、CS和EAAITable 7 Amino acid scores (AAS), chemical scores (CS) and essential amino acid indexes (EAAI) of yak meat myofibrillar protein as a function of oxidation intensity in different oxidizing systems

2.3 主成分分析結(jié)果

2.3.1 不同氧化強(qiáng)度下牦牛肉成熟過(guò)程中肌原纖維蛋白氨基酸含量的主成分分析結(jié)果

主成分分析結(jié)果如表8所示。PC1和PC2分別解釋了52.11%和21.87%的方差貢獻(xiàn)率，累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)73.97%，基本反映了不同氧化強(qiáng)度下牦牛肉成熟過(guò)程中肌原纖維蛋白17 種氨基酸的大部分初始信息。因此，可提取前2 個(gè)主成分因子進(jìn)行討論分析，分析結(jié)果如圖1所示。PC1能夠明確區(qū)分成熟第0天和第1～14天時(shí)，時(shí)間對(duì)牦牛肉成熟過(guò)程中肌原纖維蛋白氨基酸含量變化的影響，可以作為成熟第0天和成熟第1～14天的區(qū)別因子；PC2能夠明確區(qū)分成熟第1～5天和第7～14天時(shí)牦牛肉肌原纖維蛋白氨基酸含量的變化，可作為成熟第1～5天和第7～14天的區(qū)別因子。

不同氧化強(qiáng)度下牦牛肉成熟過(guò)程中肌原纖維蛋白氨基酸變化的得分圖與載荷圖如圖1所示，牦牛肉成熟過(guò)程中，賴氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、甘氨酸、天冬氨酸和絲氨酸的變化明顯；在成熟的第1～5天，亮氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、纈氨酸和苯丙氨酸發(fā)生明顯變化；而在成熟的第7～14天，谷氨酸、組氨酸、丙氨酸和精氨酸的含量變化明顯，這一結(jié)果與表1結(jié)果相一致。

表8 不同氧化處理牦牛肉成熟過(guò)程中氨基酸主成分因子提取Table 8 Eigenvalues and contributions to total variance of principal components for amino acid contents in myofibrillar protein during aging process of yak meat with different oxidation treatments

圖1 不同氧化處理牦牛肉成熟過(guò)程中氨基酸含量得分圖（A）及相關(guān)載荷圖（B）Fig. 1 PCA score (A) and loading plots (B) of amino acid contents of myofibrillar protein during aging process of yak meat with different oxidation treatments

2.3.2 兩種氧化體系不同氧化強(qiáng)度牦牛肉肌原纖維蛋白氨基酸主成分分析結(jié)果

主成分分析結(jié)果如表9所示。根據(jù)累計(jì)貢獻(xiàn)率超過(guò)75%的標(biāo)準(zhǔn)，可提取前兩個(gè)主成分因子進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2所示，PC1可作為氧化強(qiáng)度的區(qū)別因子；PC2可作為IOS和MOS的區(qū)別因子。

兩種氧化體系、不同氧化強(qiáng)度牦牛肉肌原纖維蛋白氨基酸含量的前2 個(gè)主成分得分圖及相關(guān)載荷圖如圖2所示，兩種氧化體系、不同氧化強(qiáng)度牦牛肉肌原纖維蛋白中天冬氨酸、蘇氨酸、蛋氨酸、精氨酸、酪氨酸、組氨酸、賴氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、絲氨酸和亮氨酸的含量均發(fā)生明顯變化，而在IOS和MOS中，不同氧化強(qiáng)度下，丙氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、纈氨酸和谷氨酸無(wú)明顯變化，該結(jié)果與表2結(jié)果相一致。

表9 兩種氧化體系牦牛肉肌原纖維蛋白氨基酸主成分因子提取Table 9 Eigenvalues and contributions to total variance of principal components for amino acid contents of yak meat myofibrillar protein oxidized in two oxidizing systems

圖2 兩種氧化體系不同氧化強(qiáng)度牦牛肉肌原纖維蛋白氨基酸含量得分圖（A）及相關(guān)載荷圖（B）Fig. 2 PCA score (A) and loading plots (B) of amino acid contents of yak meat myofibrillar protein oxidized in two oxidizing systems

3 討 論

氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的氧化修飾在生物體中普遍存在，且由蛋白氧化所引起的氨基酸側(cè)鏈的氧化是導(dǎo)致肌肉蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值損失的重要原因[13]。大量研究表明，蛋白質(zhì)中所有氨基酸?；伎梢员换钚匝酰╮eactive oxygen species，ROS）等一種或多種活性物質(zhì)氧化[16,21]，本研究發(fā)現(xiàn)，牦牛肉成熟過(guò)程中，H2O2氧化處理會(huì)導(dǎo)致蘇氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、賴氨酸、絲氨酸、甘氨酸、纈氨酸和酪氨酸含量顯著下降。此外，氨基酸殘基與脂質(zhì)、糖類、氨基酸和谷胱甘肽等氧化產(chǎn)物反應(yīng)也會(huì)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)中氨基酸殘基發(fā)生間接氧化修飾[14]。然而，所有氨基酸對(duì)ROS等具有氧化活性的物質(zhì)均有不同的敏感性。其中半胱氨酸可能是最易受影響的氨基酸殘基，當(dāng)自由基攻擊半胱氨酸時(shí)，其反應(yīng)活性巰基發(fā)生氧化形成二硫鍵[10]，本實(shí)驗(yàn)在進(jìn)行不同氧化強(qiáng)度處理下牦牛肉成熟過(guò)程中肌原纖維蛋白氨基酸含量變化的研究時(shí)也發(fā)現(xiàn)，同一氧化強(qiáng)度下，隨成熟時(shí)間的延長(zhǎng)，半胱氨酸含量下降約42%，而蛋氨酸含量下降約10%，其中蛋氨酸（含硫氨基酸）含量降低可能是因發(fā)生氧化反應(yīng)而形成蛋氨酸亞砜衍生物[34]。已有研究表明，有活性側(cè)鏈的氨基酸（如氨基、巰基、硫醚）也易受一些活性物質(zhì)的氧化而形成羰基化合物[16,35-37]、蛋白分子間的交聯(lián)物[38]以及參與蛋白合成[39]。本研究也發(fā)現(xiàn)，牦牛肉成熟的第1天，各處理組含游離氨基基團(tuán)（ε-NH2）的蘇氨酸含量下降約50%，這可能與蘇氨酸因脫氨作用而轉(zhuǎn)化為羰基衍生物有關(guān)，同時(shí)，在牦牛肉成熟過(guò)程中，纈氨酸、異亮氨酸、酪氨酸、半胱氨酸和賴氨酸含量也顯著下降，這可能是因?yàn)槔i氨酸和異亮氨酸被氧化形成羰基化合物、酪氨酸和半胱氨酸氧化形成蛋白質(zhì)的交聯(lián)、賴氨酸參與蛋白質(zhì)的合成。此外，在牦牛肉成熟過(guò)程中，絲氨酸、亮氨酸和組氨酸含量隨著成熟時(shí)間的延長(zhǎng)而呈先上升后下降的趨勢(shì)，這可能是由于氧化使疏水性氨基酸基團(tuán)暴露，導(dǎo)致其含量上升，而隨氧化程度的增加，氨基酸被氧化，疏水性氨基酸含量又有所下降[21]。

引起肉類和肉制品蛋白氧化的3 種主要途徑（羥自由基氧化、高鐵肌紅蛋白氧化和脂質(zhì)氧化）中，羥自由基氧化和高鐵肌紅蛋白氧化是直接影響蛋白質(zhì)氧化的兩種主要途徑[1,4-6]，且不同氧化途徑對(duì)不同的氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)也有特異性[18-20]。該研究發(fā)現(xiàn)，在IOS和MOS中，蘇氨酸、半胱氨酸和精氨酸的含量均隨氧化強(qiáng)度的增加而顯著降低，而在這兩種氧化體系之間存在顯著差異的氨基酸包括蛋氨酸、酪氨酸、甘氨酸、亮氨酸和賴氨酸，其中，蛋氨酸和酪氨酸在IOS中具有較強(qiáng)的氧化敏感性，而甘氨酸、亮氨酸和賴氨酸在高鐵肌紅蛋白氧化敏感性較強(qiáng)。Park等[21]研究了3 種不同氧化體系下豬肉肌原纖維蛋白氨基酸的變化，結(jié)果表明，在IOS中，半胱氨酸、蛋氨酸和酪氨酸含量隨氧化強(qiáng)度的增加而顯著降低，而在MOS中，除半胱氨酸外，丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、亮氨酸和賴氨酸含量隨氧化強(qiáng)度的增加而顯著下降，其中，半胱氨酸對(duì)MOS最敏感，而酪氨酸在高氧化強(qiáng)度下對(duì)IOS最敏感，這與本研究結(jié)果類似，不同的是，本研究得出在兩個(gè)氧化體系中，隨氧化強(qiáng)度的增加，蘇氨酸和精氨酸含量也顯著下降，且這兩個(gè)氧化體系中最敏感的氨基酸分別為蘇氨酸和半胱氨酸，其中，與對(duì)照組相比，在高氧化強(qiáng)度下，半胱氨酸含量在MOS中下降62%，蘇氨酸含量在IOS中下降50.63%。而這兩種氧化體系中牦牛肉肌原纖維蛋白敏感性氨基酸存在差異可能是因?yàn)镮OS主要以羥自由基為主，而MOS除羥自由基外，還會(huì)生成鐵氧基和蛋白自由基等，這在崔文斌[13]和Park[21]的研究中也被證實(shí)。

綜上，由不同氧化機(jī)制和氧化強(qiáng)度所致游離氨基酸含量的變化會(huì)引起氨基酸總量、EAA、NEAA、呈味氨基酸含量以及氨基酸營(yíng)養(yǎng)價(jià)值發(fā)生一定的變化。本實(shí)驗(yàn)主要研究了不同氧化強(qiáng)度下牦牛肉成熟過(guò)程以及在IOS和MOS下不同氧化強(qiáng)度對(duì)牦牛肉肌原纖維蛋白氨基酸含量的影響，但對(duì)其氧化機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

在IOS和MOS中蘇氨酸、半胱氨酸和精氨酸含量均隨氧化強(qiáng)度增加而顯著降低，其中蘇氨酸和半胱氨酸含量在成熟過(guò)程中的變化一致。不同的是，在成熟過(guò)程中，甘氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和酪氨酸等氨基酸含量顯著下降。兩種氧化體系中的敏感性氨基酸不同，IOS中蛋氨酸和酪氨酸含量隨氧化強(qiáng)度的增加而顯著下降，而在MOS中，甘氨酸、亮氨酸和賴氨酸含量隨氧化強(qiáng)度的增加而顯著降低。因此，與單獨(dú)氧化體系相比，牦牛肉成熟過(guò)程中氨基酸殘基的氧化僅限于甘氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和酪氨酸等少數(shù)幾個(gè)氨基酸。