何雯潔++洪倩　梁靜　何曉瑋　朱逢佳

[摘要] 制備尼莫地平/川芎嗪雙載藥納米粒（NMD/TMPNPs），考察其體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)行為和腦組織分布情況，探討雙載藥納米粒用于提高藥物療效的可能性。該試驗(yàn)采用復(fù)乳法制備NMD/TMPNPs，超速離心法測其包封率和載藥量，透析法測其體外釋放，并以NMD混懸液、NMD/TMP混懸液、NMDNPs混懸液、（NMDNPs+TMP）混懸液為對照組，考察大鼠尾靜脈注射NMD/TMPNPs混懸液后NMD的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)行為和腦內(nèi)分布情況。所制備納米粒中NMD的包封率和載藥量分別為（79.71±0.73）%， （1.74±0.02）%，TMP的包封率和載藥量為（40.26±1.51）%， （4.38±0.16）%；制成納米粒后，其體外釋放具有緩釋特點(diǎn)。體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)和組織分布主要參數(shù)：NMD混懸液、NMD/TMP混懸液、NMDNPs混懸液、（NMDNPs+TMP）混懸液、NMD/TMPNPs混懸液t1/2β分別為（1.097±0.146），（1.055±0.06），（1.950±0.140），（1.860±0.096），（2.497±0.475） h，CL分別為（0.778±0.098），（1.133±0.111），（0.247±0.023），（0.497±0.040），（0.297±0.024） h·L-1，AUC0∞分別為（514.218±60.383），（352.916±33.691），（1 618.429±240.198），（804.110±75.804），（1 349.058±215.497） μg·h·L-1；各組腦內(nèi)AUC0t分別為0.301 9，0.624 8，1.068 6，1.313 0，1.046 5 mg·h·L-1。結(jié)果表明NPs延緩了NMD在體內(nèi)的消除，加入TMP或制備為雙載藥納米粒均可明顯改善NMD體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)行為，并顯著提高NMD腦內(nèi)含量。

[關(guān)鍵詞] 川芎嗪； 尼莫地平； 雙載藥納米粒； 藥動(dòng)學(xué)； 腦內(nèi)分布

Pharmacokinetics and brain distribution of NMD/TMPnanoparticles

HE Wenjie1， HONG Qian1， LIANG Jing1， HE Xiaowei2， ZHU Fengjia1*

（1. Zhejiang Hospital， Hangzhou 310012， China；

2. The First Hospital Affiliated to Huzhou Teachers′ University， Huzhou 313000， China）

[Abstract] This study aims to prepare nimodipine/tetramethylpyrazineloaded poly（D， Llactidecoglycolide） dualdrug nanoparticles （NMD/TMPNPs） and investigate pharmacokinetics and brain distribution to evaluate the possibility of enhancing the drug effect of dualdrug nanoparticles. NMD/TMPNPs were prepared via W/O/W emulsion solvent evaporation. Entrapment efficiency and drug loading of NMD/TMPNPs were investigated by ultracentrifugation， and drug release behavior in vitro was studied by dialysis method. The pharmacokinetic and brain distribution were studied in SD mice administered intravenously with NMD/TMPNPs in comparison with NMDsuspension， NMD/TMPsuspension and NMDNPs， （NMDNPs+TMP）suspension. According to the results， the entrapment efficiency and drug loading of NMD were （79.71±0.73）%， （1.74±0.02）%， those of TMP were （40.26±1.51）% and （4.38±0.16）%. The nanoparticles showed the property of sustained release. On the basis of the major parameters for in vivo pharmacokinetic and brain distribution， t1/2β of NMDsuspension， NMD/TMPsuspension and NMDNPs， （NMDNPs+TMP）suspension， NMD/TMPNPs were （1.097±0.146）， （1.055±0.06）， （1.950±0.140）， （1.860±0.096）， （2.497±0.475） h， CL were （0.778±0.098）， （1.133±0.111）， （0.247±0.023）， （0.497±0.040）， （0.297±0.024） h·L-1， AUC0t in rat plasma were （514.218±60.383）， （352.916±33.691）， （1 618.429±240.198）， （804.110±75.804）， （1 349.058±215.497） μg·h·L-1， respectively， and AUC0t in brain were 0.301 9， 0.624 8， 1.068 6， 1.313 0， 1.046 5 mg·h·L-1， respectively. According to the in vivo study， the pharmacokinetic behavior of NMD were markedly prolonged by adding TMP or prepared dualdrug nanoparticles.

[Key words] nimodipine； tetramethylpyrazine； dualdrug nanoparticle； pharmacokinetics； brain distribution

doi：10.4268/cjcmm20162227

川芎嗪（tetramethylpyrazine，TMP）為一類具有多藥耐藥逆轉(zhuǎn)（multidrug resistance，MDR）調(diào)節(jié)功能的吡嗪類生物堿，具有疏通血脈、促進(jìn)血行、消散淤血的功效，臨床上多用于擴(kuò)張腦血管、抑制血小管平滑肌痙攣等。文獻(xiàn)表明川芎嗪具有限制Pglycoprotein（Pgp）底物外排的作用[1]，可通過抑制Pgp的ATP酶活性來抑制Pgp的功能[23]。尼莫地平（nimodipine，NMD）為一類二氫吡啶類鈣離子拮抗劑，臨床上多用于治療腦血管疾病[4]，但其作為Pgp的底物，易受血腦屏障（bloodbrain barrier，BBB）上Pgp外排作用影響，致使其腦內(nèi)濃度較低[5]。因此將TMP與NMD合用，有望提高NMD腦內(nèi)濃度，但NMD和TMP簡單合用，一方面由于TMP血漿清除率較高[6]且易被腦組織清除[7]，限制了其抑制Pgp功能的作用；另一方面，短時(shí)間內(nèi)TMP濃度過高易導(dǎo)致腦內(nèi)NMD濃度過高，對正常細(xì)胞或組織產(chǎn)生毒性[8]，故本試驗(yàn)擬制備川芎嗪/尼莫地平雙載藥納米粒合用兩藥，并考察川芎嗪對尼莫地平體內(nèi)過程的影響。

1 材料

Agilent 1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司）； Labconco冷凍干燥機(jī)（美國Labconco公司）；TGL16G高速臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；VORTEX5型渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；減壓干燥器（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

聚乙二醇（聚乳酸羥基乙酸）（濟(jì)南岱罡生物工程有限公司，相對分子質(zhì)量18 000）；尼莫地平對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號10027020002）；尼莫地平原料藥（湖北恒碩藥業(yè)有限公司，純度98%，批號20130625）；鹽酸川芎嗪對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110817201006）；鹽酸川芎嗪原藥（南通飛宇生物有限公司，純度98%，批號FY17610610）；甲醇（美國Honeywell Burdick&Jackson公司）；肝素鈉（中國江蘇常州千紅生化制藥股份有限公司，批號110921）；水合氯醛（上海強(qiáng)順化學(xué)試劑有限公司，批號20090401）；生理鹽水（石家莊鵬海制藥有限公司，批號1208122040）；乙腈（天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司，批號30333203514）；乙醚（中國杭州化學(xué)試劑有限公司，批號20100421）；正己烷（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，批號20131023）；其他試劑均為分析純。

清潔級SD大鼠（220±10） g，浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物使用編號SCXK（浙20080036）。所有動(dòng)物試驗(yàn)均按照浙江大學(xué)動(dòng)物飼養(yǎng)和使用指南進(jìn)行。

2 方法與結(jié)果

2.1 尼莫地平/川芎嗪雙載藥納米粒的制備

2.1.1 雙載藥納米粒的制備方法 稱取1 mg NMD和40 mg mPEGPLGA溶于乙酸乙酯中構(gòu)成有機(jī)相，稱取5 mg TMP溶于水中構(gòu)成內(nèi)水相，稱取適量PVA溶于水中構(gòu)成外水相（調(diào)節(jié)pH為9.0），稱取適量PVA溶于水中構(gòu)成分散相。將內(nèi)水相加入到有機(jī)相中超聲獲得初乳，將初乳迅速加入至外水相中超聲獲得復(fù)乳，將復(fù)乳滴加到分散相中攪拌即得到NMD/TMPNPs。

2.1.2 雙載藥納米粒的質(zhì)量評價(jià) 經(jīng)2.1.1工藝制備的NMD/TMPNPs外觀呈類圓形，表面光滑，粒徑?。?76 nm左右），粒徑分布窄（PDI<0.1），NMD的包封率為（79.71±0.73）%，載藥量為（1.74±0.02）%，TMP包封率為（48.26±1.13）%，載藥量為（5.24±0.12）%。

2.1.3 雙載藥納米粒的體外釋放考察 本試驗(yàn)采取透析法考察其體外釋放特性。NMD/TMPNPs體外釋放過程中NMD和TMP均符合Weibull方程，分別為Q=0.504t-1.898 4（R2=0.987 6）和Q=0.513 5t-1.608 9（R2=0.988 4）。其體外釋放曲線見圖1。

2.2 體內(nèi)尼莫地平的含量測定

2.2.1 色譜條件 Thermo Hypersil Gold C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相甲醇水（62∶38），流速1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；檢測波長238nm；進(jìn)樣體積20 μL。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取適量NMD，TMP于10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，得NMD/TMP對照品溶液。

2.2.3 血漿樣品處理方法 精密移取血漿樣品200 μL置2 mL具塞離心管中，加入乙腈800 μL，渦旋混合3 min，1萬 r·min-1離心10 min，取上清液于40 ℃用氮?dú)饬鞔蹈?，殘?jiān)?00 μL甲醇溶解，充分渦旋振蕩后1萬 r·min-1離心10 min，取上清液20 μL進(jìn)樣分析。

2.2.4 腦組織樣品處理方法 將腦組織按1∶4加入生理鹽水，高速勻漿器8 000 r·min-1勻漿10 min，取勻漿100 μL于2 mL離心管中，加入乙醚正己烷（1∶1）1.5 mL，渦旋5 min，超聲10 min后，5 000 r·min-1離心10 min，取上清液于2 mL離心管中用氮?dú)饬鞔蹈?，殘?jiān)?00 μL甲醇溶解，充分渦旋后1萬 r·min-1離心10 min，取上清液20 μL進(jìn)樣分析。

2.2.5 血漿內(nèi)NMD含量測定方法 標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密稱取減壓干燥至恒重的NMD對照品適量，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，配成質(zhì)量濃度為1 427 mg·L-1的對照品溶液，臨用前稀釋至系列濃度。精密吸取空白血漿1 mL 7份，分別加入系列濃度的對照品溶液20 μL，渦旋混合，得質(zhì)量濃度分別為0.356 7，0.713 5，1.783 7，3.567 5，7.135 0，17.837，35.675，71.350，142.70 mg·L-1的NMD系列血漿對照溶液，按2.2.3項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣測定，以峰面積（A）對血漿中NMD的濃度（C）進(jìn)行線性回歸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。計(jì)算得血漿中NMD的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=73.823C-23.23（r=0.999 3），表明NMD血漿質(zhì)量濃度在0.356 7～142.70 mg·L-1線性關(guān)系關(guān)系良好。

精密度：取低、中、高3個(gè)濃度供試品溶液進(jìn)樣測定，分別在日內(nèi)測定5次，連續(xù)測定5 d（每天1次），計(jì)算日內(nèi)和日間精密度。其日內(nèi)精密度分別為4.7%，2.4%，2.9%，日間精密度分別為3.7%，2.9%，2.8%。

提取回收率：精密量取含NMD低、中、高3個(gè)濃度的NMD/TMP溶液，加入200 μL空白血漿中，渦旋2 min，混勻，配成質(zhì)量濃度為50.00，100.00，200.00 μg·L-1的血漿樣品，按2.2.3項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析；另配制含NMD低、中、高3個(gè)相同濃度的NMD/TMP對照品溶液，不加空白血漿，直接揮干進(jìn)樣測定，計(jì)算血漿樣品經(jīng)處理后的峰面積與對照溶液峰面積的比值，每個(gè)濃度平行測定3次。其提取回收率為（69.33±5.24）%，（72.88±6.99）%，（72.53±2.03）%。

2.2.6 腦組織內(nèi)NMD含量測定方法 腦組織標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密稱取減壓干燥至恒重的NMD對照品適量，置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，配成質(zhì)量濃度為15.00 mg·L-1的對照品溶液，臨用前稀釋至系列濃度。精密吸取空白組織勻漿100 μL 8份，分別加入系列濃度的對照品溶液20 μL，渦旋混合，得質(zhì)量濃度分別為0.01，0.03，0.06，0.15，0.60，1.50，3.00，6.00 mg·L-1的NMD系列組織勻漿對照溶液，按2.2.4項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣測定，以峰面積（A）對組織中NMD的濃度（C）進(jìn)行線性回歸，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。計(jì)算得組織勻漿中NMD的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=110.32C+4.351 2（r=0.999 8），表明NMD組織勻漿質(zhì)量濃度在0.01～6.00 mg·L-1線性關(guān)系良好。

精密度考察：取低、中、高3個(gè)濃度供試品溶液進(jìn)樣測定，分別在日內(nèi)測定5次，連續(xù)測定5 d（每天1次），計(jì)算日內(nèi)和日間精密度。其日內(nèi)精密度分別為6.9%，4.2%，4.0%，日間精密度分別為4.0%，3.2%，3.1%。

提取回收率考察：精密量取含NMD低、中、高3個(gè)濃度的NMD/TMP溶液，加入200 μL空白腦組織中，渦旋2 min，混勻，配成質(zhì)量濃度為0.01，0.15，1.50 mg·L-1的血漿樣品，按2.2.4項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析；另配制含NMD低、中、高3個(gè)相同濃度的NMD/TMP對照品溶液，不加空白血漿，直接揮干進(jìn)樣測定，計(jì)算血漿樣品經(jīng)處理后的峰面積與對照溶液峰面積的比值，每個(gè)濃度平行測定3次。其提取回收率為（72.38±6.04）%，（76.97±4.54）%，（78.26±2.66）%。

2.3 體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)研究

稱取適量NMD和NMD/TMP原藥粉末于10 mL量瓶中，用適量乙醇超聲溶解，用0.9%生理鹽水稀釋至刻度，得NMD混懸液和NMD/TMP混懸液。稱取適量NMDNPs和NMD/TMPNPs凍干粉于10 mL量瓶中，用適量0.9%生理鹽水超聲溶解并稀釋至刻度，得NMDNPs和NMD/TMPNPs混懸液。稱取適量NMDNPs和TMP原藥粉末于10 mL量瓶中，用適量0.9%生理鹽水超聲溶解并稀釋至刻度，得（NMDNPs+TMP）混懸液。

取健康SD大鼠30只，禁食12 h，自由飲水，隨機(jī)分為5組，每組6只。按NMD 2 mg·kg-1單劑量尾靜脈注射分別給予NMD混懸液、NMD/TMP混懸液、NMDNPs混懸液、NMD/TMPNPs混懸液和（NMDNPs+TMP）混懸液，給藥后分別于5，15，30，60，120，240，360，480，600，720 min經(jīng)股動(dòng)脈取血0.5 mL，置肝素鈉預(yù)處理的2 mL具塞離心管中， 6 000 r·min-1離心5 min，分離血漿后，置-80 ℃低溫冰箱保存待測。每次取血后立即用注射器給予等量的0.9%生理鹽水。

大鼠尾靜脈注射NMD混懸液、NMD/TMP混懸液、NMDNPs混懸液、NMD/TMPNPs混懸液和（NMDNPs+TMP）混懸液后，平均血藥濃度時(shí)間曲線見圖2。數(shù)據(jù)經(jīng)擬合后符合開放式二室模型，所得主要藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表1，并對其進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.4 腦組織分布研究

稱取適量NMD原料藥于10 mL量瓶中，用適量乙醇超聲溶解后，加入0.9%生理鹽水稀釋至刻度，得NMD混懸液。稱取適量NMD原料藥和TMP原料藥于10 mL量瓶中，用適量乙醇超聲溶解后，加入0.9%生理鹽水稀釋至刻度，得NMD/TMP混懸液。稱取適量NMDNPs和NMD/TMPNPs凍干粉于10 mL量瓶中，用適量0.9%生理鹽水超聲溶解并稀釋至刻度，分別得NMDNPs混懸液和NMD/TMPNPs混懸液。稱取適量NMDNPs凍干粉和TMP原料藥溶于10 mL量瓶中，用適量0.9%生理鹽水超聲溶解并稀釋至刻度，得（NMDNPs+TMP）混懸液。

取健康SD大鼠60只，禁食12 h，自由飲水，隨機(jī)分為5組，每組12只，按NMD 2 mg·kg-1單劑量尾靜脈注射分別給予NMD混懸液、NMD/TMP混懸液、NMDNPs，NMD/TMPNPs和（NMD/TMPNPs+TMP），給藥后分別于0.25，2，4，6 h（每個(gè)時(shí)間點(diǎn)平行3只大鼠）頸椎脫臼處死，迅速取出腦組織用生理鹽水沖洗，然后用濾紙吸干，置-80 ℃低溫冰箱保存待測。

大鼠尾靜脈注射NMD混懸液，NMD/TMP混懸液，NMDNPs，NMD/TMPNPs和（NMDNPs+TMP）后，按上述方法操作，并按2.2.6項(xiàng)下方法處理樣品后進(jìn)樣分析。結(jié)果見圖3，NMD混懸液，NMD/TMP混懸液，NMDNPs，NMD/TMPNPs和（NMDNPs+TMP）中腦內(nèi)AUC0t分別為0.301 9，0.624 8，1.068 6，1.313 0，1.046 5 mg·h·L-1。

由圖3可知，給藥0.25 h時(shí)，NMD/TMPNPs組在腦內(nèi)藥物濃度達(dá)到最大值（0.713 2±0.070 3） mg·L-1；給藥4 h時(shí)，（NMDNPs+TMP）組在腦內(nèi)藥物濃度達(dá)到最大值（0.343 4±0.148 2） mg·L-1；給藥6 h時(shí)，NMDNPs組在腦內(nèi)藥物濃度達(dá)到最大值（0.345 2±0.025 9）mg·L-1；給藥4 h時(shí)，在試驗(yàn)條件下NMD組和NMD/TMP組在腦內(nèi)均未檢測到藥物。

3 討論

藥動(dòng)學(xué)研究結(jié)果顯示：與單用NMD組相比，兩藥聯(lián)用組t1/2α顯著降低（P<0.01），這與其他藥物和Pgp抑制劑聯(lián)用研究結(jié)果相符[9]，t1/2α降低提示TMP可能在一定程度上促進(jìn)了NMD向組織的分布[10]，降低了藥物在血漿內(nèi)滯留時(shí)間，有效發(fā)揮了Pgp抑制劑的作用；而制備成雙載藥納米粒后，TMP依然能夠改善NMD的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)行為，說明NPs并未明顯影響TMP對NMD體內(nèi)分布的促進(jìn)作用，同時(shí)避免了藥物半衰期短的缺點(diǎn)。

組織分布研究結(jié)果顯示：與單藥組比較，雙藥組入腦速度均更快，AUC0t均顯著提高（P<0.01），說明TMP具有促進(jìn)NMD入腦的作用，其原因一則可能是TMP抑制了Pgp 的ATP酶活性，二則可能是TMP提前釋放，并作為Pgp抑制劑與Pgp結(jié)合并使其飽和，2種原因作用下Pgp功能受到抑制，使得NMD更易入腦[1112]；與原藥組比較，納米粒組均能緩慢分布于腦組織且滯留時(shí)間更長，提示NPs具有一定的緩釋作用，并且雙載藥不影響該特性；與NMD組和NMDNPs組比較，NMD/TMPNPs組顯著提高了NMD在腦內(nèi)的濃度，說明雙載藥納米粒在實(shí)現(xiàn)同時(shí)包載藥物和Pgp抑制劑的同時(shí)，并未喪失NPs緩釋高效的優(yōu)勢。

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[責(zé)任編輯 曹陽陽]