冷脅迫方式對太平洋牡蠣無水?；钇谘趸瘧ぜ澳芰肯牡挠绊?/h1>
2022-03-31 09:04林恒宗高加龍梁志源范秀萍林海生曹文紅黃艷平秦小明
廣東海洋大學學報 2022年2期
林恒宗，高加龍，梁志源，范秀萍，林海生，曹文紅，黃艷平，秦小明
冷脅迫方式對太平洋牡蠣無水?；钇谘趸瘧ぜ澳芰肯牡挠绊?/p>
林恒宗1,2，高加龍1,2，梁志源1，范秀萍1,2，林海生1,2，曹文紅1,2，黃艷平1，秦小明1,2
（1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東 湛江 524025；2.國家貝類加工技術研發(fā)分中心（湛江）// 廣東省水產品加工與安全重點實驗室 // 廣東省海洋食品工程技術研發(fā)中心 // 廣東省海洋生物制品工程重點實驗室 // 水產品深加工廣東普通高校重點實驗室，廣東 湛江 524088）
【目的】系統(tǒng)分析太平洋牡蠣() ?；钸\輸前的預冷方式及溫度脅迫對其氧化免疫系統(tǒng)、能量物質代謝的影響，篩選出較好的無水保活前預冷方式。【方法】分別采用散冰自然降溫、急性連續(xù)降溫、線性勻速降溫、梯度降溫4種低溫誘導休眠方式處理牡蠣，并探討不同誘導休眠方式對牡蠣生態(tài)冰溫無水保活期的存活率、失重率、抗氧化能力以及能量物質代謝的影響。【結果】1）梯度和線性降溫牡蠣冰溫?；? d其存活率及失重率優(yōu)于散冰和急性降溫組。2）各組牡蠣在整個保活期內抗氧化酶活力均升高，且散冰降溫組顯著高于急性、線性和梯度降溫組(< 0.05)；散冰和急性降溫組丙二醛(MDA) 含量呈明顯上升趨勢，而線性和梯度降溫組先降后升高；各不同降溫組過氧化氫(H2O2) 含量則先升后降；總抗氧化能力(T-AOC) 隨脅迫時間延長呈上升趨勢。3）散冰降溫組在整個?；钇趦饶芰课镔|均顯著低于各組(< 0.05)，保活9 d后線性和梯度降溫組水分、糖原、脂肪含量高于各組，乳酸含量則低于各組?！窘Y論】采用線性和梯度降溫方式誘導牡蠣進入生態(tài)冰溫休眠狀態(tài)后開始無水?；?，有利于減緩牡蠣在冷脅迫下抗氧化酶活力及脂質過氧化的影響，且保活時間更長，失重率更低，能量代謝物質損失較少，更有利于牡蠣長時間無水?；?。
太平洋牡蠣；休眠方式；生態(tài)冰溫；無水?；睿谎趸瘧?；能量代謝
太平洋牡蠣 () 是我國產量最高的牡蠣品種，主要分布在遼寧、山東等長江以北地區(qū)。牡蠣不僅味道鮮美且富含蛋白質、糖原、氨基酸、微量元素及維生素等營養(yǎng)物質[1-2]，深受消費者青睞。牡蠣在我國主要以鮮銷為主，但當前產業(yè)中牡蠣無水?；盍魍ㄗ鳂I(yè)時缺乏系統(tǒng)的降溫預冷工藝技術，鮮活牡蠣采捕后大多采用泡沫箱加冰強迫其進入休眠狀態(tài)，后進入?；盍魍üば?。然而，大幅降溫會導致機體產生大量活性氧 (Reactive Oxygen Species，ROS)，ROS會對細胞造成損傷、組織正常的生理機能和免疫防御能力產生不可逆的損害，從而影響其存活質量[3]。在蝦夷扇貝 ()[4]、皺紋盤鮑 (HannaiIno)[5]、溢蟶 ()[6]、巖扇貝 ()[7]、魁蚶 ()[8]等貝類的研究中都已證實溫度急劇變化對抗氧化系統(tǒng)及生理代謝產生直接影響。因此，合理的降溫方式對延長貝類?；顣r間和保持貝類鮮度品質非常重要。目前關于太平洋牡蠣?；钸\輸前的預冷方式及溫度脅迫對其氧化免疫系統(tǒng)、能量物質代謝的研究鮮有報道。因此，本研究模擬當前國內太平洋牡蠣流通模式，將新鮮捕撈的牡蠣運抵實驗室后暫養(yǎng)凈化，采用不同降溫方式對凈化后的牡蠣進行誘導休眠處理，探索降溫方式對牡蠣生態(tài)冰溫?；钸^程中氧化應激及能量物質的影響，以期為雙殼貝類?；钋疤幚砉ば颉⒌蜏乇；钸\輸條件優(yōu)化提供技術和理論參考。
1 材料與方法
1.1 材料
鮮活太平洋牡蠣 (），2021年3月購自山東威海燈塔水母海洋科技有限公司，采捕后挑選富有活力、雙殼完整、規(guī)格相近的帶泥個體作為研究對象，迅速分裝于套有內膜保濕袋的泡沫箱中，裝箱前及裝箱完成后在其表面與底面平鋪一層約3 ～ 5 cm海水冰，且用吸水海綿與貝體隔開，經專用牡蠣冷鏈運輸車運輸48 h后運抵廣東海洋大學水產品?；盍魍▽嶒炇視吼B(yǎng)凈化，以消除捕撈和運輸操作時應激反應。牡蠣的平均生物學指標見表1。
表1 太平洋牡蠣生物學指標
1.2 主要儀器設備與試劑
貝類暫養(yǎng)凈化系統(tǒng)，廣州創(chuàng)嶺水產有限公司；GXG-1低溫恒溫層析柜，江蘇盛藍儀器有限公司； JK-8多點溫度計，常州金艾聯(lián)公司；Varioskan Flash全自動酶標儀，美國Thermo公司；VAP450全自動凱氏定氮儀，德國Gerhardt公司；SZF-06A粗脂肪測定儀，上海洪記儀器設備有限公司；HX204鹵素水分測定儀，瑞士梅特勒公司。
超氧化物歧化酶 (SOD)、過氧化氫酶 (CAT)、過氧化物酶 (POD)、谷胱甘肽過氧化物酶 (GSH-PX)、丙二醛 (MDA)、過氧化氫 (H2O2)、總抗氧化能力 (T-AOC)、糖原 (Gn)、乳酸 (LD)、蛋白質含量檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。其余化學試劑為分析純。
1.3 設計與方法
1.3.1 人工海水配制 在貝類凈化系統(tǒng)中按太平洋牡蠣養(yǎng)殖海域鹽度 (31±0.5)[9]，用海水晶配制人工海水，開啟增氧設備持續(xù)曝氣24 h，通臭氧至海水臭氧質量濃度為0.15 mg/L，以流速2.5 m3/h通過紫外燈管進行滅菌，設定水溫25 ℃循環(huán)預冷備用。
1.3.2 牡蠣暫養(yǎng)凈化 采用滅菌人工海水清洗牡蠣表面附著物，將清洗后的牡蠣放入塑料筐 (600 mm × 420 mm × 315 mm) 置于貝類凈化系統(tǒng)中，參照慕翠敏等[10]和費星等[11]的人凈化工藝條件進行凈化：水溫25 ℃，貝水質量（kg）體積（L）比1：20，臭氧質量濃度0.15 mg/L，于鹽度31的紫外循環(huán)滅菌人工海水中凈化24 h，塑料筐與槽底距離2.5 cm以上防止二次污染。
1.3.3 牡蠣生態(tài)冰溫的確定 臨界溫度測定參照儲建軍等[12]方法。挑選凈化后富有活力的牡蠣20只放入裝有人工海水的透明玻璃容器內 (320 mm × 150 mm × 212 mm) 內，通過調節(jié)低溫恒溫設備及加入人工海水冰塊進行緩慢降溫，同時觀察箱內牡蠣的存活狀態(tài)和對外界刺激的反應情況。牡蠣雙殼自然張開，剌激反應微弱甚至無反應作為臨界溫度點。
結冰點測定參照徐德峰等[13]實驗方法。挑選凈化后富有活力的牡蠣10只，將多點溫度計溫度探針插入牡蠣肌肉內部，置于-20 ℃低溫冰箱中，每5 s記錄肌肉內部的溫度，直到個體完全凍結。以時間為橫坐標，溫度為縱坐標繪制凍結曲線，根據凍結曲線拐點確定結冰點。由上述臨界溫度和凍結點測定結果及生態(tài)冰溫定義確定太平洋牡蠣生態(tài)冰溫范圍。
1.3.4 牡蠣誘導休眠方法 將凈化后挑選的600只太平洋牡蠣隨機分為4組，每組150只，參照郝爽等[7]降溫方法并加以改進，分別采用4種降溫誘導休眠方式。其中散冰降溫處理方式為：將牡蠣分裝于泡沫箱中（450 mm × 250 mm × 200 mm），約5 kg/箱，裝箱前后在其四周及表層平鋪淡水冰，加蓋后放置在0 ℃的恒溫層析柜中開始無水保活。另外三種降溫方式則是將牡蠣分裝于?；钏芰峡鹬校芰峡鸬乃闹芗氨砻婢采w一層浸足滅菌海水的海綿，為保證環(huán)境濕度，每12 h向海綿噴淋滅菌海水。急性降溫的處理方式為直接將牡蠣置于0 ℃的層析柜中，開始無水?；?；線性及梯度降溫速率參照胡益鳴等[14]的實驗結果，通過調節(jié)恒溫層析柜，以5 ℃/h的降溫速率從（25±0.5）℃降至（0±0.5）℃后開始無水?；?，其中梯度降溫組牡蠣溫度每下降5℃停留90min。各實驗組牡蠣在誘導休眠結束后開始無水?；罟ば?，保活周期為9 d，分別在降溫前（BC）、降溫后（AC）及?；钇诿刻毂O(jiān)測牡蠣存活及失重情況，另取腮和肌肉組織檢測相關生化指標。
1.4 樣品采集、制備與指標測定
1.4.1 存活及失重率監(jiān)測 檢活方法參照高加龍等[15]實驗方法，每24 h觀測牡蠣的貝殼張開情況，能自由閉合為活貝，不能閉合為死貝，依據存活及死亡數(shù)量繪制存活曲線。失重率監(jiān)測參照申淑琦等[16]實驗方法，選取個體差異較小、規(guī)格相近、富有活力的牡蠣20只，每天記錄總質量。失重率為?；钋昂竽迪犢|量損失與初始質量之比。
1.4.2 抗氧化酶活力測定 每組隨機取9只牡蠣，迅速開殼取鰓，用預冷質量分數(shù)為0.86%生理鹽水漂洗，吸水紙拭干表面水分，按質量（g）體積(mL)比1：9的比例加入預冷生理鹽水進行冰浴機械勻漿，將制備好的體積分數(shù)為10%的勻漿液在4 ℃下以12 000 r/min的轉速離心10 min，取上清于潔凈EP管中，立即測定或-80 ℃凍存待測。嚴格按照試劑盒操作規(guī)程檢測腮組織中蛋白質含量、SOD、CAT、POD、GSH-PX、MDA、H2O2、T-AOC酶活力，結果以蛋白濃度計算。
1.4.3 能量代謝指標測定 每組隨機取15只牡蠣，迅速開殼刨取牡蠣全臟器，用預冷的質量分數(shù)為0.86%生理鹽水漂洗，吸水紙拭干表面水分，采用高速勻漿機攪碎成肉糜狀，分裝，立即測定或-80 ℃凍存待測。嚴格按照試劑盒操作規(guī)程檢測肌肉組織中Gn、LD含量。水分、粗蛋白、粗脂肪含量分別按照國標GB 5009.3-2016、GB 5009.5-2016、GB 5009.6-2016測定。
1.5 數(shù)據分析
實驗結果均平行測定三次，數(shù)據采用平均值±標準偏差表示，對非正態(tài)分布數(shù)據存活率采用平方根反正弦變換后進行統(tǒng)計分析，對試驗結果采用統(tǒng)計分析軟件SPSS 26.0進行單因素方差分析 (One-Way ANOVA) 及組間差異采用Duncan多重比較，顯著性水平設為0.05。
2 結果與分析
2.1 太平洋牡蠣生態(tài)冰溫零點測定
太平洋牡蠣在緩慢降溫過程中的行為特征如表2所示。在5 ℃以上太平洋牡蠣生理活動正常；當溫度降至5 ℃時，應對外界刺激反應緩慢；3 ℃時基本無濾水表征現(xiàn)象，置于室溫條件下能緩慢閉殼，表明太平洋牡蠣此時處于半休眠狀態(tài)；0 ℃時對外界刺激已無任何反應，但置于常溫人工海水能恢復正常濾水現(xiàn)象；-1℃時對外界刺激無反應，殼邊緣出現(xiàn)微凍現(xiàn)象，溫度繼續(xù)降低成活率下降。判定牡蠣生態(tài)冰溫零點約為0 ℃。
表2 不同溫度下太平洋牡蠣活動狀態(tài)
2.2 太平洋牡蠣結冰點測定
只有確定太平洋牡蠣耐受低溫極限溫度，才能通過控制適當?shù)蜏厥鼓迪犔幱谛菝郀顟B(tài)且不至于溫度過低導致死亡。由圖1可見，當溫度降至-1.7 ℃時，牡蠣體內釋放出大量潛熱，此階段牡蠣肌肉降溫速度緩慢，甚至溫度維持不變，因此得出太平洋牡蠣結冰點為-1.7 ℃，溫度繼續(xù)下降將導致肌肉結冰而引起牡蠣死亡。結合牡蠣生態(tài)冰溫零點，太平洋牡蠣在無水?；钸^程中溫度范圍控制在-1.7 ～ 0 ℃。根據研究結果，機體越接近冰點溫度易造成冷脅迫損傷，因此，在生態(tài)冰溫?；钸^程中溫度應盡量遠離冰點溫度。
2.3 冷脅迫方式對太平洋牡蠣無水?；钇谏w征的影響
2.3.1 存活分析 不同降溫方式對太平洋牡蠣無水保活過程存活曲線變化如圖2所示。在冷脅迫下太平洋牡蠣存活率隨?；顣r間延長均呈明顯右移趨勢。散冰自然降溫組在?；? d開始出現(xiàn)死貝，急性連續(xù)降溫組在保活2 d開始出現(xiàn)死貝，梯度和線性勻速降溫組在保活3 d出現(xiàn)死貝；對比4種不同降溫方式，梯度降溫組存活率最高，散冰自然降溫組最低，?；? d全部死亡；梯度、線性、急性降溫組?；? d后存活率分別為90%、85%、79%?？梢姡禍仡A冷方式對雙殼貝類無水?；钸^程中存活率有較大影響。同時說明脅迫強度越大會加速太平洋牡蠣生理代謝, 降低機體對環(huán)境的適應能力，引起死亡，并隨著時間延長而加劇，本實驗?；顥l件下太平洋牡蠣的存活率與香港牡蠣 () ?；罱Y果接近(?；? d，存活率95%)[15]。
方框指示太平洋牡蠣凍結溫度點
圖2 不同冷脅迫方式下太平洋牡蠣無水?；钇诖婊钭兓?/p>
2.3.2 失重率 不同降溫方式對太平洋牡蠣無水保活期失重率的影響如圖3所示，隨著保活時間延長所有不同降溫處理組牡蠣失重率均呈明顯上升趨勢，且不同降溫方式對質量失重率的影響有一定差異。對比4種不同降溫方式，散冰自然降溫組在整個?；钇趦荣|量損失率明顯低于其他3組，主要是由散冰融化，牡蠣長時間浸泡在冰水中所致。從?；? d開始，梯度和線性降溫組失重率明顯低于急性連續(xù)降溫組；保活5 d時失重率分別為11.98%和11.39%，而急性降溫組?；? d時高達15.78%；?；? d后急性、線性和梯度降溫組失重率分別為20.46%、16.82%、14.18%。結合存活率分析，可見采用線性和梯度的降溫方式對牡蠣無水?；钸^程質量損失影響最小。
圖3 不同冷脅迫方式對太平洋牡蠣無水保活期失重率的影響
2.4 冷脅迫方式對太平洋牡蠣無水?；钇诳寡趸富盍Φ挠绊?/h3>
圖4(A-B)可知，在不同降溫方式脅迫下，太平洋牡蠣腮組織中的SOD、CAT活力均隨?；顣r間的延長呈上升趨勢。降溫后各組SOD、CAT活力較降溫前明顯升高，散冰自然降溫組在保活前3 d均顯著高于其他降溫組 (< 0.05），在保活終期呈下降趨勢；急性降溫組SOD、CAT活力隨?；顣r間延長呈直線上升趨勢，且在?；? ～ 9 d CAT活性顯著高于線性和梯度降溫組 (< 0.05）；但線性和梯度降溫組在?；? ～ 3 d，SOD、CAT活力與降溫后相比無明顯增加 (> 0.05)，隨后呈緩慢增長趨勢，除保活3 d外，線性和梯度降溫組SOD、CAT活力在降溫后?；? ～ 9 d無明顯差異(> 0.05)。表明，散冰與急性連續(xù)降溫屬于溫度突變的降溫方式，易導致牡蠣長時間處于應激狀態(tài)，機體無法通過自身調節(jié)修復，氧化應激損傷明顯高于線性和梯度降溫組。溫度作為主要的環(huán)境因子，對水生生物生理生化反應產生直接影響。在常溫狀態(tài)下，ROS處于動態(tài)平衡，但貝類在無水?；钸^程中受低溫缺氧等因素脅迫，體內黃嘌呤脫氫酶可轉化為黃嘌呤氧化酶，線粒體電子傳遞鏈載體失活，產生大量ROS，但貝類自身具備一套完整的抗氧化體系來維持機體ROS平衡[17-18]。由郝爽等[6]研究表明急性低溫脅迫下溢蟶組織中SOD、CAT活力隨處理時間延長呈不斷升高趨勢。陳麗梅等[19]研究發(fā)現(xiàn)，溫度突變脅迫后毛蚶 () 組織中SOD、CAT活力明顯升高。劉玲等[20]發(fā)現(xiàn)，漸變溫度脅迫下對雜交石斑魚(Valenciennes) 幼魚抗氧化能力影響較小，這些研究結果均提示不良環(huán)境脅迫會誘導機體SOD、CAT活力升高，與本研究結果一致。
GSH-PX與POD它們在維持自由基平衡和減少應激損傷方面發(fā)揮著重要作用，在應激狀態(tài)下GSH-PX將H2O2和有機過氧化物轉化為H2O，而POD則具有降解消除H2O2和酚類、胺類、醛類、苯類毒性的雙重作用[21]。由圖4(C-D)可知，太平洋牡蠣腮組織中的GSH-PX與POD活力均隨?；顣r間的延長呈上升趨勢，除?；? d外，散冰降溫組牡蠣GSH-PX活性與急性降溫組在降溫后、?；?d、?；? d無顯著差異 (> 0.05)，散冰自然降溫組和急性降溫組在降溫后?；? ～ 9 d均顯著高于線性和梯度降溫組 (< 0.05)；線性和梯度降溫組在降溫后?；? ～ 9 d POD活力變化不明顯 (> 0.05)?？梢奊SH-PX、POD與SOD、CAT在清除自由基抵抗氧化損傷過程中發(fā)揮著相互協(xié)同及補充的作用，同時也表明在強應激條件下，牡蠣表現(xiàn)出更強的生理應激響應，線性和梯度漸變降溫方式更有利于維持牡蠣抗氧化系統(tǒng)平衡。這一變化規(guī)律與李曉英等[22]對溫度漸變下青蛤 () 肝胰腺組織中抗氧化酶活力的研究結果相似。
同一時間下，凡含一個相同字母表示組間無顯著差異 (> 0.05)
At the same time, the data with a same letter means no significant difference between them（＞0.05）
圖4 不同冷脅迫方式對太平洋牡蠣無水?；钇赟OD(A)、CAT(B)、GSH-PX(C)、POD(D)的影響
Fig.4 Effects of differentcold stress methods on the SOD(A), CAT(B), GSH-PX(C), POD(D) ofduring the waterless keep alive
MDA含量代表脂質過氧化程度，間接反映組織細胞受自由基攻擊的程度。一般來說，MDA含量越高，生物體所受的壓力越大[23]。由圖5(A)可見，太平洋牡蠣腮組織中的MDA含量均隨保活時間的延長呈上升趨勢且在降溫后?；? ～ 5 d散冰自然降溫組MDA含量明顯高于其他降溫組 (< 0.05)，急性和線性降溫組在降溫后MDA含量明顯高于梯度降溫組 (< 0.05)，線性和梯度降溫組在?；钋捌跓o明顯變化，急性降溫組MDA質量摩爾濃度在?；? d達到最高值（13.1 nmol/g），顯著高于線性和梯度降溫組 (< 0.05)。表明，短期冰溫脅迫下牡蠣抗氧化系統(tǒng)被激活，加速清除過多MDA以維持體內抗氧化系統(tǒng)平衡，但長時間冰溫脅迫易導致牡蠣受到脂質過氧化損傷且強應激條件下牡蠣表現(xiàn)出更強的生理應激響應，散冰和急性降溫組尤為明顯。大量研究表明，機體在應激脅迫條件下MDA含量急劇上升，如巖牡蠣()[14]在急性溫度脅迫下腮組織中MDA活力顯著上升，華貴櫛孔扇貝 ()[24]在遭受低溫脅迫下MDA含量有所升高，以上結果均與本實驗研究變化趨勢相似。
需氧生物在氧化還原反應中產生大量的ROS，SOD將機體內產生的ROS分解成H2O2，而CAT、POD、GSH-PX又將H2O2還原成氧分子 (O2) 和水 (H2O)，從而消除ROS對機體的影響[4]。由圖5(B)可見，各不同降溫組H2O2含量隨?；顣r間延長總體呈先上升后下降趨勢。在降溫后保活1 ～ 9 d，散冰自然降溫組H2O2含量均顯著高于各降溫組 (< 0.05)；急性降溫組H2O2含量在?；?、7、9 d顯著高于線性和梯度降溫組(< 0.05)；線性和梯度降溫組H2O2含量在降溫后?；? ～ 9 d無明顯差異 (> 0.05)。結表明，散冰和急性降溫組在受到直接冰溫脅迫后通過SOD產生大量H2O2未被及時消解，且隨著時間延長氧化應激逐漸加深，而線性和梯度降溫組屬溫度漸變方式，機體H2O2能被SOD、CAT、POD、GSH-PX協(xié)同及時有效清除，有效阻止氧化應激的進一步損傷。本結果與郝爽等[25]報道的急性低溫脅迫對溢蟶H2O2的變化趨勢相似。
T-AOC是反映機體抗氧化能力的綜合指標，它可以反映機體抗氧化防御系統(tǒng)應對外來脅迫的能力[26]。由圖5(C)可見，散冰降溫組在降溫后保活1 ～ 9 d，T-AOC水平顯著高于其他3組 (< 0.05)，且在?；罱K期呈下降趨勢；提示在長時強應激脅迫下由于牡蠣活力不足，致使體內總抗樣化能力下降。除?；? d外，急性降溫組在降溫后保活3 ～ 9 d內T-AOC含量均高于梯度降溫組 (< 0.05)，線性和梯度降溫組無明顯差異 (> 0.05)，且梯度降溫組在?；钇趦仁冀K維持在降溫前水平。
整體來看，T-AOC水平的變化情況與SOD和CAT活力變化呈現(xiàn)高度的一致性，同時也表明，散冰和急性冰溫脅迫導致牡蠣ROS快速富集，抗氧化體系做出應答，表現(xiàn)為各種抗氧化酶活力以及總抗氧化能力顯著升高，但線性和梯度緩慢降溫方式在短時間內能通過自身調節(jié)來維持體內抗氧化系統(tǒng)平衡，長時間冰溫脅迫會對機體造成一定的氧化應激損傷。曹善茂等[27]研究表明，巖牡蠣在低溫脅迫下對其T-AOC能力有明顯抑制作用。Gu等[28]研究表明，珍珠貝 () 在遭受干露脅迫時，總抗氧化能力呈先上升后下降趨勢，以上結果均與本研究變化趨勢相似。
同一時間下，凡含一個相同字母表示組間無顯著差異 (P > 0.05)
At the same time, the data with a same letter means no significant difference between them（P＞0.05）
圖5 不同冷脅迫方式對太平洋牡蠣無水?；钇贛DA(A)、H2O2(B)和T-AOC(C)的影響
Fig.5 Effects of different cold stress methods on the MDA(A), H2O2(B) and T-AOC(C) of Crassostrea gigas during the waterless keep alive
2.5 冷脅迫方式對太平洋牡蠣無水?；钇谀芰看x的影響
不同低溫誘導休眠方式對太平洋牡蠣主要能量物質變化見表3?？梢钥闯觯⒈匀唤禍亟M牡蠣受到冰溫脅迫后脂肪和肌糖原變化明顯 (< 0.05)；急性降溫組受到冰溫脅迫后肌肉中水分、蛋白質、脂肪均無顯著變化 (> 0.05)，肌糖原含量則明顯下降 (< 0.05)；隨著保活時間延長，散冰降溫組在保活終期能量物質均顯著低于其他降溫組 (< 0.05)；?；? d后急性、線性和梯度降溫組能量物質呈明顯下降，乳酸則上升，能量代謝次序為糖原、粗脂肪、粗蛋白。急性降溫組肌肉中水分、脂肪、糖原、乳酸含量與梯度降溫組相比具有顯著性差異 (< 0.05)，但蛋白質則無明顯差異 (> 0.05)；線性和梯度降溫組在?；? d后脂肪、蛋白質、水分均無明顯差異 (> 0.05)。結果說明，機體在受到強應激條件下主要消耗體內儲存糖原來維持機體正常生理代謝，且脅迫強度越大，消耗糖原越多，但短期脅迫并不會啟動脂肪、蛋白質來維持機體穩(wěn)定。Bonga等[29]研究發(fā)現(xiàn)，機體一旦處于脅迫狀態(tài)，肌糖原就會被優(yōu)先調動起來用于供能。隨著脅迫時間延長，機體受到低溫、饑餓等多重脅迫后加速了水分的損耗，分解大量的糖原、脂肪來維持機體平衡，但對蛋白質利用較少，且脅迫強度越大，體內能量物質消耗的越快，這一現(xiàn)象在蝦夷扇貝[30]、香港牡蠣[15]、菲律賓蛤仔()[31]無水流通過程中也有報道。同時也說明，線性和梯度的降溫方式更有利于牡蠣在長時間?；钪心芰课镔|的維持。
表3 冷脅迫方式對太平洋牡蠣無水期能量代謝的影響
注：相同指標下，不同處理方式間凡含一個相同字母表示差異不顯著（＞0.05）
Note: At the same index，the data with a same letter in different control groups means no significant difference between them（＞0.05）
3 結論
散冰和急性降溫脅迫對牡蠣抗氧化酶活力及脂質過氧化狀態(tài)影響較大，加速了牡蠣抗氧化系統(tǒng)損傷，且隨著應激時間的延長對其生命體征及能量代謝均產生顯著影響。線性和梯度這兩種較為緩和的降溫方式能緩解牡蠣在冰溫?；钸^程中氧化應激狀態(tài)，短時間內有利于牡蠣抗氧化系統(tǒng)動態(tài)平衡的修復，且對其生命特征及能量代謝影響更小。綜上，為減少運輸損失和運輸脅迫對牡蠣的健康造成影響，建議在采用線性和梯度的降溫方式誘導牡蠣進入生態(tài)冰溫狀態(tài)后開始無水保活；同時可采用抗氧化指標(SOD、CAT、GSH-PX、POD、MDA) 作為貝類無水?；钸^程中的監(jiān)控指標。
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Effect of Cold Stress Methods on Antioxidant and Energy Metabolism ofin Water-free Live Storage Period
LIN Heng-zong1,2, GAO Jia-long1,2, LIANG Zhi-yuan1, FAN Xiu-ping1,2, LIN Hai-sheng1,2, CAO Wen-hong1,2, HUANG Yan-ping1, QIN Xiao-ming1,2
（1.,,524025,2.()////////,524088,）
【Objective】To systematically analyze the effects of pre-cooling and temperature stress on the oxidative immune system and energy metabolism ofbefore live transport, and select a better pre-cooling methods before waterless keep alive.【Method】Oysters were either treated by natural cooling, acute continuous cooling, linear uniform cooling and gradient cooling in crush ice.The survival rate, weight loss rate, antioxidant capacity, energy metabolism of the oyster were determined to evaluate the best method of dormancy induction.【Results】1) the survival rate and weight loss rate of gradient and linear cooling methods were better than the natural cooling and acute cooling.2) The antioxidant enzyme activity of each group increased during the whole live storage, ice cooling group was significantly higher than acute, linear and gradient cooling groups (< 0.05); MDA content in natural cooling and acute cooling group were increased significantly.In contrast, the MDA value showed an initial decreased then increased trend in the linear and gradient cooling groups; each groups.The H2O2level of all test groups showed an initial increased and then decreased pattern while the T-AOC was at an upward trend when the stress time was extended.3) The energy content of ice cooling group was significantly lower than other groups during the test period (< 0.05).The moisture, glycogen and fat content of the linear and gradient cooling groups were higher than the others groups, but lactic acid was lower than them.【Conclusion】When theunder ice are induced dormancy and are kept waterless after treatment by linear and gradient cooling methods (cooling rate ≤ 5 ℃/h), the antioxidant enzyme activity and lipid peroxidation will be reduced.The survival time is extended, the weight loss rate and the loss of energy metabolites is lower for the cold stress group, which is more conductive to the waterless keep alive retention of oysters.
; hibernation methods; ecological ice temperature; waterless keep alive; oxidative stress; energy metabolism
Q939.11
A
1673-9159（2022）02-0095-09
10.3969/j.issn.1673-9159.2022.02.012
2021-12-02
“十三五”國家重點研發(fā)計劃“藍色糧倉科技創(chuàng)新”重點專項（2019YFD0901601）
林恒宗（1996―），男，碩士研究生，研究方向為貝類凈化及?；钸\輸技術。E-mail：1074680995@qq.com
秦小明（1964―），男，教授，研究方向為貝類凈化和水產品?；钸\輸技術。E-mail： xiaoming0502@21cn.scom
林恒宗，高加龍，梁志源，等.冷脅迫方式對太平洋牡蠣無水?；钇谘趸瘧ぜ澳芰肯牡挠绊慬J].廣東海洋大學學報，2022，42（2）：95-103.
（責任編輯：劉朏）
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林恒宗，高加龍，梁志源，范秀萍，林海生，曹文紅，黃艷平，秦小明
冷脅迫方式對太平洋牡蠣無水?；钇谘趸瘧ぜ澳芰肯牡挠绊?/p>
林恒宗1,2，高加龍1,2，梁志源1，范秀萍1,2，林海生1,2，曹文紅1,2，黃艷平1，秦小明1,2
（1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東 湛江 524025；2.國家貝類加工技術研發(fā)分中心（湛江）// 廣東省水產品加工與安全重點實驗室 // 廣東省海洋食品工程技術研發(fā)中心 // 廣東省海洋生物制品工程重點實驗室 // 水產品深加工廣東普通高校重點實驗室，廣東 湛江 524088）
【目的】系統(tǒng)分析太平洋牡蠣() ?；钸\輸前的預冷方式及溫度脅迫對其氧化免疫系統(tǒng)、能量物質代謝的影響，篩選出較好的無水保活前預冷方式。【方法】分別采用散冰自然降溫、急性連續(xù)降溫、線性勻速降溫、梯度降溫4種低溫誘導休眠方式處理牡蠣，并探討不同誘導休眠方式對牡蠣生態(tài)冰溫無水保活期的存活率、失重率、抗氧化能力以及能量物質代謝的影響。【結果】1）梯度和線性降溫牡蠣冰溫?；? d其存活率及失重率優(yōu)于散冰和急性降溫組。2）各組牡蠣在整個保活期內抗氧化酶活力均升高，且散冰降溫組顯著高于急性、線性和梯度降溫組(< 0.05)；散冰和急性降溫組丙二醛(MDA) 含量呈明顯上升趨勢，而線性和梯度降溫組先降后升高；各不同降溫組過氧化氫(H2O2) 含量則先升后降；總抗氧化能力(T-AOC) 隨脅迫時間延長呈上升趨勢。3）散冰降溫組在整個?；钇趦饶芰课镔|均顯著低于各組(< 0.05)，保活9 d后線性和梯度降溫組水分、糖原、脂肪含量高于各組，乳酸含量則低于各組?！窘Y論】采用線性和梯度降溫方式誘導牡蠣進入生態(tài)冰溫休眠狀態(tài)后開始無水?；?，有利于減緩牡蠣在冷脅迫下抗氧化酶活力及脂質過氧化的影響，且保活時間更長，失重率更低，能量代謝物質損失較少，更有利于牡蠣長時間無水?；?。
太平洋牡蠣；休眠方式；生態(tài)冰溫；無水?；睿谎趸瘧?；能量代謝
太平洋牡蠣 () 是我國產量最高的牡蠣品種，主要分布在遼寧、山東等長江以北地區(qū)。牡蠣不僅味道鮮美且富含蛋白質、糖原、氨基酸、微量元素及維生素等營養(yǎng)物質[1-2]，深受消費者青睞。牡蠣在我國主要以鮮銷為主，但當前產業(yè)中牡蠣無水?；盍魍ㄗ鳂I(yè)時缺乏系統(tǒng)的降溫預冷工藝技術，鮮活牡蠣采捕后大多采用泡沫箱加冰強迫其進入休眠狀態(tài)，后進入?；盍魍üば?。然而，大幅降溫會導致機體產生大量活性氧 (Reactive Oxygen Species，ROS)，ROS會對細胞造成損傷、組織正常的生理機能和免疫防御能力產生不可逆的損害，從而影響其存活質量[3]。在蝦夷扇貝 ()[4]、皺紋盤鮑 (HannaiIno)[5]、溢蟶 ()[6]、巖扇貝 ()[7]、魁蚶 ()[8]等貝類的研究中都已證實溫度急劇變化對抗氧化系統(tǒng)及生理代謝產生直接影響。因此，合理的降溫方式對延長貝類?；顣r間和保持貝類鮮度品質非常重要。目前關于太平洋牡蠣?；钸\輸前的預冷方式及溫度脅迫對其氧化免疫系統(tǒng)、能量物質代謝的研究鮮有報道。因此，本研究模擬當前國內太平洋牡蠣流通模式，將新鮮捕撈的牡蠣運抵實驗室后暫養(yǎng)凈化，采用不同降溫方式對凈化后的牡蠣進行誘導休眠處理，探索降溫方式對牡蠣生態(tài)冰溫?；钸^程中氧化應激及能量物質的影響，以期為雙殼貝類?；钋疤幚砉ば颉⒌蜏乇；钸\輸條件優(yōu)化提供技術和理論參考。
1 材料與方法
1.1 材料
鮮活太平洋牡蠣 (），2021年3月購自山東威海燈塔水母海洋科技有限公司，采捕后挑選富有活力、雙殼完整、規(guī)格相近的帶泥個體作為研究對象，迅速分裝于套有內膜保濕袋的泡沫箱中，裝箱前及裝箱完成后在其表面與底面平鋪一層約3 ～ 5 cm海水冰，且用吸水海綿與貝體隔開，經專用牡蠣冷鏈運輸車運輸48 h后運抵廣東海洋大學水產品?；盍魍▽嶒炇視吼B(yǎng)凈化，以消除捕撈和運輸操作時應激反應。牡蠣的平均生物學指標見表1。
表1 太平洋牡蠣生物學指標
1.2 主要儀器設備與試劑
貝類暫養(yǎng)凈化系統(tǒng)，廣州創(chuàng)嶺水產有限公司；GXG-1低溫恒溫層析柜，江蘇盛藍儀器有限公司； JK-8多點溫度計，常州金艾聯(lián)公司；Varioskan Flash全自動酶標儀，美國Thermo公司；VAP450全自動凱氏定氮儀，德國Gerhardt公司；SZF-06A粗脂肪測定儀，上海洪記儀器設備有限公司；HX204鹵素水分測定儀，瑞士梅特勒公司。
超氧化物歧化酶 (SOD)、過氧化氫酶 (CAT)、過氧化物酶 (POD)、谷胱甘肽過氧化物酶 (GSH-PX)、丙二醛 (MDA)、過氧化氫 (H2O2)、總抗氧化能力 (T-AOC)、糖原 (Gn)、乳酸 (LD)、蛋白質含量檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。其余化學試劑為分析純。
1.3 設計與方法
1.3.1 人工海水配制 在貝類凈化系統(tǒng)中按太平洋牡蠣養(yǎng)殖海域鹽度 (31±0.5)[9]，用海水晶配制人工海水，開啟增氧設備持續(xù)曝氣24 h，通臭氧至海水臭氧質量濃度為0.15 mg/L，以流速2.5 m3/h通過紫外燈管進行滅菌，設定水溫25 ℃循環(huán)預冷備用。
1.3.2 牡蠣暫養(yǎng)凈化 采用滅菌人工海水清洗牡蠣表面附著物，將清洗后的牡蠣放入塑料筐 (600 mm × 420 mm × 315 mm) 置于貝類凈化系統(tǒng)中，參照慕翠敏等[10]和費星等[11]的人凈化工藝條件進行凈化：水溫25 ℃，貝水質量（kg）體積（L）比1：20，臭氧質量濃度0.15 mg/L，于鹽度31的紫外循環(huán)滅菌人工海水中凈化24 h，塑料筐與槽底距離2.5 cm以上防止二次污染。
1.3.3 牡蠣生態(tài)冰溫的確定 臨界溫度測定參照儲建軍等[12]方法。挑選凈化后富有活力的牡蠣20只放入裝有人工海水的透明玻璃容器內 (320 mm × 150 mm × 212 mm) 內，通過調節(jié)低溫恒溫設備及加入人工海水冰塊進行緩慢降溫，同時觀察箱內牡蠣的存活狀態(tài)和對外界刺激的反應情況。牡蠣雙殼自然張開，剌激反應微弱甚至無反應作為臨界溫度點。
結冰點測定參照徐德峰等[13]實驗方法。挑選凈化后富有活力的牡蠣10只，將多點溫度計溫度探針插入牡蠣肌肉內部，置于-20 ℃低溫冰箱中，每5 s記錄肌肉內部的溫度，直到個體完全凍結。以時間為橫坐標，溫度為縱坐標繪制凍結曲線，根據凍結曲線拐點確定結冰點。由上述臨界溫度和凍結點測定結果及生態(tài)冰溫定義確定太平洋牡蠣生態(tài)冰溫范圍。
1.3.4 牡蠣誘導休眠方法 將凈化后挑選的600只太平洋牡蠣隨機分為4組，每組150只，參照郝爽等[7]降溫方法并加以改進，分別采用4種降溫誘導休眠方式。其中散冰降溫處理方式為：將牡蠣分裝于泡沫箱中（450 mm × 250 mm × 200 mm），約5 kg/箱，裝箱前后在其四周及表層平鋪淡水冰，加蓋后放置在0 ℃的恒溫層析柜中開始無水保活。另外三種降溫方式則是將牡蠣分裝于?；钏芰峡鹬校芰峡鸬乃闹芗氨砻婢采w一層浸足滅菌海水的海綿，為保證環(huán)境濕度，每12 h向海綿噴淋滅菌海水。急性降溫的處理方式為直接將牡蠣置于0 ℃的層析柜中，開始無水?；?；線性及梯度降溫速率參照胡益鳴等[14]的實驗結果，通過調節(jié)恒溫層析柜，以5 ℃/h的降溫速率從（25±0.5）℃降至（0±0.5）℃后開始無水?；?，其中梯度降溫組牡蠣溫度每下降5℃停留90min。各實驗組牡蠣在誘導休眠結束后開始無水?；罟ば?，保活周期為9 d，分別在降溫前（BC）、降溫后（AC）及?；钇诿刻毂O(jiān)測牡蠣存活及失重情況，另取腮和肌肉組織檢測相關生化指標。
1.4 樣品采集、制備與指標測定
1.4.1 存活及失重率監(jiān)測 檢活方法參照高加龍等[15]實驗方法，每24 h觀測牡蠣的貝殼張開情況，能自由閉合為活貝，不能閉合為死貝，依據存活及死亡數(shù)量繪制存活曲線。失重率監(jiān)測參照申淑琦等[16]實驗方法，選取個體差異較小、規(guī)格相近、富有活力的牡蠣20只，每天記錄總質量。失重率為?；钋昂竽迪犢|量損失與初始質量之比。
1.4.2 抗氧化酶活力測定 每組隨機取9只牡蠣，迅速開殼取鰓，用預冷質量分數(shù)為0.86%生理鹽水漂洗，吸水紙拭干表面水分，按質量（g）體積(mL)比1：9的比例加入預冷生理鹽水進行冰浴機械勻漿，將制備好的體積分數(shù)為10%的勻漿液在4 ℃下以12 000 r/min的轉速離心10 min，取上清于潔凈EP管中，立即測定或-80 ℃凍存待測。嚴格按照試劑盒操作規(guī)程檢測腮組織中蛋白質含量、SOD、CAT、POD、GSH-PX、MDA、H2O2、T-AOC酶活力，結果以蛋白濃度計算。
1.4.3 能量代謝指標測定 每組隨機取15只牡蠣，迅速開殼刨取牡蠣全臟器，用預冷的質量分數(shù)為0.86%生理鹽水漂洗，吸水紙拭干表面水分，采用高速勻漿機攪碎成肉糜狀，分裝，立即測定或-80 ℃凍存待測。嚴格按照試劑盒操作規(guī)程檢測肌肉組織中Gn、LD含量。水分、粗蛋白、粗脂肪含量分別按照國標GB 5009.3-2016、GB 5009.5-2016、GB 5009.6-2016測定。
1.5 數(shù)據分析
實驗結果均平行測定三次，數(shù)據采用平均值±標準偏差表示，對非正態(tài)分布數(shù)據存活率采用平方根反正弦變換后進行統(tǒng)計分析，對試驗結果采用統(tǒng)計分析軟件SPSS 26.0進行單因素方差分析 (One-Way ANOVA) 及組間差異采用Duncan多重比較，顯著性水平設為0.05。
2 結果與分析
2.1 太平洋牡蠣生態(tài)冰溫零點測定
太平洋牡蠣在緩慢降溫過程中的行為特征如表2所示。在5 ℃以上太平洋牡蠣生理活動正常；當溫度降至5 ℃時，應對外界刺激反應緩慢；3 ℃時基本無濾水表征現(xiàn)象，置于室溫條件下能緩慢閉殼，表明太平洋牡蠣此時處于半休眠狀態(tài)；0 ℃時對外界刺激已無任何反應，但置于常溫人工海水能恢復正常濾水現(xiàn)象；-1℃時對外界刺激無反應，殼邊緣出現(xiàn)微凍現(xiàn)象，溫度繼續(xù)降低成活率下降。判定牡蠣生態(tài)冰溫零點約為0 ℃。
表2 不同溫度下太平洋牡蠣活動狀態(tài)
2.2 太平洋牡蠣結冰點測定
只有確定太平洋牡蠣耐受低溫極限溫度，才能通過控制適當?shù)蜏厥鼓迪犔幱谛菝郀顟B(tài)且不至于溫度過低導致死亡。由圖1可見，當溫度降至-1.7 ℃時，牡蠣體內釋放出大量潛熱，此階段牡蠣肌肉降溫速度緩慢，甚至溫度維持不變，因此得出太平洋牡蠣結冰點為-1.7 ℃，溫度繼續(xù)下降將導致肌肉結冰而引起牡蠣死亡。結合牡蠣生態(tài)冰溫零點，太平洋牡蠣在無水?；钸^程中溫度范圍控制在-1.7 ～ 0 ℃。根據研究結果，機體越接近冰點溫度易造成冷脅迫損傷，因此，在生態(tài)冰溫?；钸^程中溫度應盡量遠離冰點溫度。
2.3 冷脅迫方式對太平洋牡蠣無水?；钇谏w征的影響
2.3.1 存活分析 不同降溫方式對太平洋牡蠣無水保活過程存活曲線變化如圖2所示。在冷脅迫下太平洋牡蠣存活率隨?；顣r間延長均呈明顯右移趨勢。散冰自然降溫組在?；? d開始出現(xiàn)死貝，急性連續(xù)降溫組在保活2 d開始出現(xiàn)死貝，梯度和線性勻速降溫組在保活3 d出現(xiàn)死貝；對比4種不同降溫方式，梯度降溫組存活率最高，散冰自然降溫組最低，?；? d全部死亡；梯度、線性、急性降溫組?；? d后存活率分別為90%、85%、79%?？梢姡禍仡A冷方式對雙殼貝類無水?；钸^程中存活率有較大影響。同時說明脅迫強度越大會加速太平洋牡蠣生理代謝, 降低機體對環(huán)境的適應能力，引起死亡，并隨著時間延長而加劇，本實驗?；顥l件下太平洋牡蠣的存活率與香港牡蠣 () ?；罱Y果接近(?；? d，存活率95%)[15]。
方框指示太平洋牡蠣凍結溫度點
圖2 不同冷脅迫方式下太平洋牡蠣無水?；钇诖婊钭兓?/p>
2.3.2 失重率 不同降溫方式對太平洋牡蠣無水保活期失重率的影響如圖3所示，隨著保活時間延長所有不同降溫處理組牡蠣失重率均呈明顯上升趨勢，且不同降溫方式對質量失重率的影響有一定差異。對比4種不同降溫方式，散冰自然降溫組在整個?；钇趦荣|量損失率明顯低于其他3組，主要是由散冰融化，牡蠣長時間浸泡在冰水中所致。從?；? d開始，梯度和線性降溫組失重率明顯低于急性連續(xù)降溫組；保活5 d時失重率分別為11.98%和11.39%，而急性降溫組?；? d時高達15.78%；?；? d后急性、線性和梯度降溫組失重率分別為20.46%、16.82%、14.18%。結合存活率分析，可見采用線性和梯度的降溫方式對牡蠣無水?；钸^程質量損失影響最小。
圖3 不同冷脅迫方式對太平洋牡蠣無水保活期失重率的影響
2.4 冷脅迫方式對太平洋牡蠣無水?；钇诳寡趸富盍Φ挠绊?/h3>
圖4(A-B)可知，在不同降溫方式脅迫下，太平洋牡蠣腮組織中的SOD、CAT活力均隨?；顣r間的延長呈上升趨勢。降溫后各組SOD、CAT活力較降溫前明顯升高，散冰自然降溫組在保活前3 d均顯著高于其他降溫組 (< 0.05），在保活終期呈下降趨勢；急性降溫組SOD、CAT活力隨?；顣r間延長呈直線上升趨勢，且在?；? ～ 9 d CAT活性顯著高于線性和梯度降溫組 (< 0.05）；但線性和梯度降溫組在?；? ～ 3 d，SOD、CAT活力與降溫后相比無明顯增加 (> 0.05)，隨后呈緩慢增長趨勢，除保活3 d外，線性和梯度降溫組SOD、CAT活力在降溫后?；? ～ 9 d無明顯差異(> 0.05)。表明，散冰與急性連續(xù)降溫屬于溫度突變的降溫方式，易導致牡蠣長時間處于應激狀態(tài)，機體無法通過自身調節(jié)修復，氧化應激損傷明顯高于線性和梯度降溫組。溫度作為主要的環(huán)境因子，對水生生物生理生化反應產生直接影響。在常溫狀態(tài)下，ROS處于動態(tài)平衡，但貝類在無水?；钸^程中受低溫缺氧等因素脅迫，體內黃嘌呤脫氫酶可轉化為黃嘌呤氧化酶，線粒體電子傳遞鏈載體失活，產生大量ROS，但貝類自身具備一套完整的抗氧化體系來維持機體ROS平衡[17-18]。由郝爽等[6]研究表明急性低溫脅迫下溢蟶組織中SOD、CAT活力隨處理時間延長呈不斷升高趨勢。陳麗梅等[19]研究發(fā)現(xiàn)，溫度突變脅迫后毛蚶 () 組織中SOD、CAT活力明顯升高。劉玲等[20]發(fā)現(xiàn)，漸變溫度脅迫下對雜交石斑魚(Valenciennes) 幼魚抗氧化能力影響較小，這些研究結果均提示不良環(huán)境脅迫會誘導機體SOD、CAT活力升高，與本研究結果一致。
GSH-PX與POD它們在維持自由基平衡和減少應激損傷方面發(fā)揮著重要作用，在應激狀態(tài)下GSH-PX將H2O2和有機過氧化物轉化為H2O，而POD則具有降解消除H2O2和酚類、胺類、醛類、苯類毒性的雙重作用[21]。由圖4(C-D)可知，太平洋牡蠣腮組織中的GSH-PX與POD活力均隨?；顣r間的延長呈上升趨勢，除?；? d外，散冰降溫組牡蠣GSH-PX活性與急性降溫組在降溫后、?；?d、?；? d無顯著差異 (> 0.05)，散冰自然降溫組和急性降溫組在降溫后?；? ～ 9 d均顯著高于線性和梯度降溫組 (< 0.05)；線性和梯度降溫組在降溫后?；? ～ 9 d POD活力變化不明顯 (> 0.05)?？梢奊SH-PX、POD與SOD、CAT在清除自由基抵抗氧化損傷過程中發(fā)揮著相互協(xié)同及補充的作用，同時也表明在強應激條件下，牡蠣表現(xiàn)出更強的生理應激響應，線性和梯度漸變降溫方式更有利于維持牡蠣抗氧化系統(tǒng)平衡。這一變化規(guī)律與李曉英等[22]對溫度漸變下青蛤 () 肝胰腺組織中抗氧化酶活力的研究結果相似。
同一時間下，凡含一個相同字母表示組間無顯著差異 (> 0.05)
At the same time, the data with a same letter means no significant difference between them（＞0.05）
圖4 不同冷脅迫方式對太平洋牡蠣無水?；钇赟OD(A)、CAT(B)、GSH-PX(C)、POD(D)的影響
Fig.4 Effects of differentcold stress methods on the SOD(A), CAT(B), GSH-PX(C), POD(D) ofduring the waterless keep alive
MDA含量代表脂質過氧化程度，間接反映組織細胞受自由基攻擊的程度。一般來說，MDA含量越高，生物體所受的壓力越大[23]。由圖5(A)可見，太平洋牡蠣腮組織中的MDA含量均隨保活時間的延長呈上升趨勢且在降溫后?；? ～ 5 d散冰自然降溫組MDA含量明顯高于其他降溫組 (< 0.05)，急性和線性降溫組在降溫后MDA含量明顯高于梯度降溫組 (< 0.05)，線性和梯度降溫組在?；钋捌跓o明顯變化，急性降溫組MDA質量摩爾濃度在?；? d達到最高值（13.1 nmol/g），顯著高于線性和梯度降溫組 (< 0.05)。表明，短期冰溫脅迫下牡蠣抗氧化系統(tǒng)被激活，加速清除過多MDA以維持體內抗氧化系統(tǒng)平衡，但長時間冰溫脅迫易導致牡蠣受到脂質過氧化損傷且強應激條件下牡蠣表現(xiàn)出更強的生理應激響應，散冰和急性降溫組尤為明顯。大量研究表明，機體在應激脅迫條件下MDA含量急劇上升，如巖牡蠣()[14]在急性溫度脅迫下腮組織中MDA活力顯著上升，華貴櫛孔扇貝 ()[24]在遭受低溫脅迫下MDA含量有所升高，以上結果均與本實驗研究變化趨勢相似。
需氧生物在氧化還原反應中產生大量的ROS，SOD將機體內產生的ROS分解成H2O2，而CAT、POD、GSH-PX又將H2O2還原成氧分子 (O2) 和水 (H2O)，從而消除ROS對機體的影響[4]。由圖5(B)可見，各不同降溫組H2O2含量隨?；顣r間延長總體呈先上升后下降趨勢。在降溫后保活1 ～ 9 d，散冰自然降溫組H2O2含量均顯著高于各降溫組 (< 0.05)；急性降溫組H2O2含量在?；?、7、9 d顯著高于線性和梯度降溫組(< 0.05)；線性和梯度降溫組H2O2含量在降溫后?；? ～ 9 d無明顯差異 (> 0.05)。結表明，散冰和急性降溫組在受到直接冰溫脅迫后通過SOD產生大量H2O2未被及時消解，且隨著時間延長氧化應激逐漸加深，而線性和梯度降溫組屬溫度漸變方式，機體H2O2能被SOD、CAT、POD、GSH-PX協(xié)同及時有效清除，有效阻止氧化應激的進一步損傷。本結果與郝爽等[25]報道的急性低溫脅迫對溢蟶H2O2的變化趨勢相似。
T-AOC是反映機體抗氧化能力的綜合指標，它可以反映機體抗氧化防御系統(tǒng)應對外來脅迫的能力[26]。由圖5(C)可見，散冰降溫組在降溫后保活1 ～ 9 d，T-AOC水平顯著高于其他3組 (< 0.05)，且在?；罱K期呈下降趨勢；提示在長時強應激脅迫下由于牡蠣活力不足，致使體內總抗樣化能力下降。除?；? d外，急性降溫組在降溫后保活3 ～ 9 d內T-AOC含量均高于梯度降溫組 (< 0.05)，線性和梯度降溫組無明顯差異 (> 0.05)，且梯度降溫組在?；钇趦仁冀K維持在降溫前水平。
整體來看，T-AOC水平的變化情況與SOD和CAT活力變化呈現(xiàn)高度的一致性，同時也表明，散冰和急性冰溫脅迫導致牡蠣ROS快速富集，抗氧化體系做出應答，表現(xiàn)為各種抗氧化酶活力以及總抗氧化能力顯著升高，但線性和梯度緩慢降溫方式在短時間內能通過自身調節(jié)來維持體內抗氧化系統(tǒng)平衡，長時間冰溫脅迫會對機體造成一定的氧化應激損傷。曹善茂等[27]研究表明，巖牡蠣在低溫脅迫下對其T-AOC能力有明顯抑制作用。Gu等[28]研究表明，珍珠貝 () 在遭受干露脅迫時，總抗氧化能力呈先上升后下降趨勢，以上結果均與本研究變化趨勢相似。
同一時間下，凡含一個相同字母表示組間無顯著差異 (P > 0.05)
At the same time, the data with a same letter means no significant difference between them（P＞0.05）
圖5 不同冷脅迫方式對太平洋牡蠣無水?；钇贛DA(A)、H2O2(B)和T-AOC(C)的影響
Fig.5 Effects of different cold stress methods on the MDA(A), H2O2(B) and T-AOC(C) of Crassostrea gigas during the waterless keep alive
2.5 冷脅迫方式對太平洋牡蠣無水?；钇谀芰看x的影響
不同低溫誘導休眠方式對太平洋牡蠣主要能量物質變化見表3?？梢钥闯觯⒈匀唤禍亟M牡蠣受到冰溫脅迫后脂肪和肌糖原變化明顯 (< 0.05)；急性降溫組受到冰溫脅迫后肌肉中水分、蛋白質、脂肪均無顯著變化 (> 0.05)，肌糖原含量則明顯下降 (< 0.05)；隨著保活時間延長，散冰降溫組在保活終期能量物質均顯著低于其他降溫組 (< 0.05)；?；? d后急性、線性和梯度降溫組能量物質呈明顯下降，乳酸則上升，能量代謝次序為糖原、粗脂肪、粗蛋白。急性降溫組肌肉中水分、脂肪、糖原、乳酸含量與梯度降溫組相比具有顯著性差異 (< 0.05)，但蛋白質則無明顯差異 (> 0.05)；線性和梯度降溫組在?；? d后脂肪、蛋白質、水分均無明顯差異 (> 0.05)。結果說明，機體在受到強應激條件下主要消耗體內儲存糖原來維持機體正常生理代謝，且脅迫強度越大，消耗糖原越多，但短期脅迫并不會啟動脂肪、蛋白質來維持機體穩(wěn)定。Bonga等[29]研究發(fā)現(xiàn)，機體一旦處于脅迫狀態(tài)，肌糖原就會被優(yōu)先調動起來用于供能。隨著脅迫時間延長，機體受到低溫、饑餓等多重脅迫后加速了水分的損耗，分解大量的糖原、脂肪來維持機體平衡，但對蛋白質利用較少，且脅迫強度越大，體內能量物質消耗的越快，這一現(xiàn)象在蝦夷扇貝[30]、香港牡蠣[15]、菲律賓蛤仔()[31]無水流通過程中也有報道。同時也說明，線性和梯度的降溫方式更有利于牡蠣在長時間?；钪心芰课镔|的維持。
表3 冷脅迫方式對太平洋牡蠣無水期能量代謝的影響
注：相同指標下，不同處理方式間凡含一個相同字母表示差異不顯著（＞0.05）
Note: At the same index，the data with a same letter in different control groups means no significant difference between them（＞0.05）
3 結論
散冰和急性降溫脅迫對牡蠣抗氧化酶活力及脂質過氧化狀態(tài)影響較大，加速了牡蠣抗氧化系統(tǒng)損傷，且隨著應激時間的延長對其生命體征及能量代謝均產生顯著影響。線性和梯度這兩種較為緩和的降溫方式能緩解牡蠣在冰溫?；钸^程中氧化應激狀態(tài)，短時間內有利于牡蠣抗氧化系統(tǒng)動態(tài)平衡的修復，且對其生命特征及能量代謝影響更小。綜上，為減少運輸損失和運輸脅迫對牡蠣的健康造成影響，建議在采用線性和梯度的降溫方式誘導牡蠣進入生態(tài)冰溫狀態(tài)后開始無水保活；同時可采用抗氧化指標(SOD、CAT、GSH-PX、POD、MDA) 作為貝類無水?；钸^程中的監(jiān)控指標。
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Effect of Cold Stress Methods on Antioxidant and Energy Metabolism ofin Water-free Live Storage Period
LIN Heng-zong1,2, GAO Jia-long1,2, LIANG Zhi-yuan1, FAN Xiu-ping1,2, LIN Hai-sheng1,2, CAO Wen-hong1,2, HUANG Yan-ping1, QIN Xiao-ming1,2
（1.,,524025,2.()////////,524088,）
【Objective】To systematically analyze the effects of pre-cooling and temperature stress on the oxidative immune system and energy metabolism ofbefore live transport, and select a better pre-cooling methods before waterless keep alive.【Method】Oysters were either treated by natural cooling, acute continuous cooling, linear uniform cooling and gradient cooling in crush ice.The survival rate, weight loss rate, antioxidant capacity, energy metabolism of the oyster were determined to evaluate the best method of dormancy induction.【Results】1) the survival rate and weight loss rate of gradient and linear cooling methods were better than the natural cooling and acute cooling.2) The antioxidant enzyme activity of each group increased during the whole live storage, ice cooling group was significantly higher than acute, linear and gradient cooling groups (< 0.05); MDA content in natural cooling and acute cooling group were increased significantly.In contrast, the MDA value showed an initial decreased then increased trend in the linear and gradient cooling groups; each groups.The H2O2level of all test groups showed an initial increased and then decreased pattern while the T-AOC was at an upward trend when the stress time was extended.3) The energy content of ice cooling group was significantly lower than other groups during the test period (< 0.05).The moisture, glycogen and fat content of the linear and gradient cooling groups were higher than the others groups, but lactic acid was lower than them.【Conclusion】When theunder ice are induced dormancy and are kept waterless after treatment by linear and gradient cooling methods (cooling rate ≤ 5 ℃/h), the antioxidant enzyme activity and lipid peroxidation will be reduced.The survival time is extended, the weight loss rate and the loss of energy metabolites is lower for the cold stress group, which is more conductive to the waterless keep alive retention of oysters.
; hibernation methods; ecological ice temperature; waterless keep alive; oxidative stress; energy metabolism
Q939.11
A
1673-9159（2022）02-0095-09
10.3969/j.issn.1673-9159.2022.02.012
2021-12-02
“十三五”國家重點研發(fā)計劃“藍色糧倉科技創(chuàng)新”重點專項（2019YFD0901601）
林恒宗（1996―），男，碩士研究生，研究方向為貝類凈化及?；钸\輸技術。E-mail：1074680995@qq.com
秦小明（1964―），男，教授，研究方向為貝類凈化和水產品?；钸\輸技術。E-mail： xiaoming0502@21cn.scom
林恒宗，高加龍，梁志源，等.冷脅迫方式對太平洋牡蠣無水?；钇谘趸瘧ぜ澳芰肯牡挠绊慬J].廣東海洋大學學報，2022，42（2）：95-103.
（責任編輯：劉朏）
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