鄧益琴，張亞秋,3，林梓陽(yáng),4，馮 娟，程長(zhǎng)洪，馬紅玲，劉廣鑫，蘇友祿

哈維弧菌和缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性

鄧益琴1，張亞秋1,3，林梓陽(yáng)1,4，馮 娟1，程長(zhǎng)洪1，馬紅玲1，劉廣鑫1，蘇友祿2

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所 / 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南海漁業(yè)資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510300；2.廣東省水環(huán)境與水產(chǎn)品安全工程技術(shù)研究中心 / 仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，廣東 廣州 510225；3.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；4.海南大學(xué)海洋學(xué)院，海南 ?？?570228）

【目的】研究哈維弧菌（）345的GTP結(jié)合蛋白編碼基因和未知功能基因的生物學(xué)功能?！痉椒ā坷猛粗亟M技術(shù)構(gòu)建345的和的缺失突變株，比較野生株和突變株的生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)性、胞外酶活性、耐藥性等生物學(xué)特性以及對(duì)花鱸（）的毒性?！窘Y(jié)果】基因和的缺失均不影響菌株的生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)性、胞外蛋白酶活性、對(duì)H2O2和Cu2+的壓力感應(yīng)、對(duì)鐵的吸收利用、對(duì)大多數(shù)被測(cè)抗生素的抗性以及對(duì)花鱸的毒性；但和缺失后對(duì)氯霉素和氟苯尼考兩種氯霉素類抗生素均更加敏感。此外，缺失后，細(xì)菌生物膜形成能力顯著增強(qiáng)。【結(jié)論】和均參與調(diào)控哈維弧菌對(duì)氯霉素類抗生素的耐藥性，還參與調(diào)控哈維弧菌生物膜形成。

哈維弧菌；基因敲除；；；生物學(xué)特性；氯霉素類耐藥性

弧菌病是一種流行范圍廣、危害極為嚴(yán)重的水產(chǎn)動(dòng)物傳染性疾病，極大地阻礙了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。哈維弧菌（）是導(dǎo)致中國(guó)華南沿岸海水魚(yú)感染和死亡最主要的病原弧菌，是養(yǎng)殖業(yè)主要影響因素之一[1-2]。由于疫苗和免疫增強(qiáng)劑等其他防控方法的局限性，抗生素廣泛用于預(yù)治水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌性疾病[3]；但抗生素的過(guò)度使用會(huì)導(dǎo)致耐藥和多重耐藥細(xì)菌產(chǎn)生和積累[4]。Deng等[5]發(fā)現(xiàn)，華南沿岸分離的弧菌對(duì)所測(cè)試15種抗生素的耐藥指數(shù)可達(dá)0.60。Sadat等[6]從埃及魚(yú)貝中分離的副溶血弧菌（）和溶藻弧菌（）的多重耐藥率分別為69.04%和38%。這些均說(shuō)明細(xì)菌高耐藥的嚴(yán)峻形勢(shì)。因此，深入認(rèn)識(shí)生物耐藥性的發(fā)生與發(fā)展機(jī)制，是保證藥物正確使用的前提和基礎(chǔ)。

GTP結(jié)合蛋白編碼基因與細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性、生物膜形成和毒力相關(guān)[7]。本課題組發(fā)現(xiàn)，對(duì)數(shù)期哈維弧菌于40℃下熱擊60 min后，未知功能基因表達(dá)量下降約30倍，而溫度對(duì)細(xì)菌致病性有潛在影響[8]；因此，可能與哈維弧菌毒力相關(guān)。本研究利用同源重組技術(shù)構(gòu)建致病性哈維弧菌 () 345的染色體上基因和未知功能基因[9]的缺失突變株，比較野生株與突變株的生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)性、胞外酶活性、耐藥性等多種生物學(xué)特性以及對(duì)花鱸（）的毒性，為哈維弧菌和的基因功能研究奠定基礎(chǔ)，為防治哈維弧菌病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒和引物 哈維弧菌345由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所漁業(yè)生物病害防治研究室（下稱“本實(shí)驗(yàn)室”）分離自中國(guó)南部沿?；疾∈唪~(yú)（）[9]；自殺質(zhì)粒pSW7848[10]、表達(dá)質(zhì)粒pMMB207[11]、大腸桿菌Π3813[12]和GEB883[13]分別來(lái)自Didier Mazel、Zhao Zhe、Didier Mazel和Annick Jacq教授，并保存于本實(shí)驗(yàn)室。所用引物見(jiàn)表1。

1.1.2 主要試劑 高保真酶PrimeSTAR?Max DNA polymerase、普通PCR酶Premix?（TaKaRa? Version 2.0）及限制性內(nèi)切酶I購(gòu)自Takara公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DNA產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自天根生物科技（北京）有限公司；-葡萄糖、-阿拉伯糖、氯霉素、2′-脫氧胸苷（2′-Deoxythymidine，Thy）和2-2′-聯(lián)吡啶（2,2′-Dipyridyl，DIP）購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；2,6-二氨基丙烯酸（2,6-Diaminopimelic acid，DAP）購(gòu)自Sigma公司；等溫組裝試劑盒ClonExpressMultiS One Step Cloning Kit購(gòu)自Vazyme公司；抗生素藥敏紙片購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.3 主要培養(yǎng)基 LB（luria-bertani）培養(yǎng)基、MH肉湯培養(yǎng)基和技術(shù)瓊脂粉購(gòu)自廣東環(huán)凱生物科技有限公司。1 L LB含10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物、10 g氯化鈉。1 L固體培養(yǎng)基含15 g瓊脂粉。將LB培養(yǎng)基氯化鈉質(zhì)量濃度提高至30 g·L?1，即制得LBS（luria-bertani-salt）培養(yǎng)基。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)用魚(yú) 花鱸（）購(gòu)自深圳一養(yǎng)殖場(chǎng)。

表1 本研究所用引物

1.2 方法

1.2.1和缺失株的構(gòu)建 參考Zhang等[14]方法并稍作修改。用引物對(duì)pSW7848-F/R線性化自殺質(zhì)粒pSW7848。用引物對(duì)-UP-F/R和-DOWN-F/R擴(kuò)增上、下游同源臂片段，并用引物對(duì)-UP-F/R、-DOWN-F/R擴(kuò)增上、下游同源臂片段。使用等溫組裝試劑盒等溫組裝線性化質(zhì)粒pSW7848和上下游同源臂片段，以及線性化質(zhì)粒pSW7848和上下游同源臂片段。將等溫組裝液轉(zhuǎn)化進(jìn)入接合作用中間宿主菌Π3813，用含有20 μg/mL氯霉素和0.3 mmol/L Thy的LB平板篩選可能成功的重組子，并用質(zhì)粒檢測(cè)引物對(duì)Del-check-pSW7848-F/R對(duì)重組自殺質(zhì)粒進(jìn)行PCR和測(cè)序檢測(cè)，組裝成功的質(zhì)粒PCR片段大小均約為2.3 kb，分別命名為pSW7848-Δ和pSW7848-Δ。進(jìn)一步將重組自殺質(zhì)粒pSW7848-Δ和pSW7848-Δ轉(zhuǎn)化進(jìn)入接合作用供體菌GEB883。通過(guò)接合作用分別將重組自殺質(zhì)粒pSW7848-Δ和pSW7848-Δ送入受體菌哈維弧菌野生株345?；谧詺①|(zhì)粒pSW7848在哈維弧菌中不能自主復(fù)制、有氯霉素抗性、毒性基因的表達(dá)受葡萄糖抑制而受阿拉伯糖誘導(dǎo)的特點(diǎn)[10]，用含34 μg/mL氯霉素和2 g/L-葡萄糖的LBS平板進(jìn)行第1次篩選，用含34 μg/mL氯霉素和2 g/L-阿拉伯糖的LBS平板進(jìn)行第2次反向篩選，重組自殺質(zhì)粒上基因的上下游同源臂片段分別與哈維弧菌基因組和基因的上下游同源臂片段發(fā)生兩次同源重組，得到哈維弧菌和缺失株，分別命名為345Δ和345Δ。

1.2.2和回補(bǔ)株的構(gòu)建 參考Liu等[11]方法并稍作修改。用引物對(duì)pMMB207-F/R線性化回補(bǔ)質(zhì)粒pMMB207。用引物對(duì)-F/R和-F/R分別擴(kuò)增和基因回補(bǔ)片段（包括啟動(dòng)子+ORF序列+終止子）。用等溫組裝試劑盒等溫組裝線性化質(zhì)粒pMMB207和回補(bǔ)片段，以及線性化質(zhì)粒pMMB207和回補(bǔ)片段。將等溫組裝液轉(zhuǎn)化入接合作用中間宿主菌Π3813，用含20 μg/mL氯霉素和0.3 mmol/L Thy的LB平板篩選可能成功的重組子，進(jìn)一步用質(zhì)粒檢測(cè)引物對(duì)com-check-pMMB207-F/R對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR和測(cè)序，組裝的PCR片段約為2.5、2.7 kb，分別命名為pMMB207-compMMB207-com。將重組回補(bǔ)質(zhì)粒pMMB207-com和pMMB207-com轉(zhuǎn)化進(jìn)入接合作用供體菌GEB883。通過(guò)接合作用將重組回補(bǔ)質(zhì)粒pMMB207-com送入受體菌哈維弧菌的缺失株345Δ，并將重組回補(bǔ)質(zhì)粒pMMB207-com送入受體菌哈維弧菌CU052_26825的缺失株345Δ?；诨匮a(bǔ)質(zhì)粒pMMB207在哈維弧菌中能自主復(fù)制，有氯霉素抗性[11]，用含34 μg/mL氯霉素的LBS平板篩選并純化2次，得到哈維弧菌和回補(bǔ)株，分別命名為345Δ-pMMB207-com-和345ΔpMMB207-com。同時(shí)，通過(guò)接合作用分別將回補(bǔ)質(zhì)粒pMMB207送入受體菌哈維弧菌野生株345、的缺失株345Δ以及的缺失株345Δ，得到哈維弧菌345-pMMB207、345Δ-pMMB207及345Δ-pMMB207。

1.2.3 菌株生長(zhǎng)分析 菌液制備：將野生株345，缺失突變株345Δ345Δ劃線于LBS平板，于28℃培養(yǎng)16 h，挑取單克隆分別接種至LBS液體培養(yǎng)基，于28℃、200 r·min–1條件下振搖培養(yǎng)16 ～ 24 h。用新鮮的LBS液體培養(yǎng)基將菌液稀釋至光密度(600 nm)= 0.001，按100 μL/孔分裝于96孔板，并用Spark微孔板檢測(cè)儀（TECA）測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)菌光密度(600 nm)，繪制生長(zhǎng)曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，由于3次重復(fù)結(jié)果相同，選擇1次代表性結(jié)果呈現(xiàn)，并使用IBM SPSS Statistics 19軟件進(jìn)行單因素協(xié)方差分析（ANCOVA）[以野生株和缺失突變株為固定因子，以時(shí)間為協(xié)變量，以(600 nm)值為因變量]。

1.2.4 細(xì)菌游動(dòng)性（Swimming）和涌動(dòng)性(Swarming)測(cè)試 參考Zhang等[14]方法進(jìn)行。按1.2.3制備菌液，用新鮮的LBS液體培養(yǎng)基將菌液稀釋至(600 nm) = 3.0，每個(gè)菌株取3 μL平行3次點(diǎn)樣到含3 g/L瓊脂的LBS半固體平板上，于28℃下靜置培養(yǎng)16 h，測(cè)量菌斑直徑，測(cè)試其游動(dòng)性；同時(shí)取3 μL平行3次點(diǎn)樣到含3 g/L瓊脂的LBS固體平板上，于28℃下靜置培養(yǎng)24 h，測(cè)菌斑直徑，測(cè)試其涌動(dòng)性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。用IBM SPSS Statistics 19軟件進(jìn)行Student’s檢驗(yàn)，=0.05作為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性閾值。

1.2.5 細(xì)菌生物膜形成能力分析 參考Zhang等[14]方法進(jìn)行。按1.2.3制備菌液，用新鮮LBS液體培養(yǎng)基將菌液稀釋至(600 nm) = 3.0，取50 μL菌液接種到裝有5 mL LBS液體培養(yǎng)基的無(wú)菌玻璃試管，于28 ℃下靜置培養(yǎng)48 h，加入200 μL 26 g/L的結(jié)晶紫（終質(zhì)量濃度為1 g/L）染色5 min，棄菌液，并用水輕輕沖洗幾次，加入200 μL 330 mL/L冰乙酸充分溶解結(jié)晶紫，測(cè)定570 nm處光密度值(570 nm)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，數(shù)據(jù)處理同1.2.4。

1.2.6 細(xì)菌胞外蛋白酶活性測(cè)試 參考Zhang等[14]方法進(jìn)行。制備1.2.3的菌液，用新鮮LBS液體培養(yǎng)基稀釋至(600 nm) = 3.0，取3 μL平行3次點(diǎn)樣到含15 g/L脫脂奶粉的LBS固體平板上，于28℃下靜置培養(yǎng)24 h，測(cè)量蛋白質(zhì)透明分解圈直徑，以指示細(xì)菌蛋白酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)處理同1.2.4。

1.2.7 菌株對(duì)H2O2、Cu2+抗性以及對(duì)鐵離子的吸收能力測(cè)試 參考張亞秋[15]方法進(jìn)行。按1.2.3制備菌液，用新鮮LBS液體培養(yǎng)基稀釋至(600 nm) = 3.0，并以10倍梯度稀釋各菌株菌液至最高稀釋倍數(shù)107，將稀釋的菌液分別取3 μL平行3次點(diǎn)樣到LBS平板，以及添加有0.002 mL/L H2O2或0.2 mmol/L CuSO4或120 μmol/L DIP的LBS平板上，于28℃下靜置培養(yǎng)24 h，觀察各菌株生長(zhǎng)情況，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 菌株對(duì)不同抗生素的敏感性測(cè)試 按1.2.3制備菌液，吸取600 μL菌液于10 mL無(wú)菌9 g/L生理鹽水中，傾入寬13 cm的正方形LBS平板，將培養(yǎng)基表面全部潤(rùn)濕，棄去培養(yǎng)皿內(nèi)多余菌液，靜置約10 min，待培養(yǎng)基表面菌液全部晾干，將各抗生素紙片置于平板上，于28℃下靜置培養(yǎng)24 h，觀察并測(cè)量抑菌圈直徑。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，數(shù)據(jù)處理同1.2.4。

參考吳金軍[16]方法分析菌株對(duì)抗生素的最低抑菌濃度（Minimum inhibitory concentration，MIC）：用MH肉湯培養(yǎng)基將培養(yǎng)16 ～ 24 h菌液濃度調(diào)至1×106cfu/mL得上樣菌懸液。制備質(zhì)量濃度為128 μg/mL抗生素母液，在無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)板第1 ～ 10孔中加入100 μL無(wú)菌MH肉湯培養(yǎng)基，在第1孔中加入100 μL抗生素母液，反復(fù)吹吸，混勻，吸取100 μL至第2孔，反復(fù)吹吸，混勻，吸取100 μL至第3孔，以此稀釋至第10孔，每孔終體積為100 μL。向第1 ～ 10孔中加入上樣菌懸液，反復(fù)吹吸，充分混勻，每孔終體積為200 μL，在第11、12孔中分別加入200 μL無(wú)菌MH肉湯培養(yǎng)基（陰性對(duì)照）和待測(cè)菌株懸液（陽(yáng)性對(duì)照），每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行。上樣后置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20 h，根據(jù)美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)CLSI文件判讀實(shí)驗(yàn)結(jié)果[17]。

1.2.9 菌株毒力測(cè)試 取花鱸240尾，于容積100 L的塑料桶中暫養(yǎng)2周，用氣石不間斷充氣。將菌株345-pMMB207、345Δ-pMMB207、345Δ-pMMB207、345Δ-pMMB207-com和345Δ-pMMB207-com劃線于LBS平板，于28℃下培養(yǎng)16 ～ 24 h，挑取單克隆分別接種至LBS玻璃斜面的固體培養(yǎng)基，于28℃下培養(yǎng)16 h，每個(gè)斜面用3 mL生理鹽水洗下菌體。野生株345-pMMB207對(duì)花鱸的半致死劑量LD50為4.49×104cfu/g[18]，將345-pMMB207、345Δ-pMMB207、345Δ-pMMB207-com稀釋至8×LD50，而將345-pMMB207、345Δ-pMMB207、345Δ-pMMB207- com稀釋至10×LD50，按100 μL/尾對(duì)花鱸腹腔注射菌液，每株菌注射30尾，按10尾/桶分別養(yǎng)殖于3個(gè)100 L塑料桶，用氣石不間斷充氣。同時(shí)設(shè)3桶注射同劑量生理鹽水作為對(duì)照組。觀察7 d內(nèi)花鱸死亡情況，比較各組花鱸死亡率差異。

2 結(jié)果

2.1 flhF和CU052_26825缺失突變株構(gòu)建

擴(kuò)增所得線性化自殺質(zhì)粒pSW7848片段約3.3 kb（圖1(a)），上下游同源臂片段均約為1 kb（圖1(b-c)），與預(yù)期片段大小相同。重組自殺質(zhì)粒PCR擴(kuò)增檢測(cè)到約2.3 kb的片段（圖1(d–e)），與預(yù)期片段大小相同，表明重組自殺質(zhì)粒pSW7848-Δ和pSW7848-Δcom構(gòu)建成功。重組自殺質(zhì)粒上的和上下游同源臂片段通過(guò)接合作用分別與哈維弧菌野生株345的和上下游同源臂片段發(fā)生2次同源交換，缺失株P(guān)CR檢測(cè)結(jié)果表明，對(duì)于基因，野生株可擴(kuò)增得1 604 bp的片段，而缺失株可擴(kuò)增出589 bp的片段（圖1(f)），獲得缺失突變株；對(duì)于基因，野生株可擴(kuò)增得1 792 bp的片段，而缺失株可擴(kuò)增出341 bp的片段（圖1(g)），獲得缺失突變株。

M1，DNA分子標(biāo)準(zhǔn)DL5000，各條帶依次為5 000、3 000、2 000、1 500、1 000、750、500、250、100 bp；M2，DNA分子標(biāo)準(zhǔn)為 DL2000，各帶依次為2 000、1 000、750、500、250、100 bp；1，pSW7848線性片段；2-3，分別為上、下游同源臂片段；4-5，分別為上、下游同源臂片段；6-7，分別為重組子pSW7848-ΔpSW7848-Δ檢測(cè)片段；8，野生株345檢測(cè)片段；9，候選突變株檢測(cè)片段；10，野生株檢測(cè)片段；11，候選突變株檢測(cè)片段；其他未標(biāo)注泳道為同時(shí)跑膠的其他實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

M1, DNA Marker DL5000, and the segment size are 5 000, 3 000, 2 000, 1 500, 1 000, 750, 500, 250, 100 bp, respectively; M2, DNA Marker DL2000, and the segment size are 2 000, 1 000, 750, 500, 250, 100 bp, respectively; 1, Linearized segment of pSW7848; 2-3, upstream and downstream homologous segments of; 4-5, upstream and downstream homologous segments of; 6-7, segment of recombinant suicide vector pSW7848-Δ, pSW7848-Δ; 8, segment of345; 9, segment ofdeletion mutant; 10, segment of; 11, segment ofdeletion mutant; The rest unlabeled lanes are the results of other experiment.

圖1和缺失突變株的PCR鑒定

Fig.1 PCR identification for deletion mutants with deletedand

2.2 flhF和CU052_26825回補(bǔ)株構(gòu)建

擴(kuò)增得約7.5 kb的線性表達(dá)質(zhì)粒pMMB207片段（圖2(a)），與預(yù)期片段大小相同。擴(kuò)增得和的回補(bǔ)片段，分別為2 164、2 359 bp（圖2(b-c)）。引物對(duì)com-PMMB207-check-F/R對(duì)二回補(bǔ)株分別擴(kuò)增得2 469、2 664 bp的片段（圖2(d)）。

M1，DNA 分子標(biāo)準(zhǔn)DL15 000，從上到下條帶依次為15 000、10 000、7 500、5 000、2 500、1 000 bp；M2，DNA 分子標(biāo)準(zhǔn)DL5 000，從上到下條帶依次為5 000、3 000、2 000、1 500、1 000、750、500 bp；1，pMMB207線性化片段；2，基因回補(bǔ)片段；3，基因回補(bǔ)片段；4-5，回補(bǔ)重組子pMMB207-compMMB207-com的檢測(cè)片段。

M1, DNA Marker DL15000, and the segment size are 15 000, 10 000, 7 500, 5 000, 2 500, 1 000 bp, respectively; M2, DNA Marker DL5 000, and the segment size are 5 000, 3 000, 2 000, 1 500, 1 000, 750, 500 bp, respectively; 1, pMMB207 linearization segment; 2, the complemented segment of; 3, the complemented segment of; 4-5, the complemented recombinant segments ofand.

圖2和的回補(bǔ)株P(guān)CR鑒定

Fig.2 PCR identification for complemented strain ofand

2.3 哈維弧菌flhF和CU052_26825缺失株的生長(zhǎng)

因3次重復(fù)結(jié)果相同，選擇1次代表性結(jié)果進(jìn)行分析。圖3可見(jiàn)，在LBS培養(yǎng)基中，缺失株345Δ345Δ的生長(zhǎng)與野生株均無(wú)顯著差異（> 0.05），表明和均不影響哈維弧菌的生長(zhǎng)。

圖3 哈維弧菌345、345ΔflhF和345ΔCU052_26825在LBS培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線

2.4 哈維弧菌flhF和CU052_26825缺失株的運(yùn)動(dòng)性

圖4(a)可見(jiàn)，野生株345在15 g/L瓊脂LBS平板上無(wú)涌動(dòng)性，在3 g/L瓊脂LBS平板上也無(wú)游動(dòng)性，且和缺失株在這兩種平板上也均未表現(xiàn)出涌動(dòng)性和游動(dòng)性。3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。二缺失株運(yùn)動(dòng)性相對(duì)野生株均無(wú)顯著差異（> 0.05，圖4(b)），表明和均不影響哈維弧菌的運(yùn)動(dòng)性。

圖4 哈維弧菌345、345ΔflhF和345ΔCU052_26825在15、3 g/L瓊脂LBS平板上的運(yùn)動(dòng)性

2.5 flhF和CU052_26825缺失對(duì)哈維弧菌胞外蛋白酶活性的影響

和缺失后，在含15 g/L脫脂奶粉LBS平板上，胞外蛋白酶分解圈直徑與野生株幾無(wú)差異（圖5(b)），3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。統(tǒng)計(jì)分析表明，缺失株胞外蛋白酶活性相對(duì)野生株均無(wú)顯著差異（> 0.05，圖5(b)），表明和均不影響哈維弧菌胞外蛋白酶活性。

2.6flhF和CU052_26825缺失對(duì)哈維弧菌抗H2O2、Cu2+及吸收鐵離子的影響

在LBS平板，添加0.002 mL/L H2O2、0.2 mmol/L CuSO4、120 μmol/L DIP的LBS平板上，隨稀釋倍數(shù)增加，突變株和野生株菌落數(shù)均減少，稀釋倍數(shù)為107時(shí)，菌落數(shù)明顯變少。相對(duì)于野生株，突變株對(duì)H2O2、CuSO4抗性，鐵離子的吸收均無(wú)顯著差異（圖6）。3次重復(fù)結(jié)果一致，表明和均不影響哈維弧菌對(duì)H2O2、Cu2+的抗性，對(duì)鐵離子的吸收。

圖5 哈維弧菌345、345ΔflhF和345ΔCU052_26825在LBS+15 g/L脫脂奶粉平板上的胞外蛋白酶活性

1，345；2，345ΔflhF；3，345ΔCU052_26825

2.7 flhF和CU052_26825對(duì)哈維弧菌生物膜形成的影響

圖7(a)可見(jiàn)，在玻璃試管中靜置培養(yǎng)后，哈維弧菌野生株和突變株在管壁上僅形成極少量生物膜，而突變株在管壁上形成一層厚厚的生物膜，結(jié)晶紫染色后，管壁上呈清晰的染色圈。3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。圖7(b)可見(jiàn)，突變株與野生株生物膜形成能力無(wú)顯著差異，而突變株相對(duì)野生株，生物膜形成能力極顯著增強(qiáng)（< 0.001）。

回補(bǔ)后，與哈維弧菌野生株345-pMMB207和回補(bǔ)株345Δ-pMMB207-com相比，突變株345Δ-pMMB207形成大量生物膜，并出現(xiàn)較明顯的染色圈（圖7(c)）。統(tǒng)計(jì)分析表明，生物膜形成能力極顯著增強(qiáng)（< 0.001）（圖7(d)），回補(bǔ)株345Δ-pMMB207-com生物膜形成能力與野生株相似，無(wú)顯著差異（圖7(c、d)），表明回補(bǔ)株表型與野生株相似。

2.8 flhF和CU052_26825對(duì)哈維弧菌抗生素敏感性的影響

哈維弧菌野生株，和突變株均對(duì)利福平、多西環(huán)素、萬(wàn)古霉素、復(fù)方新諾明和四環(huán)素等5種抗生素耐藥，對(duì)呋喃唑酮、阿莫西林、氯霉素、環(huán)丙沙星和諾氟沙星等5種抗生素敏感。雖然野生株和2個(gè)突變株對(duì)妥布霉素、慶大霉素、紅霉素和麥迪霉素的抗性不同，但是2個(gè)突變株相對(duì)野生株的抑菌圈直徑無(wú)顯著差異。而2個(gè)突變株對(duì)氟苯尼考和氯霉素更加敏感，抑菌圈直徑相對(duì)野生株菌顯著增大（< 0.05，表2）。

分析發(fā)現(xiàn)，野生株345，缺失株345Δ和345Δ對(duì)氯霉素MIC分別為0.5、0.125、0.125 μg/mL，對(duì)氟苯尼考的MIC分別為16、2、0.5 μg/mL（表3）。

***，差異極顯著the highly significant difference（P < 0.05）

表2 哈維弧菌345、345ΔflhF以及345ΔCU052_26825對(duì)各抗生素抗性

說(shuō)明：R，抗性；S，敏感；I，中介；*，與野生株345差異顯著（< 0.05）。

Notes: R, Resistance; S, Sensitivity; I, Intermediary; *, the significant difference from345 at level of 0.05.

由于回補(bǔ)質(zhì)粒pMMB207有氯霉素抗性，因此，僅用哈維弧菌菌株345-pMMB207、345Δ-pMMB207、345Δ-pMMB207-com345Δ-pMMB207和345Δ-pMMB207-com分析氟苯尼考耐藥性的回補(bǔ)情況，發(fā)現(xiàn)這5株菌對(duì)氟苯尼考的最低抑菌濃度（MIC）分別為16、1、8、1、32 μg/mL（表3）。

表3 各菌株的最低抑菌濃度

2.9 flhF和CU052_26825對(duì)哈維弧菌毒力的影響

缺失組感染劑量為8 LD50（3.59×105cfu/g），生理鹽水組實(shí)驗(yàn)期間未死魚(yú)，其他組在注射12 h后死亡率即達(dá)到8%以上，隨著注射時(shí)間的延長(zhǎng)，死亡率逐漸升高，注射7 d后，345-pMMB207、345Δ-pMMB207和345Δ-pMMB207-com組的累積死亡率分別穩(wěn)定在58.33%、62.50%、66.67%（圖8(a)）。

缺失組感染劑量為10 LD50（4.49×105cfu/g），生理鹽水組實(shí)驗(yàn)期間未出現(xiàn)死魚(yú)，其他組在注射12 h后死亡率即達(dá)到70%以上，隨著注射時(shí)間延長(zhǎng)，死亡率逐漸升高，注射4 d后，345-pMMB207、345Δ-pMMB207、345Δ-pMMB207-com組的累積死亡率分別穩(wěn)定在100.00%、96.67%、100.00%（圖8(b)）。

圖8 各菌株的累積死亡率

3 討論

哈維弧菌是近十多年水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)重要致病菌，可感染蝦（如對(duì)蝦的發(fā)光?。?、魚(yú)（如鱸、大菱鲆的潰瘍?。┖拓悾ㄈ珲U潰爛?。┑萚19]。哈維弧菌的致病性與蛋白酶、溶血素、脂肪酶和脂多糖等胞外產(chǎn)物的分泌，以及發(fā)光、群體效應(yīng)、形成生物膜、噬菌體感染、結(jié)合鐵的能力以及溫鹽等因素有關(guān)[19-20]。如孫鉑光[21]發(fā)現(xiàn)，哈維弧菌突變的VHH溶血素在大腸桿菌中重組表達(dá)后，突變的VHH溶血素S153G失去溶血活性和對(duì)大菱鲆的致病性，說(shuō)明哈維弧菌的溶血素與致病性有關(guān)。郝貴杰等[22]研究大黃魚(yú)（）致病株哈維弧菌GYC1108-1并證實(shí)哈維弧菌胞外蛋白酶為半胱氨酸蛋白酶，攻毒試驗(yàn)顯示，該蛋白酶對(duì)大黃魚(yú)有致死作用，若該酶被熱滅活則失去毒性。因此，深入挖掘哈維弧菌潛在毒力調(diào)控基因，并研究其毒力調(diào)控機(jī)制對(duì)于哈維弧菌病害防治有重要意義。本研究表明，和基因的缺失均不影響哈維弧菌致病菌株345的生長(zhǎng)能力，運(yùn)動(dòng)能力，胞外蛋白酶分泌活性，對(duì)抗H2O2、Cu2+和限鐵環(huán)境脅迫的能力，對(duì)大多數(shù)被測(cè)抗生素的抗性以及對(duì)花鱸的毒性，但是和缺失后對(duì)氯霉素和氟苯尼考兩種氯霉素類抗生素均更為敏感，缺失后生物膜形成能力顯著增強(qiáng)，表明和均參與正調(diào)控哈維弧菌對(duì)氯霉素類抗生素的耐藥性，還參與負(fù)調(diào)控哈維弧菌生物膜形成。這些結(jié)果為哈維弧菌基因功能研究奠定基礎(chǔ)。

生物膜是細(xì)菌黏附于接觸表面，分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂質(zhì)蛋白等，將自身包繞其中而形成的大量細(xì)菌聚集膜樣物[23]，除有助于細(xì)菌黏附宿主細(xì)胞外，還調(diào)控細(xì)菌的耐藥性、幫助細(xì)菌逃避宿主的免疫反應(yīng)等[24]。鞭毛運(yùn)動(dòng)與細(xì)菌生物膜形成，尤其是生物膜形成早期在接觸面的定位與結(jié)合密切相關(guān)[25]。如空腸彎曲菌（）鞭毛基因的插入突變顯著降低細(xì)菌運(yùn)動(dòng)性和食物表面形成生物膜的能力[26]。FlhF是一種信號(hào)識(shí)別粒子型的GTP酶，與弧菌（sp.）、希瓦式菌（sp.）、彎曲桿菌（sp.）、螺桿菌（sp.）和銅綠假單胞菌()鞭毛極性定位相關(guān)[27-31]。此外，F(xiàn)lhF還調(diào)控細(xì)菌的鞭毛數(shù)量[27]。López-Sánchez等[32]和Navarrete等[33]發(fā)現(xiàn)，惡臭假單胞菌（）的轉(zhuǎn)座插入突變體，在生物膜形成、鞭毛合成和鞭毛運(yùn)動(dòng)方面均顯示重大缺陷?？漳c彎曲菌（）FlhF調(diào)節(jié)鞭毛合成，其缺失影響細(xì)菌定植、黏附侵襲和趨化基因的表達(dá)，進(jìn)而改變細(xì)菌對(duì)宿主毒力效應(yīng)[34]。溶藻弧菌（）中，F(xiàn)lhF對(duì)極性鞭毛數(shù)量和細(xì)菌涌動(dòng)群集運(yùn)動(dòng)有正調(diào)節(jié)作用[35]。本研究中，缺失后，哈維弧菌運(yùn)動(dòng)性并無(wú)顯著變化，但生物膜形成顯著增加。因此，缺失可能并不影響哈維弧菌鞭毛數(shù)量，而更多影響哈維弧菌鞭毛的定位，從而影響哈維弧菌對(duì)宿主表面的黏附和結(jié)合以及生物膜的形成。

抗生素廣泛用于預(yù)防或治療水產(chǎn)養(yǎng)殖中的細(xì)菌性疾病[3,36]?？股氐倪^(guò)度使用會(huì)導(dǎo)致耐藥菌產(chǎn)生及食品安全問(wèn)題。解析細(xì)菌耐藥機(jī)制是保證抗生素正確使用的前提和基礎(chǔ)。本研究中，和缺失后對(duì)氯霉素和氟苯尼考這兩種氯霉素類抗生素菌更為敏感，MIC分別是野生株的1/4、1/4和1/8、1/32，表明和均參與氯霉素類耐藥性的調(diào)控。

大多數(shù)臨床分離株中，細(xì)菌對(duì)氯霉素的耐藥性由質(zhì)粒編碼的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT) 介導(dǎo)。CAT催化了氯霉素C-3位羥基的乙?；闪?-乙酰氯霉素，而3-乙酰氯霉素不能與細(xì)菌的核糖體結(jié)合，從而缺乏抗菌活性[37]?；驈V泛存在于革蘭陰性菌和大多數(shù)革蘭陽(yáng)性菌，可位于染色體、R質(zhì)粒，甚至在可轉(zhuǎn)移因子中[37]。還發(fā)現(xiàn)其他與氟苯尼考和/或氯霉素耐藥相關(guān)基因。如位于質(zhì)粒上的非酶抗性基因[38-39]通過(guò)主動(dòng)泵出使菌體內(nèi)氯霉素含量明顯減少而實(shí)現(xiàn)細(xì)菌耐藥[40]；耐藥基因和均位于質(zhì)粒上，是氯霉素和甲砜霉素共同的耐藥機(jī)制，但與氟苯尼考耐藥性均無(wú)直接關(guān)系[41]；Kim等[42]從魚(yú)的巴氏桿菌質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)耐氟苯尼考基因并命名為[37]，隨后在沙門(mén)氏菌、大腸桿菌等病原菌中克隆到的同源基因[37]。此外，與抗生素泵出相關(guān)的基因、多重耐藥基因、外排泵基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子RamA[43-44]與氯霉素和/或氟苯尼考耐藥相關(guān)。除基因位于細(xì)菌染色體外，絕大多數(shù)已知的氟苯尼考和/或氯霉素耐藥相關(guān)基因位于可移動(dòng)遺傳元件。本研究發(fā)現(xiàn)2個(gè)位于染色體上的基因[9]——信號(hào)識(shí)別粒子型的GTP酶編碼基因和未知功能基因，二者均正調(diào)控氟苯尼考和氯霉素的耐藥性，且可能通過(guò)影響哈維弧菌的鞭毛定位，影響哈維弧菌生物膜的形成。細(xì)菌生物膜可調(diào)控細(xì)菌的耐藥性，通過(guò)滲透限制、營(yíng)養(yǎng)限制和耐藥表型機(jī)制導(dǎo)致細(xì)菌耐藥[45]。滲透限制表現(xiàn)為生物膜中多聚糖所構(gòu)成的分子屏障和電荷屏障阻止或延緩某些抗生素滲入[45]。營(yíng)養(yǎng)限制機(jī)制與滲透限制密切相關(guān)，由于生物膜滲透限制的存在，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不易通過(guò)生物膜，而使生物膜內(nèi)營(yíng)養(yǎng)缺乏，內(nèi)層細(xì)菌生長(zhǎng)減慢，處于饑餓狀態(tài)，導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性降低[46]。耐藥表型機(jī)制主要是指細(xì)菌耐藥性的形成與某些生物膜表型相關(guān)基因表達(dá)差異有關(guān)[47]。因此，可能通過(guò)其中某一機(jī)制影響細(xì)菌對(duì)氟苯尼考和氯霉素的耐藥性。而基因可能存在類似RamA轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的作用，通過(guò)調(diào)控其他與氟苯尼考和氯霉素耐藥直接相關(guān)基因的表達(dá)而間接影響細(xì)菌的耐藥性。但具體調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建哈維弧菌和缺失株，與野生株相比，二缺失株生長(zhǎng)、運(yùn)動(dòng)性、胞外酶活性、抗H2O2和Cu2+壓力、吸收鐵的能力以及致病性無(wú)顯著影響，對(duì)氯霉素和氟苯尼考兩種氯霉素類抗生素更加敏感，缺失株生物膜形成能力顯著增強(qiáng)，表明和均參與調(diào)控哈維弧菌對(duì)氯霉素類抗生素的耐藥性，還參與調(diào)控哈維弧菌生物膜形成。本研究豐富了哈維弧菌氯霉素類耐藥性的研究，對(duì)防止氯霉素類藥物耐藥菌的產(chǎn)生和指導(dǎo)氯霉素類藥物的合理應(yīng)用有重要意義。

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Deletion Mutant Construction and Biological Characteristics of Geneandin

DENG Yi-qin1, ZHANG Ya-qiu1,3, LIN Zi-yang1,4, FENG Juan1, CHENG Chang-chang1, MA Hong-ling1, LIU Guang-xin1, SU You-lu2

(1,,,510300,; 2.,,,510225,; 3,201306,; 4.,570228,)

【Objective】 To study the effect of gene deletion of GTP binding protein geneand an unknowngeneon the biological functions of345【Method】Deletion mutant ofandof345 were constructed by homologous recombination technology.The biological characteristics including growth, motility, extracellular protease activity, and drug resistance and toxicity towere compared to the wild type strain【Result】 Neither the deletion ofnoraffected the bacterial growth, motility, extracellular protease activity, pressure sensing to H2O2and Cu2+, absorption and utilization of iron, resistance to most tested antibiotics and toxicity to.However, the deletion mutant ofandwere more sensitive to chloramphenicol and florfenicol.In addition, the ability of bacterial biofilm formation was significantly enhanced with the deletion of.【Conclusion】Theandare involved in regulating the resistance ofto chloramphenicol antibiotics, andis also involved in regulating the biofilm formation of.

;gene knockout;;; biological characteristics; chloramphenicol resistance

S94；Q933

A

1673-9159（2022）02-0001-12

10.3969/j.issn.1673-9159.2022.02.001

2021-10-07

國(guó)家自然科學(xué)基金(31902415)；中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助（2022GH03）；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃資助（2019YFD0900105)；廣東省自然科學(xué)基金(2019A1515011833)；中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（2020XT0407）；中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助（2020TS04）

鄧益琴（1990―），女，博士，副研究員，從事魚(yú)類細(xì)菌病及防治技術(shù)研究。E-mail: yiqindd@126.com

鄧益琴，張亞秋，林梓陽(yáng)，等.哈維弧菌和缺失株的構(gòu)建及其生物學(xué)特性[J].廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2022，42（2）：1-12.

（責(zé)任編輯：劉慶穎）