李亞玲，朱克誠，劉寶鎖，郭華陽，郭 梁，張 楠，楊靜文，江世貴，張殿昌

急性鹽度脅迫下黃鰭棘鯛分子特征及其表達

李亞玲1,2，朱克誠1,3，劉寶鎖1,3，郭華陽1,3，郭 梁1,3，張 楠1,3，楊靜文1,3，江世貴1,3，張殿昌1,3

（1.中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)部南海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點實驗室，廣東 廣州 510300；2.中國農(nóng)業(yè)科學院研究生院，北京 100089；3.廣東省海洋生物種業(yè)工程技術研究中心，廣東 廣州 510300）

【目的】研究基因在急性鹽度脅迫下對黃鰭棘鯛（）的滲透壓調控機理?！痉椒ā坑蒙镄畔W軟件分析的序列特征，用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術檢測其在黃鰭棘鯛各組織內的表達情況及其在鹽度0、8、16、24（對照）和32條件下的表達模式?！窘Y果】開放閱讀框（ORF）大小為3 435 bp，共編碼1 144個氨基酸，存在一個經(jīng)典的Na+-K+-Cl-協(xié)同轉運蛋白SLC12A結構域，且在不同物種中有高保守性。在13個組織中均有表達，在腦中表達量最高，顯著高于其他組織（< 0.05）；其次為鰓，在性腺和肝臟中表達量則顯著低于其他組織（< 0.05）。鹽度脅迫6 h時，在淡水組（鹽度0）中表達量顯著上升（< 0.05）；在鹽度為8和16處理組中，表達量先降低后逐漸升高，隨后趨于平穩(wěn)；在鹽度32處理組，表達量呈先升高后降低最后又升高趨勢，在24 h時最大?！窘Y論】基因在黃鰭棘鯛鹽度適應中發(fā)揮重要作用。

黃鰭棘鯛；；基因表達；急性鹽度脅迫

Na+/K+/2Cl-協(xié)同轉運蛋白（Na+/K+/2Cl-Cotransporter，NKCC）是促進Na+、K+、Cl-進出細胞的跨膜轉運蛋白，廣泛存在于多種動物。NKCC有NKCC1和NKCC2兩種亞型，同屬于溶質載體12轉運家族Na+依賴性亞群[1]。其中，NKCC1含有NKCC1a和NKCC1b兩個亞型[2-3]。參與魚類滲透壓調節(jié)的相關過程，且在維持細胞體積穩(wěn)態(tài)、電解質含量等方面發(fā)揮重要作用。

目前，在底鳉()[4]、鯔()[5]、瑪麗魚()[6]、綠腹麗魚（）[7]、舌齒鱸（）[8]、莫桑比克羅非魚（）[9-12]、歐洲鰻鱺（）[2]、青鳉（）[13]、大西洋鮭（）[14-15]和攀鱸（）[16]等海水硬骨魚類中已有報道，表明在魚體滲透壓調節(jié)過程中起關鍵性作用。底鳉（）移入淡水后，各組織表達均受抑制；在半咸水轉海水后，表達增加[17]。海水馴化后，日本鰻鱺（）鰓的mRNA水平出現(xiàn)明顯上調[2]。在慢性鹽度脅迫條件下，“吉麗”羅非魚 [薩羅羅非魚（）♂×尼羅羅非魚（）♀] 鰓內的表達量和外界水體鹽度呈正相關關系[18]，其他海水硬骨魚類有類似結果[3,19,20]。宋慧[21]提出，在一定鹽度范圍內，隨水體鹽度升高，大銀魚（）胚胎表達量升高。而不同急性鹽度脅迫下，卵形鯧鲹（）鰓、腸和腎的表達量顯著上升[22]。在急性低鹽脅迫條件下，紅鰭東方鲀（）幼魚基因的表達量因鹽度變化和持續(xù)時間的差異而不同[23]。由此可見，在魚類適應鹽度變化的過程中，NKCC是一種負責離子滲透的關鍵轉運蛋白，在魚類滲透調節(jié)中發(fā)揮關鍵性作用。

黃鰭棘鯛（）屬淺海暖水性底層魚類，是重要的海水經(jīng)濟魚類。近年來，由于過度捕撈、環(huán)境污染嚴重、魚病頻發(fā)等，黃鰭棘鯛種質退化嚴重，天然黃鰭棘鯛苗種遠不能滿足實際需要[24]。黃鰭棘鯛苗種培育已取得一定進展，但育苗技術還不穩(wěn)定。稚魚培育是黃鰭棘鯛苗種培育的關鍵階段，鹽度是影響苗種成活與健康生長最重要的環(huán)境因子之一。目前對黃鰭棘鯛的抗鹽脅迫相關基因的研究還未見報道，為深入研究基因在急性鹽度脅迫下對黃鰭棘鯛的滲透壓調控機理，筆者用生物信息學軟件分析其序列特征，并用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術檢測在黃鰭棘鯛各組織內的表達情況及其在急性鹽度脅迫條件下的表達模式，以期為解析基因在黃鰭棘鯛稚魚調節(jié)滲透壓和離子平衡過程中的功能機制奠定基礎，并為黃鰭棘鯛早期苗種培育提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料和實驗設計

實驗用黃鰭棘鯛稚魚由中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所深圳試驗基地提供，體長（13.76 ± 0.74）mm、體質量（0.042 ± 0.022）g（= 80），實驗前暫養(yǎng)一周，保持充氧，水溫（23 ± 2）℃。健康黃鰭棘鯛購自水產(chǎn)市場，隨機取魚3尾，取腦、鰓、鰭、眼、脾、胃、心、腸、皮膚、腎、肌、肝和性腺等13個組織，經(jīng)液氮速凍后置于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

設置0、8、16、24（對照組）和32等5個鹽度梯度，每梯度設3個平行組。取暫養(yǎng)的規(guī)格相近健康黃鰭棘鯛稚魚120尾，分別于各鹽度條件下脅迫0、6、12、24、48、72和96 h，每組每時間點隨機取稚魚6尾，經(jīng)液氮速凍后置于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA提取與cDNA合成

按照HiPure UnIversal RNA Mini Kit（Megen，廣州）試劑盒說明書抽提上述黃鰭棘鯛的總RNA。通過瓊脂糖凝膠電泳、NanoDrop 2000（Thermo Fisher，美國）檢測其完整性及濃度和純度。參照RT Kit with gDNA Clean for qPCR Ⅱ（瑞真，廣州）試劑盒說明書把上述RNA樣品逆轉錄為cDNA用于qRT-PCR。

1.3 NKCC1a序列的獲取

本課題組采用全基因組測序技術獲得黃鰭棘鯛序列[25]，經(jīng)GenBank數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)比對后發(fā)現(xiàn)，其與其他魚類的同源性較高。此外，利用Primer Premier 5.0設計特異性引物（表1）對其開放閱讀框（ORF）進行驗證。以黃鰭棘鯛cDNA為模板進行PCR，25 μL反應體系包括：16.7 μL ddH2O，2.5 μL 10×buffer，2 μL dNTPs，1.5 μL MgCl2，100 μmol?L–1上下游引物各0.5 μL，0.3 μL rTaq酶，(50 ± 5) ng模板cDNA；反應程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 60 s，35個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物送至廣州睿博生物有限公司測序。

表1 實驗用引物

1.4 NKCC1a基因生物信息學分析

用DNAman拼接測序片段，用ORF Finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）預測開放閱讀框，用ExPASy-Compute pI/Mw tool（https://web.expasy.org/compute_pi/）預測等電點和分子質量，用NetNGlyc 1.0 Server（hrvices/NetNGlyc/）預測糖基化位點，用NetPhos 3.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）預測磷酸化位點，用TMHMM Server, v.2.0（htts/TMHMM/）預測跨膜結構域，用SignalP 4.1 Server（http://www.cbs.dtu.dk/services/ SignalP/）預測信號肽，通過NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）預測結構域，用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）預測三維結構，用ClustalW、GENEDOC進行多重序列比對，用MEGA7.0構建系統(tǒng)進化樹。

1.5 實時熒光定量PCR (qRT-PCR)

采用Primer Premier 5.0設計的熒光定量引物（表1）。選擇黃鰭棘鯛作為內參基因并設計引物（表1）。對健康黃鰭棘鯛的腦、鰓、鰭、眼、脾、胃、心、腸、皮膚、腎、肌、肝和性腺組織進行定量分析。采用qPCR檢測在急性鹽度脅迫下，黃鰭棘鯛稚魚在0、6、12、24、48、72和96 h時的表達水平。

根據(jù)SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit（瑞真，廣州）說明書在Roche LightCycler?480Ⅱ（Roche）上進行qPCR反應。反應體系：2×SYBR Green Pro Taq HS Premix 6.25 μL、cDNA模板(50 ± 5) ng，-qF、-qR各0.5 μL（100 μmol·L–1），ddH2O 4.25 μL。反應程序：95℃30 s；95℃ 10 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)。每個樣品設3個重復。PCR結束后確認擴增曲線及熔解曲線，以確保其特異性。

1.6 數(shù)據(jù)處理

實時熒光定量PCR數(shù)據(jù)處理使用2-ΔΔCT法。運用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析（One-Way ANOVA），并采用Duncan檢驗多重比較，結果用平均值 ± 標準差表示，顯著性水平為0.05。用Graphpad Prism軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 NKCC1a生物信息學分析

基因的開放閱讀框（ORF，GenBank登錄號：OK324137）為3 435 bp，編碼1 144個氨基酸，分子質量約124.5 ku，理論等電點為5.75。在預測的氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)有3個N-糖基化位點，15個保守的半胱氨酸殘基和107個磷酸化位點（其中包括64個絲氨酸位點和43個蘇氨酸位點）。SignalP5.0分析顯示，NKCC1a無信號肽（圖1）。

方框內為起始密碼子ATG，用*標記終止密碼子TAA；下劃線部分代表跨膜結構域；陰影部分代表糖基化位點；圓圈表示保守的半胱氨酸

圖1顯示，黃鰭棘鯛NKCC1a含有11個疏水性跨膜（TM）結構域，分別位于第232 ～ 254、264 ～ 286、306 ～ 328、348 ～ 370、377 ～ 399、428 ～ 450、457 ～ 479、541 ～ 563、598 ～ 620、624 ～ 643和656 ～ 678位氨基酸。其中，在TM7和TM8之間存在N-糖基化位點。分析表明，在第158 ～ 1 144位氨基酸是2a30蛋白超家族結構域，典型的NKCC1協(xié)同轉運蛋白氨基酸通透酶結構域和Na+-K+-Cl-共同轉運蛋白SLC12A結構域分別位于第232 ～ 734和743 ～ 1 144位氨基酸。NKCC1a的二級蛋白結構表明，β折疊（4.55%）、α螺旋（42.83%）、無規(guī)則卷曲（38.20%）和延伸主鏈（14.42%）。其預測的三維結構如圖2所示。

氨基酸序列比對表明，黃鰭棘鯛NKCC1a氨基酸與金頭鯛() 的同源性最高（98.51%），其次為舌齒鱸（，93.79%）、眼斑擬石首魚（，93.27%）、大黃魚（，92.57%）、莫桑比克羅非魚（，90.38%）。與人（）、非洲爪蟾（）和小鼠（）的同源性較低，分別是75.35%、75.14%和74.98%，表明NKCC1a基因在魚類中較為保守（圖3）。

圖2 黃鰭棘鯛NKCC1a三級結構

黑色下劃線表示11個跨膜結構域（TMD1-11）；虛線表示Na+-K+-Cl-協(xié)同轉運蛋白SLC12A結構域

Black underline indicates 11 transmembrane domains (TMD1-11); The dotted line indicates the Na+-K+-Cl- cotransporter SLC12A domain

圖3 黃鰭棘鯛NKCC1a與其他物種NKCC氨基酸序列比對

Fig.3 Alignment of amino acid sequence of NKCC fromand other species

系統(tǒng)進化分析顯示，24個物種的NKCC序列分成NKCC1和NKCC2兩個進化支。其中，黃鰭棘鯛NKCC1a聚集到NKCC1a分支中（圖4）。

2.2 NKCC1a組織表達

圖5表明，黃鰭棘鯛13個組織中均有表達，其中表達量最高的組織為腦，且顯著高于其他組織（< 0.05），其次為鰓，而在性腺和肝臟中的表達量則顯著低于其他組織（< 0.05）。

圖4 NKCC1a系統(tǒng)進化樹

不同小寫字母表示兩組間差異顯著(P<0.05)

2.3 在急性鹽度脅迫后NKCC1a基因的表達

圖6可見，隨著脅迫時間的增加，不同鹽度組表達量的增減趨勢不同。自脅迫6 h起，淡水組（鹽度0）表達量顯著上升（< 0.05）；鹽度8和16組先降后升，隨后趨于平穩(wěn)；鹽度32組呈先升高后降低最后又升高趨勢，在24、96 h時顯著高于其他時間點（< 0.05）。。

相同時間點，各實驗組表達量與鹽度24組（對照）均有顯著差異。在6 h時，鹽度0組表達量顯著高于對照組（< 0.05）；而鹽度8和16組表達量顯著低于對照組（< 0.05）。在24和96 h時，鹽度32組的表達量均顯著高于對照組（< 0.05）。

不同小寫字母表示同一時間下不同處理組之間差異顯著(P < 0.05)；不同大寫字母表示同一鹽度下不同時間之間差異顯著(P < 0.05)

3 討論

NKCC1a是上皮細胞內的電中性跨膜轉運蛋白。本研究表明，黃鰭棘鯛NKCC1a N端氨基酸無信號肽，為非分泌型蛋白，中心疏水區(qū)由11個疏水性跨膜（TM）結構域組成。TM2與陽離子親和力有關，TM4和TM7主要影響陰離子親和力[26]。糖基化位點位于TM7-8的胞外環(huán)，該糖基化對細胞轉運活性至關重要[27]。當水體鹽度發(fā)生改變時，魚體通過改變跨膜結構域的離子親和力，控制胞內離子的排泄和吸收而維持穩(wěn)態(tài)平衡。在第743 ～ 1 144位氨基酸有經(jīng)典的Na+-K+-Cl-共同轉運蛋白SLC12A結構域，與金頭鯛、舌齒鱸、斑馬魚（）等的NKCC1a結構域高度一致，表明NKCC1a結構域在不同物種中高度保守，黃鰭棘鯛NKCC1a與其他物種一樣，有潛在的Na+-K+-Cl-離子共同轉運功能。

在莫桑比克羅非魚[3]、卵形鯧鲹[22]、大西洋鮭[28]和舌齒鱸[8]等硬骨魚類組織中均有表達。本研究中，黃鰭棘鯛組織表達譜有廣泛性，在13個組織中均有表達。腦中表達量最高，顯著高于其他組織（<0.05），其次為鰓，而在性腺和肝臟中表達量則顯著低于其他組織（<0.05）。NKCC是依靠Na+-K+-ATPase產(chǎn)生的Na+跨膜電化學勢能差，跨膜運輸Na+、K+、Cl-的繼發(fā)性轉運蛋白[29]。在生物生長發(fā)育過程中，細胞內外Na+、K+濃度會短暫性變化，因此，為滿足黃鰭棘鯛腦組織在生長發(fā)育過程中對能量及離子等的需求，在腦中會出現(xiàn)高表達現(xiàn)象[30]；此外，鰓組織是大部分海水魚類維持體內滲透壓平衡的重要調節(jié)器官[31]。由此推斷，黃鰭棘鯛在滲透調節(jié)器官中有一定功能。

本研究表明，對鹽度變化反應迅速，在轉入淡水后6 h時表達量顯著上升，與卵形鯧鲹（）腸的結果[22]類似。海水硬骨魚類對鹽度適應機制為滲透調節(jié)型[32]，先通過吞飲大量海水吸取水分，后經(jīng)腸道消化吸收，最后由腎和鰓排泄大量離子維持體內滲透壓。置淡水環(huán)境時，吞食水的反射和水分的擴散使魚機體腸內水量增加。為進一步阻止反射和促進水分排泄，魚體內NKCC被激活，基因表達量升高，從而促進離子進入細胞，導致胞內離子濃度增加[22]。黃鰭棘鯛雖有較強的滲透壓調節(jié)能力，但不能在急性條件下很好地適應淡水[33]，即會激活基因以適應低鹽脅迫。在高鹽脅迫下，黃鰭棘鯛表達量增加，表明在黃鰭棘鯛適應高鹽環(huán)境時發(fā)揮一定作用。在歐洲鰻鱺[2]、黑鯛（）[34]、底鳉[17]、莫桑比克羅非魚[9]和龜紋圓鲀（）[35]中也有類似結果。另外，有學者曾解釋，表達量增加與高失水細胞體積恢復相關，表達量增加提高了NKCC活性，將離子從胞外轉運進胞內，使細胞內離子濃度升高，從而有助于高鹽失水后的細胞吸取水分，最終使細胞體積恢復到正常狀態(tài)[35]。本研究高鹽度（鹽度32）脅迫后期，黃鰭棘鯛表達量增加也可能與高失水細胞的體積恢復相關。綜上，該研究有助于揭示黃鰭棘鯛參與細胞滲透壓調節(jié)的功能機理，為魚類滲透壓調節(jié)研究提供一定理論基礎。

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Molecular Characteristics and Expression Analysis offromunder Acute Salinity Stress

LI Ya-ling1,2, ZHU Ke-cheng1,3, LIU Bao-suo1,3, GUO Hua-yang1,3, GUO Liang1,3, ZHANG Nan1,3, YANG Jing-wen1,3, JIANG Shi-gui1,3, ZHANG Dian-chang1,3

（1./&,,510300,; 2.,100089,; 3.,510300,）

【Objective】To study the role ofin the osmoregulation ofunder acute salinity stress.【Method】Bioinformatic approach was used to analyze the sequence of, and real-time quantitative PCR (qRT-PCR) was used to study the expression pattern ofin 13 tissues under acute salinity stress [salinity 0, 8, 16, 24 (control) and 32].【Result】 The open reading frame ofis 3435 bpencoding a 1 144 amino acids protein and has a classic Na+/K+/2Cl-co-transporter SLC12A domain, which is highly conserved in different species.Tissue expression analysis shows thatwas expressed in the 13 tested tissues, highest in the brain and then in gill, lowest in gonads and liver (< 0.05).Under acute salinity stress, the expression level ofin fresh-water group (salinity 0) increased significantly from the 6th hour.In the 8 and 16 salinity group, the expression level ofdecreased initially, then gradually increased, and then leveled off; In the 32 salinity group, the expression level ofshowed an increasing-decreasing-increasing trend, and reached the maximum at the 24th hour.【Conclusion】The results suggest that thegene plays an important role insalinity adaptation.

;; gene expression; acute salinity stress

S917.4

A

1673-9159（2022）02-0020-09

10.3969/j.issn.1673-9159.2022.02.003

2021-11-03

農(nóng)業(yè)部財政重大專項 (NHYYSWZZZYKZX2020)；廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系海水魚產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新項目 (2019KJ143)

李亞玲（1996―），女，碩士研究生，研究方向為水產(chǎn)養(yǎng)殖和遺傳育種。E-mail：940971037@qq.com

張殿昌（1977―），男，博士，研究員，從事水產(chǎn)種質資源與遺傳育種研究。E-mail：zhangdch@scsfri.ac.cn

李亞玲，朱克誠，劉寶鎖，等.急性鹽度脅迫下黃鰭棘鯛分子特征及其表達[J].廣東海洋大學學報，2022，42（2）：20-28.

（責任編輯：劉慶穎）