王 帥， 高 志 剛， 李 曉 瑞， 曲 玥 陽， 叢 燁， 張 索 楠， 羅 勇

(大連理工大學 化工學院，遼寧 大連 116024 )

0 引 言

心臟毒性是指藥物經過血液循環(huán)進入心臟后，作用于心臟各種細胞導致細胞發(fā)生損傷乃至死亡的生物過程，而心肌細胞的受損是諸多心臟疾病例如心律失常、心力衰竭的重要原因[1]．人體內心肌細胞、骨骼肌細胞和神經細胞是沒有再生能力的，所以心臟一旦出現疾病，即便痊愈后心臟功能也無法恢復到之前的水平，從這個角度來看，對于新藥可能存在的心臟毒性，必須慎重篩查[2]．研究藥物的方法有動物實驗和體外實驗．動物實驗有實驗周期過長、耗資巨大、存在著倫理爭議等問題；而體外實驗中傳統(tǒng)的孔板細胞模型囿于其空間結構，難以模擬出體內器官組織的微環(huán)境，同時很難探究多種細胞之間的相互作用．微流控器官芯片可以繼承孔板的已有優(yōu)點，同時規(guī)避上述缺點．微流控是在微米尺度上精確控制流體的技術，對流體的精準操控可以將傳統(tǒng)的生化實驗進一步小型化、空間立體化[3]．器官芯片是微流控在生物領域的具體應用，芯片通過外接泵閥實現內部通道的流體流動，及芯片內多種細胞的液體環(huán)境連接，從而構建出可以模擬體液流動、多種細胞相互作用的體外模型[4]．

傳統(tǒng)中醫(yī)藥是寶貴的歷史財富，如何從古籍中提取出符合現代醫(yī)學標準的內容是中藥現代化的重要工作．盡管擁有長久的中藥用藥經驗，對于各種藥材的毒性有了定性的認識，但因為缺少現代藥理學的量效毒關系，近年來在中藥使用中也發(fā)現了一些不良反應．傳統(tǒng)古籍上對于中藥毒性的大毒、有毒、小毒等定性表述顯然無法滿足中藥研究現代化的要求，中藥材中各種天然藥物成分對于各種靶器官的定量毒性評價顯然是民族醫(yī)藥實現健康發(fā)展的重要一步[5]．

本實驗擬構建一款模擬心臟心肌搏動和毛細血管屏障功能的心臟芯片．在藥物毒性評價方面，本芯片通過觀察加藥前后心肌細胞搏動活力的變化，結合培養(yǎng)液中的損傷標志物肌鈣蛋白(cTnI)和乳酸脫氫酶(LDH)的表達水平檢測，定量檢測3種中藥化學成分心臟毒性，為中藥臨床前毒性評價提供相關數據．

1 實驗部分

1.1 原代心肌細胞的提取與培養(yǎng)

將出生24 h以內的SD幼鼠心臟浸泡在預冷的D-Hank′s溶液中，將心室組織剪碎成1 mm3小塊，加入8 mL 的0.06%胰酶于離心管中，4 ℃消化12 h．加等體積α-MEM培養(yǎng)液(含10%FBS和1%青霉素鏈霉素雙抗)終止胰酶消化，加入0.1%(m/V)的Ⅱ型膠原酶5 mL，密封好離心管，37 ℃水浴3 min，可以觀察到離心管內膠原酶溶液渾濁．加等體積培養(yǎng)液終止消化，使用100 μm細胞過濾篩過濾細胞懸液，1 000 r/min離心5 min 去除膠原酶，加入5 mL的α-MEM培養(yǎng)液重懸細胞．細胞懸液接種到60 mm培養(yǎng)皿中，細胞培養(yǎng)箱靜置90 min，通過差速貼壁法去除培養(yǎng)皿內的成纖維細胞，將培養(yǎng)皿中的心肌細胞懸液細胞計數，以5×105mL-1的密度接種到24孔板和多孔膜上培養(yǎng)[6]．為了方便與孔板對照，將多孔膜面積設定為24孔板中1個孔的面積．

1.2 原代血管內皮細胞的提取與培養(yǎng)

將100 g的SD大鼠腹腔注射20%烏拉坦麻醉(1 mL/100 g)，提取胸腔內心臟放入預冷的D-Hank′s 溶液中，保留心室部分，小心去除心內膜和心外膜，將心室組織剪碎成1 mm3的小塊，吸去培養(yǎng)皿中液體后加入1.5 mL FBS，將組織塊均勻接種在60 mm培養(yǎng)皿內，組織塊間距控制在3 mm之內，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內5 h使其貼壁，補加含20%FBS的α-MEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后去除組織塊，培養(yǎng)皿內貼壁細胞即為原代血管內皮細胞．用0.125%的胰酶消化重懸后，以1×105mL-1的密度將血管內皮細胞接種到24孔板和多孔膜上，接種血管內皮細胞使用的多孔膜與接種心肌細胞的多孔膜為同一尺寸．

1.3 芯片的設計與制造

微流控芯片的制造過程可以概括為掩膜打印、模板光刻、聚二甲基硅氧烷(polydimethyl-siloxane，PDMS)澆筑、芯片組裝4個步驟，其中掩膜使用Adobe Illustrator CS6軟件繪制，如圖1所示，委托打印社打?。?/p>

圖1 芯片掩膜設計圖Fig.1 Design diagram of chip mask

將硅片放置勻膠機于1 000 r/min旋轉1 min，邊旋轉邊滴加3 mL光刻膠，得到100 μm厚的光刻膠涂層，將硅片置于90 ℃熱板靜置3 h后放入光刻機內，蓋上掩膜進行光固化，使用乳酸乙酯洗脫未固化的光刻膠，就得到了芯片內單層結構的模板．將適量的PDMS緩慢倒入模板上，真空箱內靜置30 min去除內部氣泡，放入干燥箱內80 ℃加熱1 h 固化，小心剝離PDMS，對芯片通道部分和培養(yǎng)腔室部分進行打孔，得到了芯片的單層結構[7]．在等離子體清洗儀內進行芯片夾層封接，芯片PDMS部分組裝完畢后使用兩塊PMMA 夾板將芯片壓緊防止漏液．芯片的示意圖如圖2所示，其為上下對齊的兩腔室結構．上層結構為血管屏障模塊，將原代血管內皮細胞種植多孔膜A上；下層為心臟模塊，將心肌細胞種植在下層腔室最上層的多孔膜B上，兩層多孔膜背靠背在芯片內緊貼．

圖2 芯片設計圖Fig.2 Design diagram of chip

芯片結構分為兩層，每層有獨立的液體流動通道，可以實現每種細胞所需培養(yǎng)液的獨立供給，原代血管內皮細胞與原代心肌細胞通過多孔膜實現物質交流，在真實心臟中心肌細胞通過遍布心臟內部的血管來進行物質代謝，心肌細胞并沒有直接暴露在血液中，所以在器官芯片中于心肌細胞上層加一層血管模塊從仿生性角度具有現實根據[1]．

1．4 芯片的組裝與運行

心肌細胞與血管內皮細胞在多孔膜上培養(yǎng)48 h后，將兩張多孔膜背靠背裝入芯片，芯片按照圖2所示安裝完畢，兩個出液口與裝有細胞培養(yǎng)液的5 mL注射器相連，使用注射泵實現注射器穩(wěn)定向芯片內灌注培養(yǎng)液，芯片內液體流向如圖3所示．其中，血管內皮細胞層的α-MEM培養(yǎng)液流速為2 μL/min；由于心肌細胞在體內不直接接觸血液，心肌細胞層的α-MEM培養(yǎng)液流速設置為注射泵最低流速1 μL/min，用5 mL離心管收集芯片流出的培養(yǎng)液．

圖3 芯片內液體流向Fig.3 Liquid flow direction in chip

1.5 芯片功能的表征

為了表征心肌細胞的搏動功能，使用顯微鏡自帶軟件記錄了心肌細胞的搏動視頻，并采用針對性的軟件分析細胞的搏動狀態(tài)[8]，通過跟蹤視頻像素點的變化計算出心肌細胞搏動的速度v和頻率f．

為了表征血管層的緊密連接功能，對血管內皮細胞的VE-鈣黏蛋白(VE-Cadherin)和黏附分子CD146進行免疫熒光染色．VE-Cadherin是細胞間黏連蛋白，在控制血管的通透性方面有至關重要的作用[9]．CD146是一種血管內皮細胞特異性表達的黏附因子，最早是一種用于診斷黑色素瘤的生物標志物[10]，但隨著研究的深入，CD146被發(fā)現參與到機體的各種正常生理活動中，最新的研究還表明CD146不僅有激發(fā)血管內皮細胞功能的作用，還可以充當內皮細胞與機體內鄰近其他細胞之間的信使，促進血管內皮細胞發(fā)育，從而使得血管成熟[11]．

1.6 天然藥物化學成分的心臟毒性檢測

本實驗共檢測雷公藤甲素、氯化兩面針堿、莨菪堿3種藥物化學成分的心臟毒性，以阿霉素作為陽性對照，根據已有文獻設置藥物作用濃度：(1)阿霉素，1、5、10、50 μmol/L；(2)雷公藤甲素，10、50、100、200 nmol/L；(3)莨菪堿，10、50、100、200 μmol/L；(4)氯化兩面針堿，5、10、15、20 μmol/L[12-15]．將灌注培養(yǎng)液替換成含有藥物的培養(yǎng)液，每個濃度平行組數量為3，作用24 h后收集心肌細胞層流出的培養(yǎng)液，使用索萊寶LDH試劑盒和Dogesce cTnI Elisa試劑盒檢測細胞上清液中LDH、cTnI的表達水平．LDH是一種廣泛存在于機體內各種細胞胞質內的糖酵解酶，腎臟、心臟中LDH含量最高．當細胞膜受到損傷破裂后，LDH就會釋放到血液中，因此LDH是心臟疾病臨床檢測的一個重要指標，心肌受到損傷，病人血清中的LDH含量會顯著升高[16]．心肌肌鈣蛋白(cTn)只存在于心肌細胞的胞漿中，是一種很重要的心肌標志物．在臨床檢測中，如果檢測到患者血液中cTn含量有不正常升高，可以提示醫(yī)生患者的心肌受到損傷[17]，本實驗檢測的是cTn的3種亞型之一的cTnI．

為了直觀表征藥物對心肌細胞的損傷，本實驗對芯片內的心肌細胞進行了活死染色分析．將種有心肌細胞的多孔膜從芯片中取出，于35 mm圓皿中使用凱基生物活死染料試劑盒進行細胞活死染色實驗．

為了比較芯片與孔板的區(qū)別，對24孔板中的心肌細胞作用相同濃度的藥物，其中每個孔加入800 μL，作用24 h后收集細胞培養(yǎng)上清液．為了跟芯片流出液比較，用α-MEM培養(yǎng)基將上清液稀釋至芯片流出液相同體積，使用同樣方法檢測上清液中LDH和cTnI的表達水平．

使用Olympus顯微鏡軟件記錄下芯片中和孔板內加藥前后心肌細胞搏動的視頻，使用軟件分析出心肌細胞的搏動狀態(tài)．

1.7 統(tǒng)計學分析

所有數據均用Microsoft Excel 2016軟件進行分析，組內采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗．各組數據采用x±S表示，統(tǒng)計學顯著性差異表示為*p<0.05，**p<0.01．

2 實驗結果

2.1 心肌細胞圖像分析

如圖4所示，心肌細胞搏動狀態(tài)可以分為兩方面：一方面是細胞搏動的最大速率vmax，其代表著心臟搏動一次的力度；另一方面是細胞搏動的頻率，代表著心臟搏動的快慢．從這兩個維度上來看，心肌細胞在芯片中都可以保證穩(wěn)定的生理活動，心肌細胞的搏動狀態(tài)與很多因素有關，如培養(yǎng)液成分、環(huán)境溫度和細胞密度．通過多次實驗確定在本實驗環(huán)境下心肌細胞搏動的正常狀態(tài)為峰值速度vmax=(60±7.56)μm/s，搏動頻率f=(15±0.53)min-1．

圖4 芯片內心肌細胞搏動的速率-時間圖Fig.4 Velocity-time diagram of beating state of cardiomyocyte on chip

2.2 血管內皮細胞的緊密連接表征

如圖5和6所示，在芯片內DAPI、VE-Cadherin 和CD146有非常旺盛的表達，這說明了在芯片內血管內皮細胞形成緊密連接，并且正處于不斷發(fā)育生成血管的階段．

(a)DAPI(b)VE-Cadherin(c)融合圖圖5 芯片內血管內皮細胞細胞核、VE-Cadherin免疫熒光圖及融合圖Fig.5 Immunofluorescence diagram of nucles,VE-Cadherin and merged of VEC on chip

(a)DAPI(b)CD146(c)融合圖圖6 芯片內血管內皮細胞細胞核、CD146免疫熒光圖及融合圖Fig.6 Immunofluorescence diagram of nucles,CD146 and merged of VEC on chip

2.3 天然藥物化學成分的心臟毒性分析

藥物在芯片中作用24 h心肌細胞活死情況如圖7所示，可以看到隨著藥物濃度的升高，芯片內心肌細胞的死亡比例也隨之增加．

(a)阿霉素

如圖8和9所示，4種藥物作用后培養(yǎng)液內的LDH、cTnI濃度變化都呈現出劑量依賴性．在低濃度下，芯片中的LDH、cTnI檢測值均低于孔板實驗，說明芯片中的心肌細胞對藥物有更好的耐受性．在較高濃度下，因為血管內皮細胞大量死亡導致其屏障功能被破壞，芯片和孔板的心肌細胞受損情況更為接近．

(a)阿霉素

(a)阿霉素

心肌細胞搏動圖像見圖10和11，4種藥物作用24 h后均會減弱心肌細胞搏動的活力，在芯片和孔板中，心肌搏動的峰值速率、搏動頻率都出現了減弱和規(guī)律性降低的現象，在高濃度組可以觀察到心肌細胞停止搏動的情況出現，并且在芯片中的細胞搏動活力要強于孔板內．

(a)阿霉素

(a)阿霉素

3 結 語

器官芯片可以視為傳統(tǒng)孔板細胞模型的升級優(yōu)化，其在細胞生長微環(huán)境以及不同細胞間相互作用體外仿真程度方面有了進一步的提升．本實驗的心臟芯片模擬了心肌細胞和毛細血管之間的相互作用，與孔板模型相比，藥物經過血管內皮細胞層后運輸至心肌細胞這一結構可以顯著提高心肌細胞藥物毒性的耐受性．

在驗證了芯片的仿生性優(yōu)勢后，對3種天然藥物化學成分雷公藤甲素、氯化兩面針堿、莨菪堿的芯片內實驗證明了在一定濃度下，三者會對心肌細胞造成損傷．本芯片有潛力成為未來檢測藥物心臟毒性的體外模型．