胡 昂，劉宇文，賴仲宏，張 彌，胡澤明，鐘佳寧

（1. 贛南醫(yī)學(xué)院2018級本科生；2. 贛南醫(yī)學(xué)院2018級碩士研究生；3. 贛南醫(yī)學(xué)院2017級本科生，江西 贛州 341000；4. 南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科，江蘇 南京 210000；5. 贛南醫(yī)學(xué)院心腦血管疾病防治教育部重點實驗室，江西 贛州 341000）

腫瘤血管生成（Tumor angiogenesis）是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)過程中必不可缺的過程［1］。通過抑制血管新生治療腫瘤，憑借治療不良反應(yīng)較小的優(yōu)點，其很快便成為一種可供選擇的臨床腫瘤治療方法，但目前對于腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中血管新生的具體作用機制仍不清楚。因此，研究其所涉及的分子及其信號通路對臨床上開發(fā)新的治療策略具有重大意義。

表觀遺傳學(xué)（Epigenetics）是在基因核苷酸序列不發(fā)生改變的前提下研究可遺傳基因表達調(diào)控方式的學(xué)科，包括DNA 甲基化、組蛋白修飾、非編碼RNA調(diào)控、染色質(zhì)重塑等［2］。近些年研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白修飾在表觀遺傳修飾中占據(jù)重要角色，并參與了多種疾病包括腫瘤的發(fā)生發(fā)展［3］。其中，血管生成與組蛋白修飾有著密切的聯(lián)系，也是當(dāng)前研究的熱點和難點。因此本文就組蛋白修飾影響腫瘤血管生成的研究現(xiàn)狀作一系統(tǒng)闡述。

1 組蛋白修飾

1.1 組蛋白與組蛋白修飾概述 組蛋白是染色體的結(jié)構(gòu)蛋白，由H1、H2A、H2B、H3及H4組成。其與DNA 形成染色質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位核小體，每個核小體由146 對堿基圍繞組蛋白八聚體構(gòu)成，組蛋白八聚體由4 種組蛋白H2A、H2B、H3、H4 各兩個分子組成。核小體通過核心顆粒之間的連接DNA 相互串聯(lián)并進一步折疊形成染色質(zhì)纖維，組蛋白修飾的過程主要發(fā)生在賴氨酸和精氨酸兩個修飾位點。組蛋白修飾是指組蛋白在相關(guān)酶的作用下發(fā)生乙?；?去乙?；?、甲基化/去甲基化、泛素化、磷酸化、SUMO 化、生物素化等修飾的動態(tài)變化過程，目前，研究較多的是組蛋白的甲基化與乙?；?。組蛋白修飾一般需要3種成分參與：組蛋白修飾酶、組蛋白去修飾酶、效應(yīng)分子，組蛋白修飾酶和去修飾酶的作用是催化或去除蛋白特定位點上的修飾基團，而效應(yīng)分子的作用是通過自身某些結(jié)構(gòu)域特異性識別相應(yīng)的組蛋白修飾基團并與其下游分子結(jié)合發(fā)揮作用。此類效應(yīng)分子主要指MSK1/2、p300、PRMT和hMOF 等，而其中起到特異識別作用的結(jié)構(gòu)域主要包括Chromo Domain、Tudor Domain、MBT Domain、PHD Domain、WDR40 Repeats、Ankyrin Repeats 等［4］（表1）。組蛋白修飾在特定的細胞周期中在特定的組蛋白位點上發(fā)揮作用，并發(fā)生相應(yīng)的翻譯后修飾從而可以在不同條件下改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能。研究至今，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)組蛋白修飾在腫瘤、慢性腎病、動脈粥樣硬化、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌疾病、炎性病變等多種疾病或病理過程中發(fā)揮著重要的作用［5］。

表1 常見的組蛋白修飾類型、位點及其效應(yīng)分子

1.2 組蛋白乙?；c去乙?；?乙?；堑谝环N被發(fā)現(xiàn)的組蛋白翻譯后修飾。該過程主要由組蛋白乙?；福℉istone acetylases，HATs）和組蛋白去乙?；福℉istone deacetylases，HDACs）催化完成。乙?；饕l(fā)生在組蛋白H3 和H4 的賴氨酸殘基上。HATs 通過在氨基酸殘基的ε-氨基基團上引入疏水的乙?；糠郑拱被系恼姾杀坏窒?，導(dǎo)致DNA 與組蛋白間的空間位阻增大，造成兩者間的相互作用減弱。核小體的結(jié)構(gòu)變得松弛，染色質(zhì)處于轉(zhuǎn)錄活性狀態(tài)，有利于轉(zhuǎn)錄因子與DNA 分子相結(jié)合，進而激活基因轉(zhuǎn)錄。HDACs 則移去組蛋白氨基酸殘基上的乙酰基，帶正電的氨基酸殘基與DNA 分子的電性相反，因此組蛋白和DNA 穩(wěn)定結(jié)合，染色質(zhì)呈緊密卷曲的結(jié)構(gòu)從而抑制基因轉(zhuǎn)錄。組蛋白乙?；苏{(diào)控基因轉(zhuǎn)錄外，還被發(fā)現(xiàn)參與調(diào)節(jié)血管生成、細胞周期、復(fù)制、DNA 修復(fù)、DNA 應(yīng)激反應(yīng)、凋亡、自噬等基本細胞過程［6-8］。

1.3 組蛋白甲基化與去甲基化 組蛋白甲基化是一種比組蛋白乙酰化更為復(fù)雜的翻譯后組蛋白修飾方式。甲基化主要發(fā)生在組蛋白H3和H4的賴氨酸或精氨酸殘基上，組蛋白甲基化主要由組蛋白甲基化酶（Histone methyltransferases，HMTs）和組蛋白去甲基化酶（Histone demethylase，HDMs）催化完成（圖1）。目前，一般將組蛋白甲基化歸類為組蛋白賴氨酸殘基的單甲基化、雙甲基化或三甲基化，精氨酸殘基的單甲基化、雙甲基化和非對稱雙甲基化。在組蛋白的殘基上添加甲基對基因表達的影響取決于其添加的殘基位點和添加的基團數(shù)量，如組蛋白H3K4 的二甲基化、三甲基化（H3K4me2、H3K4me3）以及H3K36 的三甲基化（H3K36me3）與下游基因的轉(zhuǎn)錄激活有關(guān)，而H3K36 的二甲基化（H3K36me2）、H3K27 的三甲基化（H3K27me3）與基因沉默有關(guān)［9-10］。組蛋白甲基化除了調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄外，還被發(fā)現(xiàn)參與調(diào)節(jié)基因組的完整性、X染色體失活、異染色質(zhì)形成以及細胞發(fā)育等過程［11］。

圖1 組蛋白乙酰化、甲基化和磷酸化修飾示意圖（以賴氨酸和蘇氨酸為例）

2 血管生成

2.1 血管生成概述 血管生成一般包括血管形成（Vasculogenesis）和血管新生（Angiogenesis）兩種方式，前者是通過血管母細胞分裂增殖形成完整的血管系統(tǒng)，而后者是指活體組織在已存在的微血管集合域上芽生出新的以毛細血管為主的血管系統(tǒng)的過程。血管生成過程受到許多內(nèi)源性誘導(dǎo)因子影響，這些因子通常與其抑制因子如血小板反應(yīng)素（Thrombospondins）、血管抑素（Angiostatin）、內(nèi)皮抑素（Endostatin）等保持平衡。當(dāng)機體內(nèi)這種平衡被打破時，就可能會促進或抑制血管生成。血管生成常見于傷口愈合、損傷修復(fù)、腫瘤生長和轉(zhuǎn)移等過程，而在成年個體正常情況下比較少見，僅見于卵巢黃體血管的周期性生長以及懷孕期間的血管生成。

2.2 腫瘤血管生成 腫瘤血管生成是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)過程中最基本的因素之一。在腫瘤中血管主要生成方式為血管新生（Angiogenesis）即原有血管出芽。腫瘤血管生成很大程度上影響著腫瘤的發(fā)展，一般認為腫瘤直徑達到1～2 mm后，若無新生血管生成提供營養(yǎng)將不能繼續(xù)生長［12］。腫瘤血管生成有許多關(guān)鍵的步驟，主要包括腫瘤細胞和炎癥細胞（主要為巨噬細胞）分泌大量促血管生成因子、細胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）的局部降解產(chǎn)生細胞間隙、內(nèi)皮細胞的遷移與增殖、管腔的形成與成熟，最終導(dǎo)致新生的腫瘤血管形成。與正常血管相比，腫瘤血管是雜亂無章的，不具有從小動脈到毛細血管再到小靜脈的正常層次結(jié)構(gòu)，且內(nèi)皮細胞不與壁細胞直接接觸，而是與基底膜松散連接，所以腫瘤血管更容易發(fā)生滲漏。腫瘤血管生成的每一步都會受到各種細胞信號、細胞因子的影響，如缺氧誘導(dǎo)因子-1（Hypoxia inducible factor-1，HIF-1）、血 管 內(nèi) 皮 生 長 因 子（Vascular endothelial growth factor，VEGFs）、成纖維細胞生長因子（Fibroblast growth factor，F(xiàn)GF）、基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMPs）和血小板衍生生 長 因 子（Platelet-derived growth factors，PDGF）等［13］。在快速生長的腫瘤中，腫瘤血管生成的進程在上述影響因子的作用下觸發(fā)，導(dǎo)致正常靜止的內(nèi)皮細胞增殖和萌發(fā)。有研究報道，腫瘤血管生成還存在一種稱為“血管生成擬態(tài)”的現(xiàn)象，它通過腫瘤細胞自身的分裂增殖生成類似血管的管狀結(jié)構(gòu)直接與血管相通，不再依賴血管生成而通過該種特殊結(jié)構(gòu)直接參與腫瘤微循環(huán)過程［14］。近些年，抑制腫瘤血管生成一直是熱門的研究方向之一，這種通過切斷腫瘤細胞增殖的營養(yǎng)供應(yīng)來治療腫瘤的方法可以很大程度減小藥物對人體正常組織的毒副作用。貝伐單抗（Avastin）是一種人源化的抗VEGF-A單克隆抗體，也是第一種應(yīng)用于臨床以血管新生為靶點的藥物，現(xiàn)已被用于治療乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌等惡性腫瘤，但這種方法的療效仍存在一定的爭議［15］。此外，還有一些基于血管新生的藥物如血管抑素和內(nèi)皮抑素等也已經(jīng)通過臨床試驗并投入使用。

3 組蛋白修飾與腫瘤血管生成

3.1 組蛋白乙?；c腫瘤血管生成 近年研究提示，組蛋白乙?；腿ヒ阴；赡芡ㄟ^兩種作用機制影響腫瘤血管生成，一種是腫瘤細胞的過度增殖導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境低氧，低氧環(huán)境誘導(dǎo)某些去乙?；福℉DAC1、HDAC2、HDAC3）在腫瘤細胞中表達增加，進而導(dǎo)致VHL 蛋白的表達減少［16］。VHL 蛋白可以通過雙加氧酶識別HIF-1A 并使其泛素化，從而使HIF-1A 被蛋白酶體識別并降解。因此，VHL蛋白表達下調(diào)會導(dǎo)致特異轉(zhuǎn)錄因子HIF-1A 表達增加［17-18］。隨后，HIF-1A 轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)與增強子等遠端調(diào)控序列和HIF-1B 結(jié)合形成復(fù)合物，之后與缺氧反應(yīng)元件（Hypoxia responsive element，HREs）結(jié)合，啟動VEGF 等相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄從而促進血管新生［19-20］。TUDISCO L 等［21］通過誘導(dǎo)低氧環(huán)境下培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞胎盤生長因子（Placenta growth factor，PlGF）的表達，發(fā)現(xiàn)PlGF 的內(nèi)含子中組蛋白H3 和H4 呈高乙?；癄顟B(tài)，表明HIF-1A 通過HREs位點的染色質(zhì)重塑直接參與缺氧條件下PlGF 表達的上調(diào)。與其類似的是，乙?；D(zhuǎn)移酶p300 在低氧下可以通過HIF-1A 與血管內(nèi)皮生長因子啟動子中的HREs 結(jié)合，從而上調(diào)VEGF 的轉(zhuǎn)錄水平［22］。

相關(guān)研究［23-24］報道了另一種機制，熱休克蛋白（Heat shock protein，HSP）通過與HIF-A 相互作用進而影響腫瘤血管生成。熱休克蛋白90（HSP90）作為一種分子伴侶蛋白可以協(xié)助某些蛋白質(zhì)正確折疊或與其形成復(fù)合物并增強穩(wěn)定性，此類蛋白包括Akt、Raf、Her-2、HIF-A 及p53［25］。HIF-A 和HSP90 結(jié)合后將使復(fù)合物趨于穩(wěn)定，但是，受相關(guān)組蛋白乙?；挠绊?，HSP90 的穩(wěn)定作用將會大大降低并促使HIF-A 被蛋白酶體降解［26］。進而，HIF-A 的減少代償性地造成HSP90 表達增多，導(dǎo)致侵襲相關(guān)蛋白MMP-2和VEGF 表達降低從而也抑制了腫瘤血管生成［27］。此外，熱休克蛋白60（HSP60）也在腫瘤血管生成過程中發(fā)揮一定的作用。有研究表明，幽門螺旋桿菌源性的HSP60 可以促進細胞遷移與血管結(jié)構(gòu)的形成從而促進胃癌的血管新生進程［28］。可見組蛋白去乙?；悄[瘤發(fā)生發(fā)展過程中的一個重要影響因素，因此，組蛋白去乙?；敢种苿℉is‐tone deacetylase inhibitor，HDACi）也隨之成為臨床上一種新的腫瘤治療手段［29］。HDACi 一般會使啟動子區(qū)域染色質(zhì)內(nèi)組蛋白H3 的乙酰化程度明顯升高，還會使VEGF 及VEGFR 的蛋白表達水平明顯降低［30］。HIF-A 在正常氧濃度下是不穩(wěn)定的，而目前認為，Ⅱ類HDAC 如HDAC4［31］、HDAC6［32］可以通過介導(dǎo)氨基末端去乙?；揎梺碓鰪奌IF-A 的穩(wěn)定性。因此Ⅱ類HDAC 的特異抑制劑如TSA、LAQ824、PXD101、LBH589 和SAHA 等可以直接影響HIF-A 的轉(zhuǎn)錄活性和功能從而調(diào)節(jié)腫瘤血管生成［33］。HDACi 的作用也在一定程度上佐證了組蛋白乙?；谀[瘤血管生成和內(nèi)皮細胞增殖中所起的作用。

3.2 組蛋白甲基化與腫瘤血管生成 組蛋白甲基化可以影響染色質(zhì)轉(zhuǎn)錄區(qū)的開放狀態(tài)、染色體的失活狀態(tài)和DNA 修復(fù)，相關(guān)下游基因的表達與組蛋白甲基化有關(guān)，并且組蛋白甲基化參與包括血管生成等多種代謝過程。EZH2 一種可以介導(dǎo)H3K27me3修飾組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶［34］。已有研究表明，EZH2參與了正常的血管生成，DREGER H 等［35］發(fā)現(xiàn)當(dāng)沉默EZH2 后人臍靜脈內(nèi)皮細胞（Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）毛細血管形成和細胞黏附、遷移等受到抑制。其次，多項研究也發(fā)現(xiàn)，EZH2也參與了腫瘤血管生成的相關(guān)過程。CREA F等［36］研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細胞中EZH2 介導(dǎo)了抗腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑的沉默。RICHTER G H 等［37］觀察到EZH2 促進腫瘤血管生成并且參與了腫瘤干細胞（Cancer stem cell，CSC）向血管內(nèi)皮細胞的轉(zhuǎn)化。NAKAGAWA S 等［38］運用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)EZH2 與腫瘤血管生成具有相關(guān)性，且采取膽管癌患者樣本進一步分析EZH2和VASH1表達的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)EZH2 的高表達與腫瘤血管生成的激活有關(guān)，并且其介導(dǎo)的血管新生通路的激活可以用來預(yù)測膽管癌患者的預(yù)后。

G9a 作為一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，參與了H3K27me 和H3K9me 的修飾［39］。普遍認為，G9a 在腫瘤細胞增殖和腫瘤血管生成中都發(fā)揮著必不可缺的作用［40］。在一項關(guān)于宮頸癌的研究中用G9a組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶（Histone methyltransferase，HMT）抑制劑處理SiHA 細胞發(fā)現(xiàn)，某些血管生成因子如VEGF、IL-8 和血管生成素等的表達均被明顯抑制，而且用該抑制劑配制的條件培養(yǎng)液抑制了內(nèi)皮細胞的增殖、遷移［41］。與組蛋白乙酰化相似的是，G9a甲基化影響腫瘤血管生成也與HIF-1A有關(guān)。有研究報道，HIF-1A蛋白的穩(wěn)定性和功能受到甲基化的影響，特異性抑制G9a 后不僅導(dǎo)致VEGFA 和HIF-1A的表達下調(diào)，而且可以加速蛋白酶體對HIF-1A的降解。而且，使用G9a 抑制劑還能抑制HUVECs 中MMP2和FAK的活性進而影響血管新生過程中的基質(zhì)降解［42］。以上結(jié)果表明，G9a 可能在一定程度上參與了腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的血管新生。有趣的是，還有報道稱G9a調(diào)控VEGFA mRNA 前體的可變剪接，但這種選擇性剪接并不改變總的VEGFA mRNA 水平［43］。此外，還有一些組蛋白甲基化酶如DOT1L、SMYD3 和組蛋白去甲基化酶如LSD1 均與腫瘤血管生成有關(guān)。組蛋白甲基化酶DOT1L 敲除導(dǎo)致細胞存活率、遷移、血管形成、毛細血管發(fā)芽減少，并抑制體內(nèi)功能性血管網(wǎng)絡(luò)的形成，而且DOT1L 可以與轉(zhuǎn)錄因子Ets-1 協(xié)同調(diào)節(jié)VEGFR2（VEGF receptor 2）的表達［44］。關(guān)于組蛋白甲基化酶SMYD3，其在結(jié)直腸癌、肝細胞癌和乳腺癌中的表達水平升高。并且，SMYD3 可以甲基化VEGFR1 第831 位賴氨酸殘基，甲基化的VEGFR1 可以增加其在細胞中的激酶活性［45］。組蛋白去甲基化酶LSD1使HIF-1A 在第391 位賴氨酸殘基去甲基化，以保護HIF-1A 免受泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解，LSD1 穩(wěn)定的HIF-1A 與CBP 和MTA1 協(xié)同作用可以增強VEGFA誘導(dǎo)的腫瘤血管生成［46］。在前列腺癌中，LSD1的高表達與腫瘤復(fù)發(fā)和VEGFA的表達增加相關(guān)，沉默前列腺癌細胞中LSD1 的表達可以降低VEGFA 的表達［47］。

3.3 其他組蛋白修飾與腫瘤血管生成 有研究顯示，EYA 蛋白介導(dǎo)的組蛋白H2AX 第142 位酪氨酸（Tyrosine）的去磷酸化修飾可以促進細胞遷移、血管生成和轉(zhuǎn)移［48］。WANG Y等［49］發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞中EYA3的缺失顯著減少了異種移植瘤的腫瘤血管生成，限制了腫瘤生長。然而，腫瘤細胞中EYA3 缺失雖然降低了腫瘤細胞增殖和腫瘤生長，但是該缺失并不影響腫瘤的血管生成。這就提示EYA3 可能通過內(nèi)皮細胞某種自主作用機制調(diào)控腫瘤血管生成。相關(guān)研究報道，作為一種進化保守的多梳蛋白（Polycomb proteins，PcGs），Yin Yang 1（YY1）通過調(diào)控細胞周期參與了數(shù)種實體和血液腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移，沉默YY1 可以在一定程度上減少腫瘤的血管生成［50-51］。INFANTE T等［52］對YY1 進一步研究發(fā)現(xiàn)，YY1 可能參與了缺氧環(huán)境下的組蛋白修飾。在低氧環(huán)境下，VEGFA 的非翻譯區(qū)末端組蛋白泛素化修飾加強。因此，YY1 介導(dǎo)的腫瘤血管生成可能與VEGFA 非翻譯區(qū)的組蛋白泛素化修飾有關(guān)。組蛋白SUMO化可以拮抗賴氨酸側(cè)鏈上的乙酰化修飾和泛素化修飾，SUMO 化通常被認為起到轉(zhuǎn)錄抑制作用［53-54］，因此，SUMO 化可能通過影響其他組蛋白修飾而影響腫瘤血管生成。組蛋白修飾中單獨一種修飾類型往往不能發(fā)揮效應(yīng)，修飾過程中存在著特殊的修飾級聯(lián)效應(yīng)，即某種先發(fā)生的修飾可以促進或抑制之后發(fā)生的相關(guān)修飾，表現(xiàn)為某種修飾為另一種修飾發(fā)生所必需的前提［4］。如LEE J S 等［55］的研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白H2B 泛素化修飾是H3K4 發(fā)生甲基化的前提。組蛋白修飾級聯(lián)效應(yīng)的存在提示我們上游修飾可能通過影響下游修飾從而影響最終的生物學(xué)效應(yīng)。研究表明，H3K4 的三甲基化等修飾增加導(dǎo)致VASH2在肝癌細胞中異常表達，VASH2通過SVBP 介導(dǎo)的旁分泌機制參與和促進肝癌的血管生成［56］。該項研究中H3K4 的三甲基化的上游修飾可能就包括了uH2B修飾并受其影響，所以某些組蛋白修飾可能通過其下游修飾間接參與調(diào)控過程。

4 總結(jié)與展望

腫瘤血管生成是在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)過程中至關(guān)重要的一個環(huán)節(jié)，該過程受到DNA 甲基化、組蛋白修飾等多種因素的調(diào)控。已有研究證明，最為廣泛修飾的組蛋白乙?；图谆c腫瘤血管生成密切相關(guān)，組蛋白修飾酶和去修飾酶在這一過程中發(fā)揮重要作用。其可以通過作用于癌基因、改變自身表達量、與熱休克蛋白相互作用等方式調(diào)節(jié)該生物學(xué)過程。因此，組蛋白修飾酶抑制劑被認為是一種具有抗腫瘤血管生成潛力的藥物，并可能將成為一種新型的腫瘤治療方式，相關(guān)抑制劑在作用過程中對腫瘤組織的特異性識別是目前亟待解決的問題?？傊?，通過研究腫瘤細胞或者相關(guān)腫瘤血管中的表觀遺傳學(xué)改變，很可能在不久的將來為治療某些癌癥提供新方法和新思路。