付冬梅，周 婧，王 浪，羅 陽，蘭 紅，李素蘭，王 勁

（資陽市雁江區(qū)人民醫(yī)院口腔科，四川 資陽 641300）

創(chuàng)傷、炎癥和手術(shù)過程導(dǎo)致的骨缺損給功能性牙槽骨的美學(xué)重建帶來了很大的困難，促進(jìn)牙槽骨的再生已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)［1］。成骨細(xì)胞作為牙槽骨組織工程的重要組成部分，被廣泛用于新骨的再生和骨缺損的修復(fù)。組織工程（Tissue engi‐neering，TE）是現(xiàn)代再生醫(yī)學(xué)的概念之一，這種多學(xué)科的方法，將醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、材料學(xué)聯(lián)系起來。在TE 中，支架作為支持材料，可以植入細(xì)胞或其他補(bǔ)充因子，在體外制備，用作受損組織再生的植入物［2］。β-磷酸三鈣作為支架材料，不僅可以釋放大量鈣離子促進(jìn)新骨生成，還具有良好的生物相容性和生物安全性，其已在骨科領(lǐng)域廣泛用作骨替代物［3］。此外有研究表明，血小板纖維蛋白（Plateletrich fibrin，PRF）中富含多種生長因子，對(duì)成骨細(xì)胞的增殖、分化具有促進(jìn)作用［4］，然而PRF 作為補(bǔ)充因子加入β-磷酸三鈣支架材料后，是否對(duì)成骨細(xì)胞的增殖分化具有更好的促進(jìn)作用尚不清楚。因此，本實(shí)驗(yàn)擬先探究不同濃度PRF 對(duì)成骨細(xì)胞MC3T3-E1增殖、分化的影響，根據(jù)結(jié)果，選出最佳濃度的PRF，然后基于β-catenin 通路探究最優(yōu)濃度PRF 復(fù)合β-磷酸三鈣對(duì)成骨細(xì)胞成骨分化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠成骨細(xì)胞株MC3T3-E1 購自中科院上海細(xì)胞庫，堿性磷酸酶（ALP）ELISA 試劑盒購自中國碧云天生物技術(shù)有限公司，骨鈣素（OC）、Ⅰ型膠原蛋白（COL-1）ELISA 試劑盒均購自武漢菲恩生 物 科 技 有 限 公 司，β-catenin、LEF-1、RunX2、Osterix 抗體購自Abcam 公司（美國），OPN 抗體購自普健生物（武漢）科技有限公司，茜素紅購自北京索萊寶科技有限公司，α-MEM 培養(yǎng)基購自浙江吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，β-磷酸三鈣材料購自中國上海貝奧路公司，倒置顯微鏡（Olympus，日本），MK3酶標(biāo)儀（Thermo，美國），EVOS FL AUTO 顯微照相系統(tǒng)（Thermo，美國）。

1.2 方法

1.2.1 PRF 制備 體重400～500 g 的健康雄性SD大鼠，用10%水合氯醛（0.3 mL·100 g-1體重）麻醉，無菌條件下，于腹主動(dòng)脈取血10 mL 置于無添加抗凝劑的真空離心管中，立即置于離心機(jī)離心（400 g，12 min）。離心后可見血液分3 層：由下到上分別為紅細(xì)胞層、PRF 凝塊及無細(xì)胞血漿。在超凈工作臺(tái)中，將PRF 凝塊放入無菌離心管中，-80 ℃冷凍1 h，4 ℃解凍后離心（230 g，10 min），得到PRF 提取物，隨后，在離心管中加入5 mL α-MEM 培養(yǎng)液（含雙抗），連同PRF 提取物放入6 孔板中，37 ℃孵育24 h后離心（3 000 r·min-1，5 min），取上清，用0.22 μm濾器過濾，加入10%FBS 得到PRF。將正常培養(yǎng)基分別稀釋PRF為50%、40%、30%、20%、10%濃度。

1.2.2 CCK-8 檢測細(xì)胞增殖 將對(duì)數(shù)生長期的MC3T3-E1 細(xì)胞接種于96 孔板，密度為3×104個(gè)/mL，每孔100μL，設(shè)1個(gè)對(duì)照組和5個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別為：對(duì)照組、10%PRF 組、20%PRF 組、30%PRF 組、40%PRF組和50%PRF 組，對(duì)照組用不含PRF 的α-MEM 培養(yǎng)基，各實(shí)驗(yàn)組選用含對(duì)應(yīng)濃度PRF 的α-MEM 培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)48 h。按照CCK-8 試劑盒說明書檢測細(xì)胞增殖，每孔加入100μL CCK-8混合液在37 ℃下孵育2 h，用酶標(biāo)儀于450 nm 波長測定吸光度值。細(xì)胞增殖比例=實(shí)驗(yàn)組吸光度值/對(duì)照組吸光度值的平均值×100%。

1.2.3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 取對(duì)數(shù)生長期的MC3T3-E1 細(xì)胞以2×105/孔的密度接種于6 孔板，待細(xì)胞單層融合時(shí)，用無菌的200μL槍頭在細(xì)胞層垂直劃痕，然后用PBS 沖洗將劃痕區(qū)域的殘留細(xì)胞去除。然后加入含不同濃度PRF 的α-MEM 培養(yǎng)基，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。在0 h和24 h，將不同實(shí)驗(yàn)分組的細(xì)胞于成像系統(tǒng)顯微鏡下照相記錄，遷移率=（初始劃痕距離－現(xiàn)劃痕距離）/初始劃痕距離×100%。

1.2.4 茜素紅染色觀察鈣結(jié)節(jié) 將對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞以1×105個(gè)·mL-1的濃度于12 孔板中制作細(xì)胞爬片。細(xì)胞爬片后，更換含有不同濃度PRF 的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞（分組和CCK-8檢測相同），每2 d換液一次，培養(yǎng)14 d 后進(jìn)行茜素紅染色。茜素紅染色步驟為：PBS輕柔清洗3次爬片，多聚甲醛固定10 min，1%茜素紅37 ℃下染色30 min，超純水清洗，倒置相差顯微鏡觀察，橘紅色表明鈣鹽沉積。設(shè)1 個(gè)對(duì)照組和5 個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別為：對(duì)照組、10%PRF 組、20%PRF 組、30%PRF 組、40%PRF 組和50%PRF 組。對(duì)照組用不含PRF的α-MEM培養(yǎng)基，各實(shí)驗(yàn)組選用含對(duì)應(yīng)濃度PRF的α-MEM培養(yǎng)基，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)48 h。

1.2.5 WB 將對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞濃度調(diào)整為2×107·mL-1，將細(xì)胞懸液緩慢滴加于β-磷酸三鈣（3 mL/長方體），培養(yǎng)4 h 使細(xì)胞和支架空隙表面充分黏附。將細(xì)胞支架復(fù)合物分為兩組，第1 組：使用無PRF 培養(yǎng)液；第2 組：細(xì)胞支架復(fù)合物置于含有50%的PRF 培養(yǎng)液中。之后每隔1 d 更換1 次培養(yǎng)液。于第1 d、3 d、7 d 裂解細(xì)胞進(jìn)行WB 檢測。WB 步驟采用常規(guī)檢測步驟，包括：提取細(xì)胞的總蛋白并測量蛋白含量。經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、清洗后，依次加入β-catenin、LEF-1、RunX2、Osterix、OPN 一抗（1∶500）孵育過夜后，添加二抗（1∶5 000）繼續(xù)孵育2 h，曝光顯影，以β-actin為內(nèi)參分析蛋白表達(dá)水平。

1.2.6 ELISA 將對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞濃度調(diào)整為2×107·mL-1，將細(xì)胞懸液緩慢滴加于β-磷酸三鈣（3 mL/長方體），培養(yǎng)4 h 使細(xì)胞和支架空隙表面充分黏附。將細(xì)胞支架復(fù)合物分為兩組，第1 組：使用無PRF 培養(yǎng)液；第2 組：細(xì)胞支架復(fù)合物置于含有50%的PRF 培養(yǎng)液中。之后每隔1 d 更換1 次培養(yǎng)液。于第1 d、3 d、7 d棄去培養(yǎng)液，每孔加入200μL 細(xì)胞裂解液，4 ℃過夜，充分裂解后，離心取上清，按照骨鈣素（OC）、Ⅰ型膠原蛋白（COL-1）ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀測定450 nm 處的OD 值，按公式計(jì)算出OC、COL-1的活性。

1.2.7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)分為4 組，分別為：對(duì)照組、β-catenin 抑制劑組、β-磷酸三鈣+50%PRF 組和β-磷酸三鈣+50%PRF+β-catenin 抑制劑組。將對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞濃度調(diào)整為2×107·mL-1，每組加入1 mL細(xì)胞懸液。對(duì)照組和β-catenin 抑制劑組沒有β-磷酸三鈣，β-磷酸三鈣+50%PRF 組和β-磷酸三鈣+50%PRF+β-catenin 抑制劑組包含β-磷酸三鈣。β-catenin抑制劑組和β-磷酸三鈣+50%PRF+β-catenin抑制劑組在含有XAV-939（濃度2μmol·L-1）的培養(yǎng)液中培養(yǎng)3 d 后，棄去培養(yǎng)液，消化、離心得到細(xì)胞。通過ELISA 檢測細(xì)胞ALP 活性，通過WB 檢測成骨細(xì)胞β-catenin、LEF-1、RunX2、Osterix和OPN的蛋白表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件和GraphPAD 8.0 分析軟件進(jìn)行分析，多樣本間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用t檢驗(yàn)，重復(fù)測量數(shù)據(jù)選擇多變量方差分析方法MANOVA，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CCK8 檢測不同濃度PRF 對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響 與對(duì)照組相比，10%PRF 組、20%PRF 組、30%PRF 組、40%PRF 組和50%PRF 組都顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，且PRF 濃度越高，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的作用越好，其中50%PRF 表現(xiàn)出了最好的促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖的作用。見圖1。

圖1 CCK-8檢測不同濃度PRF對(duì)成骨細(xì)胞增殖的影響/n=3

2.2 劃痕實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度PRF 對(duì)成骨細(xì)胞遷移能力的影響 與對(duì)照組相比，10%PRF 組、20%PRF組、30%PRF 組、40%PRF 組和50%PRF 組都顯著促進(jìn)了成骨細(xì)胞遷移，且PRF 濃度越高，促進(jìn)成骨細(xì)胞遷移能力越強(qiáng)，50%PRF 表現(xiàn)出了最好的促進(jìn)成骨細(xì)胞遷移的能力。見圖2。

圖2 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度PRF對(duì)成骨細(xì)胞遷移的影響/n=3

2.3 ELISA 檢測不同濃度的PRF 對(duì)成骨細(xì)胞中ALP 活性的影響 ELISA 結(jié)果表明，10%PRF 組、20%PRF 組、30%PRF 組、40%PRF 組和50%PRF 組都顯著促進(jìn)了成骨細(xì)胞ALP酶活性，PRF濃度越高，成骨細(xì)胞ALP 酶活性越強(qiáng)，其中50%PRF 對(duì)成骨細(xì)胞ALP酶活性促進(jìn)作用最好。見圖3。

圖3 ELISA檢測不同濃度PRF對(duì)成骨細(xì)胞ALP酶活性的影響/n=3

2.4 茜素紅染色觀察不同濃度PRF 對(duì)成骨細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)形成的影響 對(duì)照組可見少量紅染，與對(duì)照組相比，10%PRF 組、20%PRF 組、30%PRF 組、40%PRF組和50%PRF 組紅染面積逐漸增加，此外，從20%PRF 開始出現(xiàn)明顯成團(tuán)的鈣化結(jié)節(jié)，鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量隨著PRF濃度增加而增加。見圖4。

圖4 茜素紅染色觀察不同濃度的PRF對(duì)成骨細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)形成的影響/n=3

2.5 ELISA 檢測PRF 對(duì)β-磷酸三鈣支架物中成骨細(xì)胞OC 和COL-1 活性的影響 在之前的實(shí)驗(yàn)中，50%PRF 表現(xiàn)出最高的促成骨細(xì)胞分化及增殖能力，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中我們采用50%PRF 作用于β-磷酸三鈣支架物中成骨細(xì)胞，分析PRF 和β-磷酸三鈣聯(lián)用對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響。

ELISA 結(jié)果表明，與β-磷酸三鈣對(duì)照組相比，β-磷酸三鈣+50%PRF 組在第3 d 和7 d 顯著提高了β-磷酸三鈣支架物中成骨細(xì)胞的OC 和COL-1 活性。見圖5。

圖5 ELISA檢測PRF對(duì)β-磷酸三鈣支架物中成骨細(xì)胞OC和COL-1活性的影響/n=3

2.6 WB 檢測PRF 對(duì)β-磷酸三鈣支架物中成骨細(xì)胞成骨分化標(biāo)志物的影響 與β-磷酸三鈣對(duì)照組相比，β-磷酸三鈣+50%PRF 組在第1 d、3 d 和7 d 顯著提高了成骨細(xì)胞β-catenin、LEF-1、RunX2、Osterix和OPN的蛋白含量。見圖6。

圖6 WB檢測PRF對(duì)β-磷酸三鈣支架物中成骨細(xì)胞成骨分化標(biāo)志物的影響/n=3

2.7 抑制β-catenin通路對(duì)β-磷酸三鈣支架物中成骨細(xì)胞活性及分化的影響 ELISA 結(jié)果所示：與對(duì)照組相比，β-catenin 抑制劑降低了正常成骨細(xì)胞ALP 的表達(dá)；與β-磷酸三鈣+50%PRF 組相比，β-catenin 抑制劑降低了PRF 復(fù)合β-磷酸三鈣處理的成骨細(xì)胞ALP 的表達(dá)。見圖7A。WB 結(jié)果所示，與對(duì)照組相比，β-catenin 抑制劑降低了正常成骨細(xì)胞β-catenin、LEF-1、RunX2、Osterix和OPN的蛋白表達(dá)；同樣，與β-磷酸三鈣+50%PRF 組相比，β-catenin抑制劑降低了PRF 復(fù)合β-磷酸三鈣處理的成骨細(xì)胞β-catenin、LEF-1、RunX2、Osterix和OPN的蛋白表達(dá)。見圖7B。

圖7 抑制β-catenin通路對(duì)成骨細(xì)胞成骨分化標(biāo)志物的影響/n=3

3 討 論

骨量不足是現(xiàn)今義齒種植需要解決的難點(diǎn)。β-磷酸三鈣作為骨再生支架材料已被廣泛研究并證實(shí)［1，5］，PRF 也被證明能夠促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化［4，6］，然而PRF 對(duì)成骨細(xì)胞在β-磷酸三鈣支架上增殖分化的影響尚不清楚。我們研究表明PRF 能促進(jìn)復(fù)合β-磷酸三鈣的成骨細(xì)胞增殖分化，為臨床上PRF 和β-磷酸三鈣聯(lián)用提供數(shù)據(jù)支持。

臨床上PRF 一般通過自體血離心形成，具有安全高效、無排異等優(yōu)點(diǎn)。韓曉謙等［4］研究表明PRF能促進(jìn)MC3T3-E1 成骨細(xì)胞增殖，并提高了成骨細(xì)胞ALP 活性。ALP 是成骨細(xì)胞早期分化的標(biāo)志［7］，提示PRF 促進(jìn)了成骨細(xì)胞的分化。我們研究表明，10%～50%濃度的PRF 均促進(jìn)了MC3T3-E1 成骨細(xì)胞的增殖能力和遷移能力，并提高了成骨細(xì)胞ALP活性，PRF 濃度越高，對(duì)MC3T3-E1 成骨細(xì)胞增殖和遷移促進(jìn)作用越強(qiáng)，提高ALP 活性越明顯；此外，茜素紅染色表明PRF 濃度越高，鈣化結(jié)節(jié)的數(shù)量越多。這些數(shù)據(jù)表明，PRF 能夠有效促進(jìn)MC3T3-E1成骨細(xì)胞增殖分化，濃度越高，效果越好，在本試驗(yàn)中50%PRF的效果最好。

β-磷酸三鈣與人體骨骼的無機(jī)成分相似，具有良好的生物相容性和降解性，其輕度溶解所釋放的鈣離子和溶解所形成的微堿性環(huán)境可有效促進(jìn)成骨細(xì)胞黏附、增殖及分泌基質(zhì)，促進(jìn)骨生成［8］。OC和COL-1 是骨形成生物標(biāo)志物［9-11］，骨形成、代謝和再生受COL-1和OC基因的調(diào)控，這些基因與鈣的有效性有直接關(guān)系［11］。我們研究表明，在第3 d 和第7 d PRF 能促進(jìn)成骨細(xì)胞在β-磷酸三鈣支架上OC和COL-1 的分泌，表明PRF 促進(jìn)成骨細(xì)胞在β-磷酸三鈣支架上的骨生成。

轉(zhuǎn)錄因子如β-catenin、Runx2 和Osterix 是成骨細(xì)胞分化所必需的［12］，OPN 是成骨的重要調(diào)控因子［13］。有研究表明β-catenin 通路是調(diào)控成骨分化活動(dòng)的重要途徑［14］。β-catenin 轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核內(nèi)，可激活與成骨分化相關(guān)的基因，如Runx2［15］。LEF-1是β-catenin的下游轉(zhuǎn)錄分子［16］，LEF-1與β-catenin的相互作用將β-catenin 導(dǎo)入細(xì)胞核［17］，然后β-catenin與LEF/TCF 形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，從而誘導(dǎo)下游基因表達(dá)［18］。β-catenin、LEF-1、RunX2、Osterix 和OPN 是成骨分化相關(guān)的標(biāo)志物。進(jìn)一步我們檢測了β-catenin、LEF-1、RunX2、Osterix 和OPN 的蛋白表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)，與單獨(dú)使用β-磷酸三鈣支架相比，在第1 d、第3 d和第7 d PRF與β-磷酸三鈣聯(lián)用顯著促進(jìn)β-catenin、LEF-1、RunX2、Osterix和OPN的蛋白表達(dá)，表明血小板纖維蛋白與β-磷酸三鈣聯(lián)用通過活化β-catenin通路，上調(diào)成骨調(diào)控因子RunX2、Osterix和OPN的蛋白表達(dá)，促進(jìn)了骨生成。最后，通過使用β-catenin抑制劑表明抑制β-catenin 通路可以降低成骨細(xì)胞活性和阻止成骨分化。

本研究在體外證明，與單獨(dú)使用β-磷酸三鈣相比，PRF 復(fù)合β-磷酸三鈣通過促進(jìn)β-catenin 通路顯著提高小鼠成骨細(xì)胞分化效果，但PRF 復(fù)合β-磷酸三鈣在體內(nèi)對(duì)成骨細(xì)胞分化的效果并不清楚，因此，針對(duì)PRF 復(fù)合β-磷酸三鈣對(duì)成骨細(xì)胞分化的影響仍需要進(jìn)一步研究。