張嘉文，李加林，張 蒙，吳素珍

（1. 贛南醫(yī)學(xué)院2019級(jí)碩士研究生；2. 贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院；3. 贛南醫(yī)學(xué)院心腦血管疾病防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；4. 贛南醫(yī)學(xué)院2017級(jí)本科生物技術(shù)專業(yè)；5. 贛南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西 贛州 341000）

轉(zhuǎn)化生長因子β1（Transforming growth factor β1，TGF-β1）在高糖誘導(dǎo)的糖尿病腎病細(xì)胞模型和鏈脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）誘導(dǎo)的糖尿病腎病動(dòng)物模型中的表達(dá)均上調(diào)。在長期高糖和TGF-β1的刺激下，系膜細(xì)胞大量表達(dá)胞外基質(zhì)蛋白并沉積在腎小球內(nèi)會(huì)引起腎小球硬化，最終導(dǎo)致腎臟纖維化［1-3］。

鈣敏感受體（Calcium-sensing receptor，CaSR）是G 蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）家族的成員，它不僅控制鈣穩(wěn)態(tài)，而且在細(xì)胞增殖、凋亡、分化、基因表達(dá)和心血管疾病等許多細(xì)胞過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［4］。目前，大約30%的獲批藥物針對(duì)GPCR，其中一些用于治療糖尿病［5］。高糖誘導(dǎo)的新生大鼠原代心肌細(xì)胞中CaSR 表達(dá)下調(diào)，新生大鼠原代心肌細(xì)胞中的線粒體結(jié)構(gòu)和功能也受到高糖損傷，CaSR 的激動(dòng)劑NPS568 可上調(diào)CaSR 的表達(dá)，恢復(fù)新生大鼠原代心肌細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)和功能［6］。

細(xì)胞外Ca2+是第一個(gè)被證實(shí)通過激活CaSR 發(fā)揮作用的配體［7］。此外，多價(jià)陽離子如Mg2+、Gd3+、新霉素和精胺也是CaSR 的激動(dòng)劑［8］。在前期發(fā)表的研究中，我們揭示了CaSR 的激動(dòng)劑GdCl3可以改善TGF-β1誘導(dǎo)的系膜細(xì)胞（Mesangial cells，MCs）中胞外基質(zhì)蛋白FN的表達(dá)。本研究將進(jìn)一步揭示CaSR的配體CaCl2是否可以抑制MCs 中TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白FN的表達(dá)。

自噬在慢性腎臟病中的功能仍存在爭議。JIANG M等早在2010年就報(bào)道，抑制自噬會(huì)導(dǎo)致腎損傷并促進(jìn)缺血再灌注誘導(dǎo)的腎小管細(xì)胞凋亡［9］。另一項(xiàng)研究也表明，UUO聯(lián)合ATG5敲除（自噬受到抑制）小鼠腎間質(zhì)纖維化加重［10］，這些結(jié)果均表明促進(jìn)自噬對(duì)腎功能損害有保護(hù)作用。相反，在某些情況下，抑制自噬反而發(fā)揮了器官保護(hù)作用。LIU X 等首次證明自噬在腎纖維化過程中被激活，通過G-Rb1 治療抑制自噬可以減輕HK-2 細(xì)胞的腎纖維化［11］。YANG X 等研究也表明WISP-1 過表達(dá)可以加劇UUO小鼠模型中的自噬，然后增加腎纖維化，WISP-1可抑制UUO 小鼠的自噬進(jìn)而減輕腎纖維化［12］。本文將探討Ca2+是否對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的MCs 自噬有影響。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 胎牛血清（FBS）、DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；兔抗大鼠fibronectin（FN，1∶10 000，Merck Millipore，Chemicon），Smad2 and p-Smad2（1∶10 000，CST），β-actin（1∶1 000，CST）。辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（武漢博士德公司）；電化學(xué)發(fā)光（ECL）液（美國Thermo 公司）；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（美國Thermo 公司）；其他化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和處理 原代大鼠系膜細(xì)胞（MCs）在含有20%胎牛血清、100 U·mL-1青霉素和100 mg·mL-1鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選擇第8～16代之間的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。用4 mM CaCl2預(yù)處理MCs 30 min，然后用10 ng·mL-1人 重 組TGF- β1（R&D Systems，Minneapolis，U. S. A）共同作用24 h，最后通過蛋白質(zhì)印跡方法檢測(cè)目標(biāo)蛋白的表達(dá)。

1.2.2 蛋白質(zhì)提取和蛋白質(zhì)印跡 用預(yù)冷的PBS洗滌MCs 兩次，然后用RIPA 裂解液裂解，再用BCA蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。每個(gè)樣品取30μg 總蛋白通過SDS-PAGE 分離，然后將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到（PVDF）膜上，用5%脫脂牛奶封閉膜后，將膜與相應(yīng)的一抗在4 ℃下孵育輕輕振搖過夜，將膜與相應(yīng)的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗在室溫下孵育2 h。最后，將膜與增強(qiáng)的ECL發(fā)光液一起孵育，并用Bio-Rad Chemi-Doc MP 及成像系統(tǒng)檢測(cè)信號(hào)。使用Image J軟件量化條帶的灰度值。

1.2.3 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞活力 在實(shí)驗(yàn)前一天，在96 孔板中接種細(xì)胞（105/孔），每個(gè)濃度設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，然后用不同濃度的氯化鈣處理系膜細(xì)胞24 h。次日，在96孔板中加MTT溶液（5 mg·mL-1）孵育4 h，接下來用DMSO 去溶解紫色結(jié)晶，然后用酶標(biāo)儀分別測(cè)570 nm 和690 nm 波長處的光吸收值。采用GraphPad Prism 6 軟件計(jì)算不同濃度氯化鈣處理的相對(duì)細(xì)胞活力，細(xì)胞活力值都以PBS 處理的對(duì)照組為參考進(jìn)行計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組樣本均數(shù)之間的總體比較采用單因素方差分析，組內(nèi)各指標(biāo)的多重比較采用SNK檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度氯化鈣對(duì)系膜細(xì)胞活力的影響

CaCl2濃度為20～100 mM 時(shí)，細(xì)胞活力＜0.5，6.4～4 mM 時(shí)，細(xì)胞活力接近1（圖1A）。CaCl2處理細(xì)胞24 h 后，在光學(xué)顯微鏡下拍攝細(xì)胞照片，20～100 mM CaCl2處理的細(xì)胞形狀似乎不規(guī)則，6.4～4 mM CaCl2處理的細(xì)胞形狀則更規(guī)則（圖1B）。

圖1 不同濃度CaCl2對(duì)系膜細(xì)胞活力和形態(tài)的影響（×100）

2.2 TGF-β1對(duì)mTOR 和P70S6K 磷酸化的抑制作用被Ca2+逆轉(zhuǎn) 與對(duì)照組比較，TGF-β1治療組p-mTOR/mTOR 及p-p70S6K 表達(dá)下調(diào)；與TGF-β1治療組比較，TGF-β1和Ca2+共處理組p-mTOR/mTOR 及p-p70S6K 表達(dá)上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05)（圖2）。

圖2 CaCl2抑制TGF-β1誘導(dǎo)的自噬

2.3 Ca2+抑制TGF-β1誘導(dǎo)的Beclin-1 的表達(dá)上調(diào)和P62 的表達(dá)下調(diào)，抑制胞外基質(zhì)蛋白FN 的表達(dá)

與對(duì)照組比較，TGF-β1治療組Beclin-1、FN表達(dá)上調(diào)，P62 表達(dá)下調(diào)；與TGF-β1治療組相比，TGF-β1和Ca2+共處理組Beclin-1、FN 表達(dá)下調(diào)，P62 表達(dá)上調(diào)（圖3）。

圖3 Ca2+抑制TGF-β1誘導(dǎo)的Beclin-1的表達(dá)上調(diào)和P62的表達(dá)下調(diào)，抑制TGF-β1誘導(dǎo)的FN表達(dá)

3 討 論

CaSR 是G 蛋白偶聯(lián)受體C 家族成員，其顯著的作用是控制鈣穩(wěn)態(tài)，CaSR 還參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡［13-14］。精胺是CaSR 的一種激動(dòng)劑，在糖尿病、心肌病中發(fā)揮保護(hù)作用［15］。同樣，Ca2+作為CaSR 的天然激動(dòng)劑，Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)被證明參與了1型糖尿病和2 型糖尿病，且在慢性腎病中CaSR 的表達(dá)降低［16-18］，Ca2+是否能夠抑制系膜細(xì)胞中TGF-β 誘導(dǎo)的自噬還未見文獻(xiàn)報(bào)道。

TGF-β 長期以來被認(rèn)為是纖維化的驅(qū)動(dòng)因素［13］，有研究發(fā)現(xiàn)TGF-β 也能夠影響自噬。自噬是一把雙刃劍，在不同的實(shí)驗(yàn)條件下，自噬可能起到截然相反的作用。有很多研究表明，自噬是慢性腎臟病的保護(hù)因素；然而也有文獻(xiàn)報(bào)道過度自噬會(huì)加重腎臟疾病，抑制過度自噬則發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。還有研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1在足夠血清條件下可誘導(dǎo)原代系膜細(xì)胞自噬，抑制該自噬可抑制剝奪血清誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡［19］，還有研究報(bào)道在UUO 小鼠模型和TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞（TECs）中自噬是激活的，而抑制自噬可以減輕TGF-β1誘導(dǎo)的TECs 和UUO 小鼠模型中的腎纖維化［12］，這一研究說明自噬是有害的。mTOR/p70S6K 信號(hào)通路對(duì)自噬具有負(fù)調(diào)控作用。而另有研究發(fā)現(xiàn)mTOR的抑制劑雷帕霉素可通過阻斷mTOR/p70S6K 信號(hào)通路促進(jìn)自噬來改善糖尿病大鼠的腎損傷［20］，說明自噬具有保護(hù)作用。我們的研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1刺激系膜細(xì)胞可抑制mTOR/p70S6K的磷酸化和P62的表達(dá)，上調(diào)Beclin-1的表達(dá)，Ca2+和TGF-β1共同處理可以上調(diào)mTOR/p70S6K 的磷酸化和P62 的表達(dá)，同時(shí)降低Beclin-1的表達(dá)，并且抑制TGF-β1誘導(dǎo)的FN 表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持前人研究提出的過度自噬會(huì)加重腎臟疾病，抑制過度自噬則發(fā)揮腎臟保護(hù)作用的論點(diǎn)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，在沒有剝奪血清的情況下，TGF-β1刺激系膜細(xì)胞24 h 可以誘導(dǎo)自噬，而這種自噬可以被鈣離子抑制；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)TGF-β1誘導(dǎo)的胞外基質(zhì)蛋白FN 的表達(dá)也被鈣離子抑制。由此，我們推斷Ca2+可以改善系膜細(xì)胞中TGF-β1誘導(dǎo)的自噬和胞外基質(zhì)蛋白表達(dá)。然而，Ca2+抑制TGF-β1誘導(dǎo)FN 的表達(dá)是否與其抑制TGF-β1誘導(dǎo)的自噬相關(guān)，將在后續(xù)研究中進(jìn)一步探討。