孟慶偉

北京懷柔醫(yī)院口腔科，北京 101400

口腔癌，是頭頸部較為常見的惡性腫瘤之一[1-4]。目前，全球有眾多研究團隊正進行著程序性死亡蛋白配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1）類藥物治療各種類型惡性腫瘤的研究[5]，然而將PD-1類藥物應(yīng)用于口腔癌方面的研究卻鮮有報道。因此，為了探索PD-1類藥物在口腔癌方面的應(yīng)用前景，探究口腔癌發(fā)生發(fā)展的可能機制，本研究對已確診的各類型口腔癌患者的腫瘤組織切片，采用免疫組織化學(xué)法對PD-1 蛋白進行了染色，初步結(jié)果如下：

1 對象與方法

1.1 研究對象

2015 年1 月至2020 年1 月，收集經(jīng)北京懷柔醫(yī)院口腔科手術(shù)切除并確診為口腔癌的病理組織20 例，其中口咽癌8 例、上頜竇癌6 例、舌癌6 例，經(jīng)病理診斷均為鱗狀上皮細(xì)胞癌。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)確診為口腔癌；②首次確診；③病理組織為原位腫瘤切片。排除標(biāo)準(zhǔn)：①曾接受過任何免疫治療；②曾接受任何靶向治療；③曾接受任何放、化療；④病理組織切片為穿刺組織。所有病理組織經(jīng)福爾馬林固定后，進行常規(guī)石蠟包埋，5 μm 連續(xù)切片。該研究已獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)及備案。

1.2 試劑與耗材

PD-L1 兔單克隆抗體（美國spring，M4422）；免疫組織化學(xué)用超敏型羊抗鼠/兔二抗試劑盒（美國UltraSensitive，KIT-0305）；DAB 試劑盒（中杉金橋，ZLI-9017）；脫蠟液（中杉金橋，ZLI-9315）；內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑（中杉金橋，PV-9000）；3%BSA（碧云天，P0007）；蘇木素染色液（中杉金橋，BSBA-4041）；中性樹膠（中杉金橋，ZLI-9555）；免疫組化抗原修復(fù)緩沖液（中杉金橋，ZLI-9065）；PBS 磷酸鹽緩沖液；梯度酒精（濃度分別為50%、70%、80%、95%、100%）等。

1.3 實驗儀器

切片機（德國LEICA，RM2235）；烤片機（德國LEICA，H1220）；顯微鏡（日本OLYMPUS，CX31）；離心機（美國Thermo，ST-8）；切片架；燒杯；量筒等。

1.4 實驗方法

①切片脫蠟；②梯度酒精復(fù)水；③抗原修復(fù)；④一抗孵育：PD-L1/CD274（SP142）兔單克隆抗體1∶200 稀釋后取50 μl 滴入切片反應(yīng)區(qū)域，4℃孵育過夜后，PBS 洗滌3 次，3 min/次；⑤二抗孵育：超敏型羊抗鼠/兔二抗1∶100 稀釋后取100 μl 滴入切片反應(yīng)區(qū)域，用移液器吸頭涂抹均勻，置于烘箱中37℃反應(yīng)1 h，PBS洗滌3 次，3 min/次；⑥D(zhuǎn)AB 顯色；⑦復(fù)染；⑧脫水；⑨透明；⑩封片。

1.5 評價標(biāo)準(zhǔn)

所有切片于光學(xué)顯微鏡（10 目鏡×40 物鏡）下隨機選取10 個組織區(qū)域進行攝片，并分別計算陽性細(xì)胞比例（陽性細(xì)胞數(shù)量÷區(qū)域內(nèi)所有細(xì)胞數(shù)量×100%）后取平均值，依照業(yè)內(nèi)通用的免疫組化陽性等級評價標(biāo)準(zhǔn)[6]進行分級：陽性細(xì)胞比例≥50%為強陽性，25%～＜50%為中等陽性，5%～＜25%為弱陽性，＜5%為陰性。

2 結(jié)果

2.1 口咽癌病理組織中PD-L1 的表達及分布情況

8 例口咽癌病理組織中，共計4 例（50%）PD-L1呈強陽性表達，1 例（12.5%）PD-L1 呈中等陽性表達，1 例（12.5%）PD-L1 呈弱陽性表達，2 例（25%）呈陰性表達，合計陽性表達率為75%。見圖1、表1。

表1 各口咽癌石蠟切片PD-L1 陽性表達情況

圖1 口咽癌石蠟切片PD-L1 免疫組化染色結(jié)果

2.2 上頜竇癌病理組織中PD-L1 的表達及分布情況

6 例上頜竇癌病理組織中，共計2 例（33.3%）PD-L1 呈強陽性表達，1 例（16.7%）PD-L1 呈中等陽性表達，1 例（16.7%）PD-L1 呈弱陽性表達，2 例（33.3%）呈陰性表達，合計陽性表達率為66.7%。見圖2、表2。

表2 各上頜竇癌石蠟切片PD-L1 陽性表達情況

圖2 上頜竇癌石蠟切片PD-L1 免疫組化染色結(jié)果

2.3 舌癌病理組織中PD-L1 的表達及分布情況

6 例上頜竇癌病理組織中，0 例PD-L1 呈強陽性表達，2例（33.3%）PD-L1呈中等陽性表達，2例（33.3%）PD-L1 呈弱陽性表達，2 例（33.3%）呈陰性表達，合計陽性表達率為66.7%。見圖3、表3。

表3 各舌癌石蠟切片PD-L1 陽性表達情況

圖3 舌癌石蠟切片PD-L1 免疫組化染色結(jié)果

3 討論

PD-1 是由基因PDCD1 編碼，由288 個氨基酸組成的跨膜蛋白[7-16]?，F(xiàn)如今，口咽癌、上頜竇癌、舌癌等口腔癌的發(fā)病機制不甚明確[5，17-20]，亦無具有顯著療效的藥物或療法[21]，現(xiàn)階段多采用常規(guī)手術(shù)、化療、放療等治療手段，臨床效果也不甚明顯[21-23]。因此，探尋口腔癌的發(fā)病機制及特效藥物是當(dāng)下迫在眉睫的工作。在本研究所收集的20 例口腔癌病理組織中，PD-L1強陽性表達共計6 例（30%），PD-L1 中等陽性表達共計4 例（20%），PD-L1 弱陽性表達共計4 例（20%），PD-L1 陰性表達共計6 例（30%），PD-L1 陽性表達共計14 例（70%）。因此，咽癌、上頜竇癌、舌癌等口腔癌的發(fā)病機制亦有可能是腫瘤細(xì)胞高表達PD-L1 引起免疫逃逸造成的，PD-1 免疫點抑制劑類藥物應(yīng)用于口腔癌可能具有一定的治療效果。但限于本研究僅納入病例較少，該推論是否正確還有待進一步考證。據(jù)此，本課題組下一步擬擴大對口腔癌病理組織PD-L1表達的檢測范圍，為PD-1類藥物在口腔癌方面的應(yīng)用提供準(zhǔn)確的實驗數(shù)據(jù)與理論支持。