呂凱峰 王遠紅 張 偉 劉宏偉

1.黑龍江中醫(yī)藥大學研究生院，黑龍江哈爾濱 150040；2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院皮膚科，黑龍江哈爾濱 150040；3.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院中醫(yī)兒科，黑龍江哈爾濱 150040

白癜風是一種典型的皮膚黏膜色素脫失性疾病，祖國醫(yī)學稱此病為“白癜”“白毋奏”，亦或“白疙”[1-2]。該病易于診斷，難于治療，且極大地影響患者的身心健康[3]。目前國內(nèi)白癜風患者發(fā)病率為0.1%～2.0%[4]。臨床上常用的治療方法包括激素、免疫抑制劑、光化學療法、手術(shù)療法等[5-8]，效果均不理想，具有易復發(fā)和副作用的缺點[9]。中醫(yī)治療白癜風具有優(yōu)勢和特色，掃白靈、掃白茴風丸是王遠紅教授治療白癜風的代表性方劑[10-11]，臨床效果令人滿意。但由于其具體藥效物質(zhì)及作用的靶標通路尚不明確，導致該方的臨床推廣受到了一定的限制。因此本研究應用中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學[12]探討掃白靈、掃白茴風丸中的重要藥對“菟絲子-淫羊藿”調(diào)治白癜風的主要活性成分和作用機制，同時為后續(xù)掃白靈、掃白茴風丸的實驗研究與臨床應用提供基礎(chǔ)生物學信息支撐。

1 資料與方法

1.1 “菟絲子-淫羊藿”活性成分及靶標的收集及篩選

依托中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺、中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫、中藥癥候關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)庫、在線中醫(yī)藥生物信息學分析工具檢索菟絲子、淫羊藿的化學組成成分，通過數(shù)據(jù)庫初步篩選口服利用度（oral bioavail ability，OB）≥30%、類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 的潛在活性成分。篩選結(jié)束后，從數(shù)據(jù)庫中檢索活性成分相對應的靶標，由于檢索到的靶標目標存在命名不規(guī)范的問題,為標準化蛋白質(zhì)靶標信息，統(tǒng)一在UniProt 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫將化合物作用的蛋白質(zhì)靶標校正為基因標準化命名。

1.2 白癜風疾病相關(guān)靶標篩選

借助于在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫、靶向藥物數(shù)據(jù)庫、GeneCards、DrugBank 數(shù)據(jù)庫檢索與白癜風相關(guān)的疾病靶標。

1.3 “菟絲子-淫羊藿”的“藥對-化合物-潛在靶標”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

將藥對、活性成分及靶標應用Cytoscape 3.7.2 軟件構(gòu)建“藥對-活性化合物-潛在靶標”聯(lián)系的網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 “菟絲子-淫羊藿”-白癜風交集靶標相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用微生信在線作圖平臺（http：//www.bioinformatics.com.cn/）繪制維恩圖，取交集，進而將交集靶標上傳STRING 數(shù)據(jù)庫，得到“菟絲子-淫羊藿”治療白癜風的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)模型，并導入Cytoscape 中進行可視化展示。

1.5 交集基因本體及通路富集分析

利用David 數(shù)據(jù)庫將上述交集靶標進行GO 功能及KEGG 通路富集分析，并借助微生信在線作圖平臺對富集結(jié)果進行可視化展示。

2 結(jié)果

2.1 “菟絲子-淫羊藿”主要活性成分及靶標

對“菟絲子-淫羊藿”活性成分進行挖掘及篩選，剔除重復數(shù)據(jù)后剩余主要有效成分31 個。見圖1。同時檢索并將兩味藥物活性成分的潛在靶標合并去重后共獲得222 個相關(guān)作用靶標蛋白。

圖1 “菟絲子-淫羊藿”主要活性成分及靶標

2.2 白癜風潛在作用靶標

共獲得與白癜風相關(guān)的基因1198 個。設(shè)定Score大于中位數(shù)（score ＞0.63）為白癜風的潛在靶標，最終得到潛在靶標457 個。

2.3 “藥對-化合物-潛在治療靶標”網(wǎng)絡(luò)

“藥對-化合物-潛在治療靶標”網(wǎng)絡(luò)見圖2。篩選出槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷固醇、脫水淫羊藿素、芝麻素等重要化合物。

圖2 “藥對-化合物-潛在治療靶標”網(wǎng)絡(luò)

2.4 “菟絲子-淫羊藿”-白癜風靶標的PPI 網(wǎng)絡(luò)分析

共得到共同靶標47 個，見圖3。進一步將交集靶標提交至STRING 數(shù)據(jù)庫，并排除游離的沒有聯(lián)系的2 個節(jié)點。得到“菟絲子-淫羊藿”-白癜風潛在靶標PPI 網(wǎng)絡(luò)圖，見圖4。將STRING 平臺獲取的靶標蛋白相互信息導入Cytoscape 中進行可視化展示，見圖5。其中顏色越發(fā)鮮明、節(jié)點形狀越大，則度值越大，度值越大證明在網(wǎng)絡(luò)中越重要。連線越粗，相互作用關(guān)系亦越大。其中排名靠前30 位、度值大的節(jié)點見圖6。

圖3 “菟絲子-淫羊藿”有效成分與白癜風疾病靶標交集維恩圖

圖4 “菟絲子-淫羊藿”-白癜風潛在靶標蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖5 “菟絲子-淫羊藿”干預白癜風靶標的可視化分析

圖6 “菟絲子-淫羊藿”干預白癜風的核心靶標（度值前30）

2.5 GO及KEGG 通路富集分析結(jié)果

45 個共同靶標進行GO 分析得到條目356 個，其中分子功能44 個、生物過程284 個、細胞組分28 個，見圖7。KEGG 通路富集分析共篩選出信號通路23 條，主要涉及TNF、T 細胞受體、Toll 樣受體、PI3K-Akt、FoxO、MAPK 等信號通路，見圖8。

圖7 “菟絲子-淫羊藿”干預白癜風潛在靶標的GO 富集分析

圖8 “菟絲子-淫羊藿”干預白癜風潛在靶標的KEGG 信號通路分析

3 討論

由本研究的“藥對-化合物-靶標”網(wǎng)絡(luò)可知槲皮素、山柰酚、木犀草素、β-谷固醇、脫水淫羊藿素、芝麻素度值較高，提示以上可能是“菟絲子-淫羊藿”治療白癜風的有效成分，并協(xié)同作用于多個靶標發(fā)揮效果。

PPI 網(wǎng)絡(luò)提示TP53、IL-6、TNF、VEGFA、MAPK1、PTGS2 等這些靶標度值較高，相關(guān)文獻已有對本研究預測的大部分潛在靶標與白癜風關(guān)系的報道[13-17]。本課題組前期通過觀察以“菟絲子-淫羊藿”藥對為主要成分的掃白靈干預白癜風發(fā)現(xiàn)，試驗組血清中的IL-10、TNF 較對照組水平明顯升高，提示此藥對可能通過IL-10、TNF 等關(guān)鍵靶標發(fā)揮治療白癜風的作用[10-11]。

關(guān)鍵節(jié)點的KEGG 通路分析提示藥對可通過多條通路治療白癜風，且富集到的信號通路中多數(shù)已得到證實[18-19]。此外本研究富集到了許多看似與本病不相關(guān)的一些通路，但有研究表明，這些疾病之間有一定的內(nèi)在聯(lián)系[20-25]。這些通路可以幫助臨床醫(yī)師從多角度剖析本藥對治療白癜風患者的體內(nèi)途徑及白癜風與其他疾病間的內(nèi)在關(guān)聯(lián)，如“菟絲子-淫羊藿”是否主要通過MAPK、PI3K-Akt、NF-κB 等潛在通路達到治療白癜風病的目的，肺結(jié)核病與白癜風發(fā)病是否具有一定相關(guān)性等。

綜上所述，“菟絲子-淫羊藿”治療白癜風通過多成分、多靶標、多通路[26]治療白癜風。本研究所得核心成分、靶標及通路與白癜風治療密切相關(guān)。同時，還發(fā)現(xiàn)了其他潛在活性成分，如山柰酚、木犀草素、β-谷固醇等，以及靶標，如TP53、IL-6、TNF 等，提示“菟絲子-淫羊藿”可以通過多靶標多通路治療白癜風，為其臨床開發(fā)利用提供理論基礎(chǔ)。