苗 毅,段進(jìn)進(jìn),尚立群,王 莉,吳 樺,董 玉(陜西省人民醫(yī)院呼吸與危重癥一科,西安 70068;西安市中心醫(yī)院呼吸科;通訊作者,E-mail:proneduan@sina.com)

肺癌是全球癌癥相關(guān)死亡的首要原因,其中,非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)所引起的死亡數(shù)占肺癌患者總死亡數(shù)的近80%[1,2]。手術(shù)切除是目前治療肺癌的主要手段,但是根治性切除后5年生存率僅有30%～60%[3]。近年來,肺癌的分子靶標(biāo)治療已成為研究的熱點。針對關(guān)鍵靶點的幾種新藥已經(jīng)取得了較好的臨床療效[4]。然而,由于在患者中篩選合適的基因突變比較困難以及耐藥性的發(fā)生,使得分子靶標(biāo)治療應(yīng)用達(dá)到瓶頸[5]。因此,尋找新的參與肺癌發(fā)生發(fā)展的靶向分子并將其用于臨床,對于肺癌患者的治療具有重要意義。細(xì)胞黏附分子(cell adhesion molecules, CADMs)是一類位于細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)家族,包括CADM1、CADM2、CADM3和CADM4[6]。CADM2(也被稱為Necl-3、cynCAM2、IGSF4D)與多種癌癥有關(guān),如乳腺癌[7]、前列腺癌[8]和鼻竇癌[9]。據(jù)報道,CADM2在多種癌癥中缺乏或低表達(dá),參與癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡過程[10,11]。有研究指出,CADM2可能與肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲過程有關(guān)[12]。然而,CADM2在肺癌中的具體功能還需要進(jìn)一步探究。本研究將對CADM2在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H460中的表達(dá)情況進(jìn)行檢測及分析,并探討CADM2過表達(dá)對A549和H460體外生物學(xué)過程(增殖、侵襲以及凋亡)的作用及可能調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H460(ATCC,美國),胎牛血清和DMEM(Gibco,美國),Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒、Trizol試劑(Invitrogen,美國),RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、cDNA合成試劑盒和qPCR定量試劑盒(Takara,美國),qPCR引物(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司),CCK-8(Dojindo Molecular Technologies,日本),BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒和ECL檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司),聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Millipore,美國),anti-CADM2抗體(SAB4501053),anti-p-AKT抗體(05-802R)、anti-AKT抗體(SAB4500797)、anti-p-mTOR抗體(SAB5700327)、anti-mTOR抗體(AMAB91508)購自Merck公司(美國),anti-GAPDH抗體(SAB2108668)購自Sigma公司(美國),辣根過氧化物酶(HRP)二抗(南京鐘鼎生物公司),Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司),Transwell小室(Corning,美國)。

1.2 細(xì)胞系培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

人正常肺細(xì)胞系Gekko lung-1和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H460分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,培養(yǎng)基另需加入100 U/ml青霉素G和100 μg/ml鏈霉素。將細(xì)胞置于含5% CO2、溫度為37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

將A549和H460細(xì)胞分別接種于24孔板,密度為1×105個細(xì)胞/孔,待細(xì)胞匯合度達(dá)80%時,以Lipofectamine 2000試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染實驗。將CADM2過表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染A549和H460細(xì)胞(pcDNA3.1-CADM2組),并且設(shè)置載體陰性對照組(pcDNA3.1-NC組)以及未處理空白對照組(control組),后續(xù)實驗分組相同。

1.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖

A549和H460細(xì)胞在轉(zhuǎn)染1,2,3 d后,分別使用CCK-8試劑盒進(jìn)行細(xì)胞活性檢測。將10 μl CCK-8溶劑直接加入細(xì)胞中(100 μl/孔),并在37 ℃下培養(yǎng)4 h。用微孔板閱讀器(美國BioRad公司)測量在450 nm處的吸光度(OD450)。

1.4 RT-qPCR檢測CADM2、p-AKT、p-mTOR mRNA表達(dá)

Trizol法從Gekko lung-1、A549和H460細(xì)胞中提取總RNA,然后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA并根據(jù)qPCR試劑盒說明書進(jìn)行CADM2轉(zhuǎn)錄水平的檢測,比較在肺癌細(xì)胞和正常肺細(xì)胞中的CADM2 mRNA表達(dá)情況。此外,還通過檢測CADM2的轉(zhuǎn)錄水平測定了pcDNA3.1-CADM2過表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率。為了探究CADM2發(fā)揮作用的可能機制,本研究進(jìn)一步在A549和H460細(xì)胞中研究了AKT/mTOR信號通路,進(jìn)行了通路相關(guān)分子p-AKT、p-mTOR轉(zhuǎn)錄水平的檢測。GAPDH作為內(nèi)參基因。以2-ΔΔCt法計算基因的相對表達(dá)量。轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下:95 ℃預(yù)變性3 min,然后進(jìn)行熱循環(huán),在95 ℃下變性20 s,在60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共進(jìn)行35個循環(huán)。引物由南京擎科生物科技有限公司合成,序列如下:CADM2上游引物為5′-GATCGGACTGCAGGAGCGAC-3′,下游引物為5′-TGTAGCAGCTCGAGTTCGAA-3′;p-AKT上游引物為5′-GGACAAGGACGGGCACATTA-3′,下游引物為5′-CGACCGCACATCATCTCGTA-3′);p-mTOR上游引物為5′-CTTATGGTGCGGTCCCTTGT-3′;下游引物為5′-GGTCACCTGAGGGTGAACTG-3′);GAPDH上游引物為5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′;下游引物為5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。

1.5 Western blot檢測CADM2、p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR蛋白表達(dá)

RIPA緩沖液用于提取Gekko lung-1、A549和H460細(xì)胞的總蛋白,然后使用BCA法檢測蛋白的總濃度。隨后,使用12% SDS-PAGE凝膠分離蛋白并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上并且室溫封閉3 h。分別用1 ∶500倍稀釋的CADM2和1 ∶1 000倍稀釋的p-AKT、AKT、p-mTOR、mTOR和GAPDH的一抗4 ℃孵育過夜。隨后,在室溫下用1 ∶5 000倍稀釋的HRP偶聯(lián)二抗孵育1 h。最后采用ECL檢測試劑顯影成像。GAPDH作為內(nèi)部參照,根據(jù)各個條帶的灰度值進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.6 Transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲

收集處理的或未處理的A549和H460細(xì)胞后分別用胰蛋白酶消化,接種Transwell小室于24孔板內(nèi),上室加100 μl細(xì)胞懸液(細(xì)胞密度為2×104個細(xì)胞/孔),下室加800 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基,在37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 d后,取出小室,棉簽擦去微孔膜上多余的細(xì)胞,PBS清洗小室一次后,然后在室溫下用4%甲醛固定膜30 min,用0.1%結(jié)晶紫染色15 min。最后,顯微鏡下放大200倍并從10個不同的視野計算實驗組及對照組的侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.7 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染色法檢測細(xì)胞凋亡

A549和H460細(xì)胞按上述分組轉(zhuǎn)染2 d后進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測。收集細(xì)胞并洗凈后,使用Annexin Ⅴ-FITC雙染色凋亡檢測試劑盒染色,流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CADM2在A549和H460細(xì)胞中低表達(dá)

RT-qPCR和Western blot實驗結(jié)果表明,相對于正常肺細(xì)胞Gekko lung-1,在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H460中CADM2 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯下降,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖1)。

2.2 CADM2過表達(dá)抑制A549和H460細(xì)胞增殖

RT-PCR和CCK-8細(xì)胞增殖實驗結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CADM2過表達(dá)質(zhì)粒后CADM2在A549和H460細(xì)胞中顯著上調(diào),且過表達(dá)CADM2明顯抑制了A549和H460的細(xì)胞增殖,抑制效果在3 d最好,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖2)。

與Gekko lung-1組相比,*P<0.05圖1 CADM2在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中的表達(dá)量Figure 1 The expression levels of CADM2 in NSCLC cell lines

與control組及pcDNA3.1-NC組相比,*P<0.05圖2 過表達(dá)CADM2對細(xì)胞增殖的影響Figure 2 The effect of CADM2 overexpression on cell proliferation

2.3 CADM2過表達(dá)抑制侵襲并促進(jìn)凋亡

相比于對照組,過表達(dá)CADM2明顯抑制A549和H460細(xì)胞侵襲的能力,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖3)。此外,過表達(dá)CADM2顯著增加A549和H460細(xì)胞凋亡率,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖4)。

與control組及pcDNA3.1-NC組相比,*P<0.05圖3 過表達(dá)CADM2對細(xì)胞侵襲的影響 (×400)Figure 3 The effect of CADM2 overexpression on cell invasion (×400)

圖4 過表達(dá)CADM2對細(xì)胞凋亡的影響Figure 4 The effect of CADM2 overexpression on cell apoptosis

2.4 CADM2過表達(dá)抑制AKT/mTOR信號通路

RT-PCR和Western blot結(jié)果表明,與對照相比,CADM2過表達(dá)在A549和H460細(xì)胞中p-AKT和p-mTOR水平明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖5)。

3 討論

盡管近年來手術(shù)、放射治療和化學(xué)療法取得了良好成效,非小細(xì)胞癌的預(yù)后仍然很差,這與它的惡性病理特征相關(guān)。目前,分子靶標(biāo)治療被認(rèn)為是一種很有前途的治療戰(zhàn)略,并且急需新的、高效的分子靶點為非小細(xì)胞肺癌的治療改善提供新的思路。因此,本實驗探究了CADM2在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中的作用和潛在機制。本研究發(fā)現(xiàn)與正常肺細(xì)胞Gekko lung-1相比,在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和H460中CADM2表達(dá)水平明顯降低。類似地,也有研究報道CADM2在其他癌癥如肝細(xì)胞癌[13]和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤[11]中表達(dá)量低于正常細(xì)胞。研究表明,表觀遺傳修飾可能是CADM2低表達(dá)的原因之一,如CADM2啟動子的甲基化[14]。CADM2基因編碼了兩種同種型(CADM-2A和CADM-2B),每個同種型由獨立啟動子驅(qū)動。在前列腺癌樣本組織及細(xì)胞中,CADM-2A啟動子的高度甲基化可抑制CADM2的表達(dá)[15]。有趣的是,CADM2被報道在二氧化硅誘導(dǎo)的7 d肺損傷小鼠模型中上調(diào)[16]。以上數(shù)據(jù)表明CADM2的表達(dá)不具有組織特異性,可能在多個疾病進(jìn)程中具有不同的生物學(xué)功能,并且提示CADM2的表達(dá)下調(diào)可能與啟動子的甲基化相關(guān),為進(jìn)一步探究CADM2表達(dá)差異的機制提供重要的參考價值。

圖5 過表達(dá)CADM2抑制AKT/mTOR信號通路的活化Figure 5 CADM2 overexpression inhibits the activation of AKT/mTOR pathway

CADMs是一個新發(fā)現(xiàn)的蛋白家族,被報道具有腫瘤抑制因子的功能,并且在多個正常組織中表達(dá)[17]。與CADM2屬于同一家族的CADM1(也稱為NECL-2、TSLC1、SYNCAM1、IGSF-4A)在肺癌[18]、前列腺癌[19]、和食管癌[20]中發(fā)揮抑癌作用。在前期研究中CADM2主要被認(rèn)為是肥胖相關(guān)基因,參與細(xì)胞能量代謝過程[21]。近年來,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)CADM2在多種癌癥疾病中扮演著重要角色。據(jù)報道CADM2在多種癌癥中均有表達(dá),如乳腺癌、前列腺癌和黑色素瘤[7,22,23],并且可調(diào)控細(xì)胞的惡性進(jìn)程,包括增殖、侵襲、抗凋亡等。研究表明,CADM2過表達(dá)可明顯抑制腎癌和食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞生長,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13,24]。此外,在肝細(xì)胞癌中,CADM2可抑制細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,ETC),并且它被認(rèn)為是一個有吸引力的生物標(biāo)志物,用于預(yù)測肝癌患者復(fù)發(fā)風(fēng)險以及治療篩查[25]。相似地,本研究發(fā)現(xiàn)CADM2過表達(dá)可有效抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲,促進(jìn)細(xì)胞凋亡?；诒狙芯恐械臄?shù)據(jù),CADM2被認(rèn)為是一種新型的腫瘤抑制因子,可能成為非小細(xì)胞肺癌潛在的治療靶點。

AKT是AGC(PKA/PKG/PKC)蛋白激酶家族的成員,可通過磷酸化激活下游蛋白激酶mTOR。AKT/mTOR通路是一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,通過響應(yīng)細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和抑制細(xì)胞凋亡[26]。據(jù)報道,AKT/mTOR的異常激活通常與腫瘤的惡性進(jìn)程相關(guān),如促進(jìn)乳腺癌和前列腺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[27]。此外,AKT/mTOR通路的上調(diào)也在很大比例的非小細(xì)胞肺癌患者中得到證實[28]。AKT/mTOR通路抑制劑已被確定為有希望的治療方法,用于延遲非小細(xì)胞肺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[29]。在非小細(xì)胞肺癌中,姜黃素和豆蔻素可下調(diào)p-AKT和p-mTOR的表達(dá),并抑制癌細(xì)胞的增殖和侵襲,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,提示靶向AKT/mTOR通路的分子可能是治療非小細(xì)胞肺癌的有效靶點[30,31]。最近的一份報告顯示,過表達(dá)CADM2可抑制食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中AKT通路的活化[13]。在本研究中,CADM2過表達(dá)抑制了A549和H460細(xì)胞中p-AKT和p-mTOR蛋白水平,說明CADM2過表達(dá)抑制了非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中AKT/mTOR信號通路的激活。值得注意的是,AKT/mTOR通路可與其他平行信號級聯(lián)反應(yīng),因此,進(jìn)一步探究CADM2在非小細(xì)胞肺癌中潛在的其他保護(hù)性作用具有重要意義。

綜上所述,CADM2通過抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲,促進(jìn)細(xì)胞凋亡來發(fā)揮抑癌作用,其機制是抑制AKT/mTOR信號通路的激活。因此,CADM2/AKT/mTOR軸可以作為一個潛在的靶點用于治療非小細(xì)胞肺癌。