周樹蘭,王 成(遵義醫(yī)科大學第五附屬(珠海)醫(yī)院手外科,珠海 519100;通訊作者,E-mail:906090860@qq.com)

目前動脈冷凍的難點是在凍融過程中即便消除溶質(zhì)損傷和冰晶損傷,內(nèi)皮細胞氧化應激和缺血再灌注損傷等事件將成為復蘇后較長時間內(nèi)依然發(fā)生血管活性喪失的刺激因素,造成血管生存極限;與此同時,以滲透性保護劑為主的二甲基亞砜作為器官凍存劑的毒性作用越來越引起人們的注意[1]。因此,不斷尋找毒性小、敏感性高的冷凍保護劑,是動脈低溫保存研究的焦點。

附子是一種著名的中藥,具有補火助陽、溫補腎陽、振奮心陽、散寒止痛等陽熱功效,而深低溫凍存環(huán)境陰寒,根據(jù)中醫(yī)辯證思維,性大熱的附子具有深低溫凍存保護劑的潛在特性;另一方面,現(xiàn)代醫(yī)學研究表明附子多糖(Fuzi polysaccharide,FPS)是來源于中藥附子的主要活性成分之一,由葡萄糖和阿拉伯糖聚合而成[2],無毒[3],具有免疫調(diào)節(jié)、抗高血糖、抗炎、抗腫瘤等多種作用[4]。本課題組前期研究表明,FPS在深低溫凍存中對腹主動脈組織層面有較好的保護作用[5]。為進一步探索其細胞分子保護機制,本研究觀察了不同濃度附子多糖在深低溫凍存中對腹主動脈線粒體結(jié)構(gòu)和功能的影響,尋找其最佳保護濃度及保護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6～8周齡雄性SD大鼠48只,SPF級,體質(zhì)量(190 ±30)g,購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司,動物許可證號SCXK(湘)2019-0014。

1.2 主要試劑與儀器

附子多糖(中山大學中西醫(yī)結(jié)合研究所),線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性檢測試劑盒(蘇州科銘生物技術(shù)有限公司),線粒體提取試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司),超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)測定試盒、過氧化氫酶(CAT)測定試劑盒、丙二醛(MDA)測定試劑盒、ATP酶(Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶)活力測定試劑盒(南京建成生物技術(shù)股份有限公司)。HT 7700透射電子顯微鏡(日本日立公司);UV-1200紫外-可見光分光光度計(安捷倫科技有限公司);全波段酶標儀(賽默飛世爾科技有限公司)。

1.3 樣品預處理

無菌環(huán)境下顯微鏡取大鼠腹主動脈,置于培養(yǎng)皿中,4 ℃操作臺上迅速去除殘血、多余脂肪和結(jié)締組織,濾紙吸干血管表面水分,于室溫、無風環(huán)境內(nèi)稱取重量,并記錄相應數(shù)據(jù)。隨機將血管分為新鮮組、保存對照組(滅菌注射用水)和多糖保存組(附子多糖0.1,1,10,20 mg/ml),每個濃度各8只。新鮮組取材后立即進行線粒體內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)采集分析,線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性,ATP酶(Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)、過氧化氫酶(CAT)活力和丙二醛(MDA)含量等各項指標檢測,保存對照組和多糖保存組取腹主動脈后于-196 ℃液氮中保存1周后進行上述各項指標檢測。

1.4 線粒體提取及蛋白含量測定

新鮮組取腹主動脈后立即進行線粒體提取及蛋白含量測定,保存對照組和多糖保存組腹主動脈液氮保存1周后將凍存管置于37 ℃水浴鍋內(nèi)快速復溫[6],待冰塊融化后用生理鹽水洗凈血管表面附子多糖殘留液,迅速放于無菌培養(yǎng)皿中并加入相應的提取液,4 ℃操作臺上顯微剪快速將血管組織修剪成約為2 mm×2 mm大小的組織塊,修剪完成后將組織液倒入手持玻璃勻漿器中,根據(jù)線粒體提取試劑盒及線粒體蛋白濃度測定試劑盒進行腹主動脈線粒體提取和蛋白濃度測定,為保證線粒體結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定,操作全程均在4 ℃條件下完成。

1.5 線粒體功能指標檢測

按照線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性測定試劑盒說明書進行操作檢測。按照SOD檢測試劑盒、GSH-Px檢測試劑盒、CAT檢測試劑盒和MDA檢測試劑盒說明書操作,分別檢測SOD、GSH-Px、CAT活力和MDA含量。分別按照ATP酶活力檢測試劑盒說明書檢測Na+-K+-ATP酶活力和Ca2+-ATP酶活力。

1.6 透射電鏡觀察線粒體內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)并采集分析各組線粒體內(nèi)外膜及基質(zhì)變化

將血管組織修剪成截面為2 mm×2 mm的小組織塊,將修剪好的小組織塊快速轉(zhuǎn)移至體積分數(shù)為4%多聚甲醛和2%戊二醛溶液固定過夜。之后用磷酸緩沖液(PBS,pH 7.4)漂洗3次,每次15 min;之后用1%鋨酸避光室溫固定2 h;PBS(pH 7.4)漂洗3次,每次15 min;組織塊依次放入體積分數(shù)為30%,50%,70%,80%,95%,100%,100%乙醇溶液中脫水每次20 min和100%丙酮2次,每次15 min。丙酮和812包埋劑1 ∶1比例37 ℃ 2～4 h,丙酮和812包埋劑1 ∶2比例37 ℃過夜,純812包埋劑37 ℃ 5～8 h。將組織塊放入盛有812包埋劑的包埋箱中37 ℃烘箱靜置24 h,后調(diào)整溫度至于60 ℃烤箱聚合48 h,取出樹脂塊,超薄切片后150目方華膜銅網(wǎng)撈片。后用2%醋酸鈾飽和酒精溶液避光染色8 min;70%乙醇清洗3次;超純水清洗3次;2.6%枸櫞酸鉛溶液避二氧化碳染色8 min;超純水清洗3次,濾紙吸干多余水分,放入銅網(wǎng)盒內(nèi)室溫干燥過夜。透射電鏡下觀察腹主動脈內(nèi)皮、平滑肌纖維大體形態(tài)和線粒體內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 FPS在深低溫保存中對腹主動脈線粒體蛋白濃度的影響

與新鮮組比較,保存對照組中線粒體蛋白大量降解(P<0.01);與保存對照組比較,多糖保存組線粒體蛋白的降解程度明顯減輕,而且FPS濃度越高,蛋白濃度越高,當濃度達到FPS 10 mg/ml時,溶液達到飽和狀態(tài),此時蛋白濃度最高(P<0.01);與FPS 10 mg/ml組比較,FPS 20 mg/ml線粒體蛋白濃度呈下降趨勢,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.1,見圖1)。

2.2 FPS在深低溫保存中對復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ活性的影響

與新鮮組比較,保存對照組復合體活力明顯降低(P<0.01)。與保存對照組比較,多糖保護組復合體活性逐漸增加,其中從1 mg/ml開始差異有統(tǒng)計學意義。其中濃度為10 mg/ml時,復合體活性達到最高,當繼續(xù)增加FPS濃度時,復合體活性呈下降趨勢(見表1)。

線粒體蛋白濃度比較,F=35.20,P<0.0001;與新鮮組比較,* *P<0.01;與保存對照組比較,##P<0.01圖1 分光光度法測定深低溫保存中線粒體蛋白的相對濃度Figure 1 The relative concentrations of mitochondrial proteins in cryopreservation by spectrophotometry

表1 深低溫凍存中不同濃度FPS對腹主動脈線粒體呼吸鏈復合體活性的影響

2.3 FPS在深低溫保存中對腹主動脈SOD、GSH-Px、CAT活力和MDA含量的影響

與新鮮組相比,保存對照組中抗氧化物酶SOD、GSH-Px、CAT活力明顯降低(P<0.01),MDA含量明顯升高(P<0.01);與保存對照組比較,加入不同濃度FPS處理后,多糖保存組SOD、GSH-Px、CAT活力逐漸上升,MDA含量逐漸下降,呈濃度依賴性;從1 mg/ml開始差異有統(tǒng)計學意義,FPS濃度達10 mg/ml時保護效應出現(xiàn)峰值(見表2)。

2.4 FPS在深低溫保存中對腹主動脈Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活力的影響

與新鮮組相比,保存對照組中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活力明顯降低(P<0.01);與保存對照組比較,加入不同濃度的FPS干預后,多糖保存組血管組織中ATP酶活力隨濃度增加而逐漸升高,這可能與FPS減輕呼吸鏈復合體損傷有關(guān),并從1 mg/ml開始與保存對照組差異有統(tǒng)計學意義,其中10 mg/ml時ATP酶活力達高峰(見表3)。

表2 FPS在深低溫保存中對腹主動脈線粒體SOD、GSH-Px、CAT活力和MDA含量的影響

表3 深低溫保存中不同濃度FPS對腹主動脈線粒體Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活力的影響

2.5 深低溫保存中不同濃度FPS對腹主動脈平滑肌線粒體內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)影響

新鮮組線粒體呈規(guī)則的橢圓型,輪廓分明,外膜光滑完整,內(nèi)脊密集且清晰可見,基質(zhì)分布均勻;深低溫保存使線粒體均出現(xiàn)不同程度的腫脹,保存對照組線粒體內(nèi)外膜完全破裂溶解呈碎片狀,內(nèi)脊幾乎降解消失,內(nèi)部基質(zhì)呈透明狀。FPS 0.1 mg/ml組線粒體內(nèi)外膜開始出現(xiàn)破裂溶解,膜結(jié)構(gòu)模糊,線粒體內(nèi)脊開始大量降解減少,基質(zhì)外流;FPS 1 mg/ml組線粒體外膜基本完整,但內(nèi)部結(jié)構(gòu)紊亂,內(nèi)脊大部分斷裂,基質(zhì)減少;FPS 10 mg/ml組線粒體呈較為規(guī)則的圓形或卵圓形,這可能與線粒體動力學有關(guān),輪廓較為分明,外膜完整光滑,基質(zhì)分布較保存對照組明顯增多,可見清晰線粒體內(nèi)脊;FPS 20 mg/ml組線粒體形態(tài)大多數(shù)呈圓形,外膜光滑完整,內(nèi)脊輪廓出現(xiàn)部分斷裂不連續(xù)現(xiàn)象,基質(zhì)分布均勻(見圖2)。

圖2 深低溫保存中不同濃度FPS對腹主動脈平滑肌線粒體內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)影響 (×25 000)Figure 2 The effect of different concentrations of FPS on the internal ultrastructure of abdominal aorta smooth muscle mitochondria under cryopreservation (×25 000)

3 討論

目前普遍認同深低溫保存具有長期保留生物器官組織活性[7]、降低組織器官免疫原性和抑制排斥反應[8]等作用,可以使組織器官得到有效復用。在這些器官組織移植中血管起到向移植部位供送血液的作用,只有血管保存成功了,才能保證移植器官或組織得到充分的血供,其成活才有希望。因此,凍存中血管結(jié)構(gòu)和功能的完整性對后期組織器官存活非常重要。

FPS是由單糖組成的大分子化合物,研究發(fā)現(xiàn),FPS通過降低低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,Ox-LDL)來抑制中性鞘磷脂酶(NSMase)/神經(jīng)酰胺(ceramide,Cer)信號通路激活并增強機體自噬活性,顯著改善血管鈣化[9,10];以及通過阻斷高遷移率族盒1(high-mobility group box 1,HMGB1)/晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(advanced-glycation end products,RAGE)通路抑制IL-6、IL-1、TNF-α等炎癥介質(zhì)的釋放,顯著抑制血管炎癥反應,減少缺血引起的血管損傷,以及通過提高細胞的吞噬活性及增加一氧化氮的生物利用度,改善血管內(nèi)皮損傷[11];此外,值得注意的是,FPS能增強雪旺細胞的抗氧化能力、下調(diào)NADPH氧化酶-1(Nox1)水平,顯著抑制高糖誘導的糖尿病周圍神經(jīng)氧化應激損傷[12]和通過較強的抗氧化能力減少肝臟缺血-再灌注損傷[13]。因此,FPS具有抗動脈粥樣硬化、抗炎、增強自噬、免疫調(diào)節(jié)、抗缺血再灌注損傷、抗高血糖血癥、抗氧化等多種生物學作用特性,這為冷凍保護劑研發(fā)提供了新思路。

線粒體是機體的能源工廠,也是調(diào)控凋亡、自噬、鈣離子、生物膜電位穩(wěn)態(tài)等多種細胞生理功能的細胞器,其結(jié)構(gòu)和功能的變化直接調(diào)節(jié)細胞存活或死亡的信號。有氧環(huán)境下,線粒體通過三羧酸循環(huán)進行氧化磷酸化產(chǎn)生ATP,供應各組織細胞能量,其中線粒體呼吸鏈復合體扮演著重要角色,當外在因素使線粒體呼吸鏈損傷時將阻礙氧化磷酸化的進行,使能量合成減少,打破細胞生理平衡,從而導致組織器官功能衰竭,本實驗中線粒體呼吸鏈復合體對低溫很敏感,強烈的低溫刺激后,線粒體呼吸鏈復合體活性顯著下降;此外,線粒體呼吸鏈功能障礙將促進電子泄漏,有利于ROS大量產(chǎn)生[14],其中復合體Ⅰ、Ⅲ和復合物Ⅱ相關(guān)的琥珀酸介導產(chǎn)生的ROS是細胞內(nèi)的主要來源[15],占細胞內(nèi)ROS的45%[16]。除上訴外,復合體Ⅳ,即細胞色素c氧化酶(COX),被認為是氧化磷酸化的調(diào)節(jié)中心,它會被氧化磷酸化的最終產(chǎn)物ATP反饋抑制,而這種“變構(gòu)ATP抑制”能保持低而健康的線粒體膜電位(放松狀態(tài)),并阻止ROS的形成[17]。ROS是一種具有化學活性的分子,包括羥基自由基(OH-)、超氧陰離子(O2-)、和過氧化氫(H2O2)等[18],生理條件下,ROS參與細胞的代謝調(diào)控,在生物體內(nèi)具有重要的功能;但當ROS積累上升到毒性水平時,將促使機體發(fā)生氧化應激,引起脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸,特別是DNA等大分子物結(jié)構(gòu)破壞從而導致細胞損傷壞死[19]。生物體內(nèi)存在完整的抗氧化系統(tǒng),它由各種抗氧化物酶組成,包括SOD、GSH-Px和CAT,它能將氧自由基還原成H2O和O2[20],避免氧化損傷的發(fā)生;其中MDA是脂質(zhì)過氧化最豐富的羰基產(chǎn)物,其含量高低間接反應了組織細胞氧化應激損傷的程度[21]。因此,線粒體呼吸鏈復合體功能損傷不僅影響氧化磷酸化,而且加重機體氧化應激損傷;而抗氧化物酶活性和MDA的含量則進一步反應了氧化損傷的程度。

此外,線粒體外膜和內(nèi)膜上有大量的ATP酶離子通道,參與機體能量轉(zhuǎn)換、電化學梯度維持、膜興奮性控制、滲透平衡和物質(zhì)運送等多個方面[22];因此,離子通道的開啟或關(guān)閉可以調(diào)節(jié)線粒體膜電位、ROS的產(chǎn)生和影響呼吸鏈復合體的功能[23]。Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶是生物膜上最常見的離子通道,它的活力依賴于細胞能量的變化,線粒體呼吸鏈損傷和過度的氧化應激將導致ATP酶活力下降,出現(xiàn)離子紊亂、鈣超載、細胞高滲水腫等造成線粒體膜電位下降,從而加重線粒體膜損傷,導致細胞質(zhì)到線粒體的流量過載[24,25]。

本研究中,深低溫保存導致線粒體呈現(xiàn)膨脹直至破損,線粒體膜出現(xiàn)破裂崩塌,內(nèi)容物流出減少消失,內(nèi)嵴分裂和線粒體功能嚴重下降,從而影響遠期血管能量代謝并加重氧化應激損傷,造成后期血管生存極限。隨著FPS濃度升高,線粒體損傷程度減輕,線粒體結(jié)構(gòu)趨于完整;同時,線粒體復合體Ⅰ～Ⅳ活性、ATP酶活力和抗氧化能力較保存對照組明顯上升,并呈濃度依賴性,其高濃度的FPS較低濃度FPS保護效果好,其中FPS 10 mg/ml組保護效應可能較好。

綜上所述,深低溫保存造成了線粒體結(jié)構(gòu)和功能損害,而FPS通過改善線粒體功能障礙并減輕組織氧化損傷,保護了深低溫保存中腹主動脈線粒體結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定,從而明顯提高細胞能量代謝儲備,為后期血管生存保存體力。我們猜想這可能與某種線粒體分子通路有關(guān),但其具體機制還有待實驗闡明。