錢 振,田小溪,校建波,王 琦,黃 潭,王繼鵬,王佳寧,張明明,李海榮(中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院急診科,西安 7003;中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院心內(nèi)科;通訊作者,E-mail:37666@qq.com)

目前,肥胖問題已成為一項制約社會和經(jīng)濟發(fā)展的公共衛(wèi)生問題,對社會和家庭帶來了較大的經(jīng)濟和身體負擔[1]。醫(yī)學專家統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),肥胖人群比例的增加與多種疾病如代謝綜合征、糖尿病、高血脂、高血壓等的發(fā)病率升高具有明顯的相關性[2]。代謝綜合征是一種包括糖類代謝紊亂、血脂代謝紊亂、高血壓等疾病的癥候群,并且與心腦血管疾病的發(fā)生密切相關[3,4]。目前的研究報道胰島素的抵抗是導致代謝綜合征發(fā)生的重要原因之一[5]。

鹽酸二甲雙胍(metformin hydrochloride,MH)是一種雙胍類降糖藥,目前已經(jīng)作為胰島素增敏劑廣泛應用于糖尿病的治療中,并且表現(xiàn)出較好的改善胰島素抵抗和降血糖的作用[6]。此外,還有研究報道鹽酸二甲雙胍具有控制體質量、降低心腦血管并發(fā)癥的作用。清痰化瘀飲是一種由黃芪、決明子、法半夏、茯苓等多種中藥材混合熬制的一味中藥[7]。研究發(fā)現(xiàn),清痰化瘀飲具有改善血脂和血糖代謝、保護血管內(nèi)皮、抑制血管平滑肌增生等多種作用,并且在治療動脈粥樣硬化、高血壓方面療效顯著[8]。

目前,中西醫(yī)結合在治療高血糖、高血脂等代謝性疾病方面取得了良好的效果。由于鹽酸二甲雙胍是一種胰島素增敏劑,而清痰化瘀飲同時具有降壓、降糖、改善平滑肌功能,因此,本研究推測鹽酸二甲雙胍聯(lián)合清痰化瘀飲可能對糖脂代謝具有協(xié)同作用。然而,目前尚不清楚鹽酸二甲雙胍聯(lián)合清痰化瘀飲在血脂調(diào)節(jié)和胰島素抵抗方面的作用。因此,本研究通過鏈脲佐菌素(STZ)和高脂飲食誘導大鼠胰島素抵抗,并探討了鹽酸二甲雙胍聯(lián)合清痰化瘀飲對大鼠血脂和胰島素抵抗的影響及可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗藥物和試劑 鹽酸二甲雙胍購自中美上海施貴寶制藥有限公司(國藥準字H20023371)。清痰化瘀飲為本院自制,清痰化瘀飲配方如下:黃芪30 g,決明子30 g,法半夏15 g,茯苓15 g,澤瀉15 g,蒼術15 g,白術15 g,砂仁15 g,山藥15 g,薏苡仁15 g,生山植30 g,桃仁12 g,紅花12 g,川穹9 g,甘草6 g。將藥材放入含有1 000 ml水的砂鍋中,然后常規(guī)煎煮,并濃縮蒸干,稱重后溶于100 ml蒸餾水中制備清痰化瘀飲浸膏。標準大鼠飼料購自武漢華聯(lián)科生物技術有限公司,飼料中的蛋白質、脂肪和碳水化合物的占比依次為25%,15%和60%。高脂飼料由標準飼料中加入膽固醇、豬油、白糖制備而成,該高脂飼料購自南通特洛菲飼料科技有限公司,高脂飼料中的蛋白質、脂肪和碳水化合物的占比依次為20%,60%和20%。

鏈脲佐菌素(STZ)購自美國Sigma公司。血清低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)ELISA試劑盒檢測購自上海紀寧生物科技有限公司。大鼠胰島素(INS)檢測試劑盒購自上海澤葉生物科技有限公司。血清瘦素ELISA檢測試劑盒購自上海恒遠生物科技有限公司。血清超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物科技有限公司。蘇木精和伊紅(HE)染色試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。RIPA裂解緩沖液購自北京索萊寶科技有限公司。BCA蛋白質測定試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。葡萄糖轉運蛋白(GLUT-4)、胰島素受體底物-1(IRS-1)和CAPDH一抗、辣根過氧化物酶標記的二抗購自美國Abcam公司。

1.1.2 實驗動物 100只6周齡無特定病原體級(SPF級)雄性SD大鼠購自西安交通大學實驗動物中心[許可證號:SYXK(陜)2018-001],體質量205～225 g,將大鼠飼養(yǎng)在(25 ±3)℃溫度、50%～60%相對濕度、12 h光照黑暗交替的環(huán)境中,飼養(yǎng)期間提供本實驗室自制的純凈水和相應的大鼠飼料。

1.2 方法

1.2.1 大鼠分組及處理 將100只SD大鼠隨機分為對照組、模型組、鹽酸二甲雙胍組、清痰化瘀飲組、鹽酸二甲雙胍+清痰化瘀飲組,每組20只大鼠。除對照組之外,其他組大鼠均經(jīng)尾靜脈注射一次性小劑量STZ造成胰島β細胞損傷。對照組大鼠喂養(yǎng)標準飼料,其他組喂養(yǎng)高脂飼料。喂養(yǎng)45 d后一次性經(jīng)尾靜脈注射小劑量STZ(15 mg/kg),然后分別對各組大鼠進行糖耐量檢查。糖耐量檢查方法如下:首先將大鼠過夜禁食不禁水14～16 h,然后尾靜脈取血并測定空腹血糖,然后以2 g/kg體質量的劑量灌胃20%的葡萄糖液,2 h后檢測尾靜脈血血糖值,將糖耐量異常(空腹血糖<7.0 mmol/L但高于4.0 mmol/L)的大鼠用于后續(xù)實驗。購買的20只對照大鼠中,有1只大鼠足部劃傷出血,1只大鼠口腔出血,3只大鼠活動性低、毛色暗淡、體質量明顯低于其他大鼠,因此剔除。80只建模的大鼠中3只死亡,63只建模成功,3只建模成功的大鼠進食少,體質量明顯低于其他大鼠,因此剔除。最終,對照組納入15只大鼠,60只建模成功的大鼠隨機分為4組,每組15只。鹽酸二甲雙胍組的大鼠每天按照160 mg/kg的劑量灌胃給予鹽酸二甲雙胍溶液,清痰化瘀飲組的大鼠每天按照500 mg/kg的劑量灌胃給予清痰化瘀飲浸膏。鹽酸二甲雙胍+清痰化瘀飲組大鼠每天分別按照160 mg/kg和500 mg/kg的劑量同時灌胃給予鹽酸二甲雙胍溶液和清痰化瘀飲浸膏。正常組和模型組的大鼠灌胃給予等體積的生理鹽水。共治療8周。

1.2.2 生化指標分析 治療完成后,大鼠禁食12 h,腹腔注射50 mg/kg的戊巴比妥鈉(上海新亞藥業(yè)有限公司)麻醉大鼠,取2 ml腹主動脈血加入抗凝管中,采用全自動生化分析儀檢測各組大鼠空腹血糖(FPG)、血清總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)。其余血液于3 000 r/min離心15 min,取上清,-80 ℃分裝保存。血清LDL、HDL和瘦素采用ELISA試劑盒檢測。血清胰島素(INS)采用大鼠INS檢測試劑盒檢測。

1.2.3 血清氧化應激指標檢測 取2 ml大鼠腹主動脈血加入抗凝管中,3 000 r/min離心15 min,取上清分裝,-80 ℃保存。血清SOD、GSH-Px和MDA嚴格按照試劑盒說明書進行檢測。

1.2.4 血清炎癥因子的檢測 血清TNF-α、IL-1和IL-6均采用ELISA檢測試劑盒測定。

1.2.5 蘇木精和伊紅(HE)染色 實驗結束后處死大鼠并迅速分離胰腺組織,然后使用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋,用切片機切成5 μm厚的切片,然后用常規(guī)的HE染色試劑盒進行染色,光學顯微鏡觀察胰島形態(tài)。

1.2.6 蛋白質印跡分析胰腺組織中GLUT-4的蛋白表達 將各組大鼠胰腺組織分離,剪碎,加入含有PMSF(1 mmol/L)的RIPA裂解緩沖液中裂解并均質化。將裂解物在4 ℃下以15 000 r/min離心15 min,轉移上清液至新的離心管。使用BCA蛋白質測定試劑盒測定總蛋白質。然后將蛋白質加載到10%SDS-PAGE上電泳并轉移到PVDF膜上,5% BSA封閉膜1 h,將膜與抗GLUT-4(1 ∶1 000)、IRS-1(1 ∶2 000)和GAPDH(1 ∶1 000)的一抗一起4 ℃過夜孵育。然后將膜與辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h,通過增強化學發(fā)光法(ECL)進行顯影。將蛋白質水平標準化為GAPDH。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 二甲雙胍和清痰化瘀飲對大鼠血糖的影響

結果顯示,模型組大鼠的空腹血糖水平顯著高于對照組(P<0.05)。鹽酸二甲雙胍組和清痰化瘀飲組大鼠的空腹血糖水平顯著低于模型組(P<0.05)。此外,鹽酸二甲雙胍+清痰化瘀飲組大鼠的空腹血糖水平顯著低于清痰化瘀飲組(P<0.05,見圖1)。

2.2 二甲雙胍和清痰化瘀飲對大鼠血脂的影響

結果顯示,模型組大鼠的血清TC、TG和LDL水平顯著高于對照組(P<0.05)。鹽酸二甲雙胍組和清痰化瘀飲組大鼠的TC、TG和LDL水平顯著低于模型組(P<0.05)。鹽酸二甲雙胍+清痰化瘀飲組大鼠的TC、TG和LDL水平顯著低于鹽酸二甲雙胍組和清痰化瘀飲組(P<0.05)。模型組大鼠的HDL水平顯著低于對照組(P<0.05)。鹽酸二甲雙胍組和清痰化瘀飲組大鼠的HDL水平顯著高于模型組(P<0.05)。鹽酸二甲雙胍+清痰化瘀飲組大鼠的HDL水平顯著高于鹽酸二甲雙胍組和清痰化瘀飲組(P<0.05,見表1)。

2.3 二甲雙胍和清痰化瘀飲對大鼠胰島素抵抗的影響

模型組大鼠的血清胰島素(INS)和瘦素水平顯著高于對照組(P<0.05)。鹽酸二甲雙胍組和清痰化瘀飲組大鼠的INS和瘦素水平顯著低于模型組(P<0.05)。鹽酸二甲雙胍+清痰化瘀飲組大鼠的INS和瘦素水平顯著低于鹽酸二甲雙胍組和清痰化瘀飲組(P<0.05,見表2)。

與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與鹽酸二甲雙胍組比較,&P<0.05;與清痰化瘀飲組比較,△P<0.05圖1 各組大鼠的空腹血糖(FPG)水平Figure 1 Fasting blood glucose level of rats in each group

表1 各組大鼠的總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)水平 (mmol/L)

表2 各組大鼠的胰島素和瘦素水平

2.4 二甲雙胍和清痰化瘀飲對大鼠氧化應激指標的影響

模型組大鼠的血清SOD和GSH-Px水平顯著低于對照組(P<0.05)。鹽酸二甲雙胍組和清痰化瘀飲組大鼠的SOD和GSH-Px水平顯著高于模型組(P<0.05)。鹽酸二甲雙胍+清痰化瘀飲組大鼠的SOD和GSH-Px水平顯著高于鹽酸二甲雙胍組和清痰化瘀飲組(P<0.05,見表3)。

模型組大鼠的血清膜質過氧化指標(MDA)水平顯著高于對照組(P<0.05)。鹽酸二甲雙胍組和清痰化瘀飲組大鼠MDA水平顯著低于模型組(P<0.05)。鹽酸二甲雙胍+清痰化瘀飲組大鼠的MDA水平顯著低于鹽酸二甲雙胍組和清痰化瘀飲組(P<0.05,見表3)。

2.5 二甲雙胍和清痰化瘀飲對大鼠炎癥因子的影響

模型組大鼠的血清炎癥因子TNF-α,IL-1和IL-6水平顯著高于對照組(P<0.05)。鹽酸二甲雙胍組和清痰化瘀飲組大鼠的TNF-α、IL-1和IL-6水平顯著低于模型組(P<0.05)。鹽酸二甲雙胍+清痰化瘀飲組大鼠的TNF-α、IL-1和IL-6水平顯著低于鹽酸二甲雙胍組和清痰化瘀飲組(P<0.05,見表4)。

表3 各組大鼠的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)水平

表4 各組大鼠的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素水平 (μg/L)

2.6 二甲雙胍和清痰化瘀飲對大鼠胰腺組織葡萄糖轉運蛋白(GLUT-4)和胰島素受體底物-1(IRS-1)表達的影響

模型組大鼠的胰腺組織GLUT-4和IRS-1蛋白表達水平顯著低于對照組(P<0.05)。鹽酸二甲雙胍組和清痰化瘀飲組大鼠的GLUT-4和IRS-1蛋白表達水平顯著高于模型組(P<0.05)。鹽酸二甲雙胍+清痰化瘀飲組大鼠的GLUT-4和IRS-1蛋白表達水平顯著高于鹽酸二甲雙胍組和清痰化瘀飲組(P<0.05,見圖2)。

與對照組比較,*P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與鹽酸二甲雙胍組比較,&P<0.05;與清痰化瘀飲組比較,△P<0.05圖2 各組大鼠的葡萄糖轉運蛋白-4(GLUT-4)和胰島素受體底物-1(IRS-1)蛋白表達水平Figure 2 Glucose transporter-4(GLUT-4) and insulin receptor substrate-1(IRS-1) protein expression levels of rats in each group

2.7 二甲雙胍和清痰化瘀飲對大鼠胰腺組織的影響

各組大鼠胰腺組織的HE染色結果顯示,對照組大鼠胰島呈球形團狀,邊界清晰,結構完整。模型組大鼠中胰島形態(tài)發(fā)生較大變化,結構混亂,邊界不清晰,并且細胞發(fā)生固縮并形成空泡,脂肪浸潤明顯。鹽酸二甲雙胍和清痰化瘀飲治療組大鼠的胰島形態(tài)明顯改善,結構較完整,邊界變清晰,空泡減少,脂滴沉積明顯減少。并且,鹽酸二甲雙胍+清痰化瘀飲組大鼠的胰腺組織病變程度明顯低于單藥治療(見圖3)。

黑色箭頭:胰島細胞;紅色箭頭:細胞空泡化、脂滴沉積;藍色箭頭:胰島邊界圖3 各組大鼠的胰腺組織H&E染色 (×200)Figure 3 H&E staining of pancreas tissue of rats in each group (×200)

3 討論

目前,雖然在全球范圍內(nèi)的某些貧困國家和地區(qū)生活的人群體質量仍然過低,然而,在大多數(shù)國家,肥胖累及人群的數(shù)量要遠多于營養(yǎng)不良。肥胖是代謝綜合征的主要危險因素之一[9,10],代謝綜合征的發(fā)生增加了心腦血管疾病的發(fā)生風險[3,4]。目前的研究報道胰島素的抵抗是導致代謝綜合征發(fā)生的重要原因,而肥胖是引起胰島素抵抗的獨立危險因素。因此,開發(fā)可用于防治代謝綜合征、糖尿病、高血脂等疾病的藥物具有重大意義。

本研究通過STZ聯(lián)合高脂飲食誘導大鼠胰島素抵抗,并探討了鹽酸二甲雙胍聯(lián)合清痰化瘀飲對大鼠血脂和胰島素抵抗的影響及可能機制。鹽酸二甲雙胍是一種雙胍類降糖藥,其機制與抑制游離脂肪酸從脂肪細胞中釋放并抑制肝糖原合成有關。目前鹽酸二甲雙胍已經(jīng)作為胰島素增敏劑廣泛應用于糖尿病的治療中,并且表現(xiàn)出較好的改善胰島素抵抗的作用。此外,還有研究報道鹽酸二甲雙胍還具有控制體質量、改善內(nèi)皮功能、降低心腦血管并發(fā)癥的作用[6]。

清痰化瘀飲是由多種中藥材混合熬制的一味中藥,包括黃芪、決明子、法半夏、茯苓、澤瀉、蒼術、白術、砂仁、山藥、薏苡仁、生山植、桃仁、紅花、川穹、甘草等。上述中草藥均具有多種生物活性,并且大多數(shù)藥材在我國有悠久的應用歷史,已經(jīng)作為多種疾病的治療藥物廣泛應用,主要功效包括抗菌、抗炎、降血壓、降血脂等。例如:黃芪具有止咳平喘、消炎祛痰、補氣健脾的功效。法半夏具有化痰消痞作用。生山楂健脾消食、降脂化濁。桃仁可活血祛瘀。紅花散瘀止痛、活血通經(jīng)。川芎祛風止痛、補氣活血。其他文獻報道,清痰化瘀飲具有改善血脂和血糖代謝、保護血管內(nèi)皮、抑制血管平滑肌增生等多種作用,并且在治療動脈粥樣硬化、高血壓方面療效顯著[7,8]。然而,目前尚不清楚鹽酸二甲雙胍聯(lián)合清痰化瘀飲在血脂調(diào)節(jié)和胰島素抵抗方面的作用。本研究發(fā)現(xiàn)鹽酸二甲雙胍和清痰化瘀飲均可有效降低大鼠的空腹血糖水平,此外,兩種藥物還可有效降低TC、TG和LDL水平,并且升高HDL水平。說明鹽酸二甲雙胍和清痰化瘀飲均具有降血糖和降血脂的作用。此外,本研究發(fā)現(xiàn)鹽酸二甲雙胍聯(lián)合清痰化瘀飲對血糖和血脂指標的改善作用明顯好于單藥治療。

本研究發(fā)現(xiàn)鹽酸二甲雙胍聯(lián)合清痰化瘀飲在降低胰島素方面的作用明顯好于單藥治療,說明該藥物組合更有助于提高胰島素敏感性。瘦素是一種脂肪組織的特異性分泌蛋白,可控制全身脂肪、葡萄糖代謝,并調(diào)節(jié)胰島功能[11]。當機體脂肪含量升高時,瘦素的水平也會迅速增加,并導致胰島素抵抗。本研究發(fā)現(xiàn)鹽酸二甲雙胍和清痰化瘀飲聯(lián)合用藥對瘦素的抑制作用明顯好于單藥治療。提示兩種藥物在降血糖、降血脂和提高胰島素敏感性方面的作用可能與調(diào)節(jié)瘦素合成和分泌有關。

代謝綜合征的發(fā)生涉及氧化應激。大量研究證實,機體內(nèi)產(chǎn)生大量自由基時可導致胰島β細胞凋亡并增加胰島素抵抗性。SOD和GSH-Px是兩種重要的抗氧化酶,SOD具有清除超氧陰離子的能力,可將其轉化為毒性較小的過氧化氫,而GSH-Px可進一步將過氧化物轉化生成水,從而降低氧化應激損傷。MDA是膜脂質過氧化反應產(chǎn)物。本研究顯示鹽酸二甲雙胍和清痰化瘀飲聯(lián)合用藥可將SOD、GSH-Px和MDA水平恢復至與正常大鼠無顯著差異的水平。說明兩種藥物改善胰島素抵抗的作用與降低氧化應激損傷有關。

糖尿病、高血脂、高血糖的發(fā)生與免疫功能紊亂密切相關,大量文獻證實上述病變發(fā)生時機體內(nèi)炎癥反應加劇。TNF-α、IL-1和IL-6均是重要的促炎細胞因子。有研究報道,IL-1和IL-6可過度激活殺傷性T淋巴細胞,從而引起胰島β細胞死亡[12]。TNF-α可抑制葡萄糖轉運蛋白(GLUT-4),從而誘發(fā)胰島素抵抗。本研究顯示模型組大鼠的TNF-α、IL-1和IL-6水平顯著升高,而鹽酸二甲雙胍和清痰化瘀飲聯(lián)合用藥對上述炎癥因子的抑制作用明顯好于單藥治療。說明兩種藥物的降血脂和提高胰島素敏感性的作用可能通過抑制炎癥反應來實現(xiàn)。

葡萄糖轉運蛋白(GLUT-4)是促進葡萄糖轉運的跨膜蛋白,與胰島素抵抗密切相關,GLUT4可通過與胰島素結合實現(xiàn)葡萄糖的轉運,GLUT4被抑制可直接導致糖代謝異常[13]。胰島素受體底物-1(IRS-1)是胰島素受體酪氨酸激酶的底物[14]。當胰島素與其受體結合時可導致胰島素受體酪氨酸激酶和IRS-1的磷酸化,然后與P13K的P85亞基結合并激活P13-2K,繼而激活Akt或PKB,從而促進GLUT4轉位至細胞膜并進行葡萄糖轉運。因此,IRS-1和GLUT-4的抑制均可引起高血糖和胰島素抵抗。本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠的GLUT-4和IRS-1表達被抑制,而鹽酸二甲雙胍和清痰化瘀飲聯(lián)合用藥顯著上調(diào)了GLUT-4和IRS-1的蛋白表達,說明兩種藥物可通過上調(diào)GLUT-4和IRS-1的表達來發(fā)揮降血糖和提高胰島素敏感性的作用。

綜上所述,鹽酸二甲雙胍和清痰化瘀飲均具有較好的降血糖、降血脂和提高胰島素敏感性的作用。但與單獨給藥相比,兩種藥物聯(lián)用的效果更好。其機制與藥物對氧化應激損傷和炎癥因子表達的抑制,及其胰腺組織GLUT-4和IRS-1的表達上調(diào)有關。