羅 丹,李媛媛,秦雪梅,杜冠華,周玉枝(山西大學中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心,太原 00006;山西大學化學生物學與分子工程教育部重點實驗室;地產(chǎn)中藥功效物質(zhì)研究與利用山西省重點實驗室;山西大學化學化工學院;中國醫(yī)學科學院、北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所;通訊作者,E-mail:zhouyuzhi@sxu.deu.cn)

在我國中華文明史中酒文化源遠流長,適當飲酒有益于加快代謝、還可舒緩心情,具有通絡(luò)散寒止痛等功效。但酒為濕熱有毒之品,短時間內(nèi)引入過量酒精會嚴重損害機體多種臟器功能,其中對肝臟和神經(jīng)系統(tǒng)的傷害尤為嚴重。對于神經(jīng)系統(tǒng)的損傷,主要表現(xiàn)在行為學,如運動平衡功能失調(diào)、空間記憶力及肢體肌力的降低等[1-4]。肝臟作為乙醇代謝及解毒的重要器官,飲酒過度會導致肝臟病理性損傷,從而引發(fā)酒精性肝病(alcoholic liver dieaseas,ALD)[5]。越來越多研究表明ALD與氧化應激密切相關(guān)[6,7]。這是由于乙醇代謝過程中會增加人體內(nèi)的自由基或活性氧,此時機體抗氧化水平降低,促氧化劑的產(chǎn)生增加,致使酗酒者體內(nèi)促氧化劑和抗氧化劑之間存在不平衡,引發(fā)氧化應激反應[8]。從目前看來,市場上涌現(xiàn)出的解酒護肝藥物都有一定的局限性[9,10]。因此,開發(fā)天然、有效的抗氧化劑作為解酒護肝產(chǎn)品是一個良好的策略。

黃芩葉(Scutellaria baicalensis leaves,SBL)作為唇形科黃芩屬植物黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的非藥用部位,同樣具有清熱燥濕、瀉火解毒、消炎、促消化之功效。并且黃芩葉作為別樣茶飲用歷史悠久,山西等地民間常將黃芩葉自制成具有保健功能的黃芩葉茶[11],目前黃芩葉食品安全地方標準已被列入山西省2020年食品安全地方標準制定計劃中?，F(xiàn)代藥理研究表明,黃芩葉因含有豐富的黃酮類化合物而具有良好的抗氧化保肝活性[12]。目前已有報道明確黃芩莖葉總黃酮對CCl4誘導的大鼠肝損傷和肝纖維化有顯著的保護作用[13,14]。因此為進一步擴大黃芩葉資源利用,也為開發(fā)具有保健食用功能的黃芩茶等產(chǎn)品提供一定的理論依據(jù),需要進一步研究黃芩葉是否具有解酒和防治酒精性肝損傷的功效。本文圍繞黃芩葉總提物(Scutellaria Baicalensis leaf extract,SBLE)的解酒保肝作用展開研究,在實驗中以56°紅星二鍋頭灌胃小鼠,然后用SBLE進行干預,通過行為學實驗探討SBLE的解酒作用。并對肝損傷小鼠血清AST、ALT、TG水平和肝組織中SOD、GSH-Px、ADH活性和MDA含量進行分析,明確SBLE的解酒護肝作用,以期為黃芩葉的開發(fā)應用提供一定的指導意義。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)檢測試劑盒(C010-2-1)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,ALT)檢測試劑盒(C009-2-1)、甘油三酯(triglycerides,TG)檢測試劑盒(A110-1-1)、總超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性檢測試劑盒(A001-3-2)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒(A003-1-2)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)檢測試劑盒(A005-1-2)、乙醇脫氫酶(alcohol dehydroge-nase,ADH)檢測試劑盒(A005-1-2);RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);SCIENTZ-12N真空冷凍干燥機(寧波新芝生物科技股份有限公司);Morris水迷宮(150 cm×60 cm×30 cm;北京眾實科技股份有限公司);infinite M200 PRO酶標儀(ECAN公司);自制金屬網(wǎng)格(孔徑1 cm×1 cm);G50組織勻漿研磨儀(上海生工公司);Centrifuge TDL-5高速離心機(上海安亭科學儀器廠);BSA124S電子天平(賽多利斯科學儀器有限公司);TU-1810紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)。

1.2 藥物

黃芩葉樣本購于山西佳辰中藥材開發(fā)有限公司,經(jīng)山西大學秦雪梅教授鑒定為黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的葉,然后進行干燥并保存于山西大學中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心;56°紅星二鍋頭白酒(北京紅星二鍋頭股份有限公司);水飛薊賓膠囊(天津天士力圣特制藥有限公司)。

1.3 動物

SPF級雄性ICR小鼠,購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,體質(zhì)量為18 ～22 g,每8只小鼠飼養(yǎng)在一個籠子,使其自由飲食、飲水。飼養(yǎng)環(huán)境良好、恒溫(25 ±1)℃、恒濕(50 ±5)%、光照周期為12 h的晝夜交替。動物實驗獲得山西大學倫理委員會的批準。

1.4 黃芩葉總提物的制備

取一定質(zhì)量的干燥黃芩葉,第一次加10倍的水煎煮1 h,過濾得濾液。同時藥渣進行第二次提取,繼續(xù)加10倍量的水,煎煮1 h,過濾得濾液,合并兩次濾液并濃縮,使用冷凍干燥技術(shù)制備黃芩葉總提物。

1.5 動物分組及模型建立

選用60只SPF級ICR雄性小鼠,每組10只。各實驗均設(shè)立空白組、模型組、黃芩葉總提物高、中、低劑量組(生藥量分別3.2,1.6,0.8 mg/kg)、水飛薊賓組(0.06 g/kg)?？瞻捉M小鼠予以0.1 ml/10 g蒸餾水灌胃;模型組小鼠灌胃同體積蒸餾水30 min后,按照1.2 ml/10 g的劑量給予56°紅星二鍋頭;黃芩葉總提物高、中、低劑量組分別按照生藥量3.2,1.6,0.8 mg/kg劑量灌胃,水飛薊賓組按0.06 g/kg劑量灌胃,30 min后,均以0.12 ml/10 g的56°紅星二鍋頭進行酒精灌胃。各實驗組按相應受試物持續(xù)灌胃2周。通過行為學檢測(轉(zhuǎn)棒實驗、攀爬實驗、爬桿實驗、步態(tài)實驗和水迷宮實驗)考察SBLE的解酒作用。并在最后一次給予酒精2 h后處死,通過計算小鼠體質(zhì)量、肝臟指數(shù)、血清肝損傷指標和肝臟氧化應激指標、乙醇脫氫酶活性以此來評價SBLE對急性酒精誘導肝損傷小鼠的保護作用。

1.6 行為學檢測

1.6.1 轉(zhuǎn)棒實驗 小鼠分組、給藥方案同“1.5”。實驗前剔除掉在棒上停留時間不超過3 min的小鼠?？瞻捉M給予生理鹽水,其余各組灌酒10 min時分別將動物放入15 r/min轉(zhuǎn)棒式疲勞儀內(nèi),1只/室,記錄3 min內(nèi)小鼠第一次從轉(zhuǎn)棒上掉落的時間以及平衡失誤次數(shù)即掉落次數(shù)。

1.6.2 攀爬實驗 小鼠分組、給藥方案同“1.5”。目前常用攀爬實驗來評價動物肢體肌力與協(xié)調(diào)力。給予酒精后立即將小鼠放至在水平懸空的金屬網(wǎng)中央,然后立即翻轉(zhuǎn)金屬網(wǎng),使小鼠呈倒掛狀態(tài)。觀察小鼠的攀附運動情況,并記錄下各組小鼠的攀附時間。以掉落3次為終止,計算3次攀附時間的均值作為其最終實驗結(jié)果。

1.6.3 爬桿實驗 小鼠分組、給藥方案同“1.5”。小鼠的肢體協(xié)調(diào)能力及運動遲緩狀態(tài)主要由爬桿實驗進行評價,小鼠爬桿用時越短或得分越少,說明小鼠四肢攀附能力強且協(xié)調(diào)性好,反之則說明小鼠協(xié)調(diào)性及攀附能力差。參考文獻[15]中爬桿實驗,選用直徑為15 mm,長50 cm的木桿,表面包裹紗布,以增加摩擦力,防止小鼠爬桿時打滑或順桿滑下。正式實驗開始前訓練小鼠爬桿,直至小鼠利用后腿抱桿向下爬行,同時剔除掉抱桿停留或反向爬行的小鼠。實驗時,灌胃56°紅星二鍋頭白酒10 min后,將小鼠頭向下放置在桿的頂部,記錄其爬行總時長并觀察爬行過程中的運動狀態(tài)。實驗重復3次,將3次爬桿時長的平均值作為該只小鼠的爬行時間。依據(jù)文獻[16]所述將向下爬行過程中的行為按照如下標準計分:四肢并用,一次順利從桿上爬下為0分;一步一步螺旋向下爬行但兼有后肢滑行行為的為0.5分;上桿后間歇停頓數(shù)次后爬下,但可抱緊金屬桿為1分;滑行后掉落為1.5分;不能抓桿,直接掉落為2分。

1.6.4 步態(tài)實驗 通過統(tǒng)計酒精誘導后小鼠左前肢、左后肢、右前肢、右后肢的平均步長來反映小鼠肢體的步態(tài)異常。小鼠兩前肢或者兩后肢之間的平均步長距離越短,則說明步態(tài)出現(xiàn)異常。參考文獻[17]中正式實驗前進行訓練,直至所有的動物在沒有刺激的條件下可以不停頓地完成在跑道上的行走。實驗裝置為長60 cm,寬10 cm,兩側(cè)高8 cm的U型透明亞克力通道,開口向上,底面提前墊好已裁剪的白紙。通道的一端放置10 cm×10 cm×8 cm的立方體黑色暗盒,通道的另一端,放置前足已涂好黑色、后足已涂好紅色顏料的小鼠,使其通過亞克力通道跑入暗盒中,而后通過對白紙上留下的足印進行步態(tài)分析。計算步態(tài)數(shù)據(jù)時,一般剔除第一步和最后一步,選取足印中較清晰的連續(xù)3步。本實驗中測量并記錄以下數(shù)據(jù):左前肢平均步長,左后肢平均步長,右前肢平均步長,右后肢平均步長。

1.6.5 水迷宮實驗 為評估黃芩葉總提物對醉酒小鼠空間學習記憶能力的改善作用,利用水迷宮系統(tǒng)對各組小鼠進行連續(xù)4 d的訓練和測試,通過定位航行和空間探索兩部分實驗考察小鼠的認知功能[18]。定位航行試驗:實驗前4 d為訓練階段,將水中加入黑色染料后,隨機選取第一、二、三、四象限中任意象限放入水中。每天訓練兩次,記錄小鼠在60 s內(nèi)尋找到平臺的時間,即為逃避潛伏期。如果小鼠60 s內(nèi)成功找到平臺,則記錄實際找到平臺所需時間則為逃避潛伏期;如果小鼠在60 s內(nèi)未能成功找到平臺,此時逃避潛伏期記錄為60 s,且人為進行引導使其在平臺上停留15 s?？臻g探索試驗:實驗第5天撤去平臺,將小鼠面向池壁放入與平臺象限正好相對的區(qū)域水中,開始記錄小鼠60 s內(nèi)潛伏期、穿越平臺次數(shù)以及目標象限停留的時間,并以此判斷小鼠空間記憶能力。

1.7 樣本采集與指標檢測

末次灌胃后禁食不禁水6 h,小鼠摘眼球采血,3 000 r/min離心10 min,分離得到的血清按照試劑盒說明書進行操作,測定血清AST、ALT、TG;解剖取出肝臟稱重后,以生理鹽水為緩沖液制備10%肝組織勻漿,然后以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min,取上清液,按照試劑盒說明書方法測定肝組織中SOD、GSH-Px、MDA、ADH的含量。

1.8 統(tǒng)計學分析

釆用統(tǒng)計軟件GraphPad Prism 8.2進行統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)采用one way-ANOVA進行多組間差異比較,多組間兩兩比較采用Tukey’st檢驗。相關(guān)性檢驗采用Pearson檢驗,P<0.05被認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 SBLE對小鼠運動協(xié)調(diào)功能的影響

酒精灌胃處理小鼠后,空白對照組小鼠精神狀態(tài)良好、反應較為敏捷,且無醉酒表現(xiàn)。而在灌胃酒精10 min左右,模型組小鼠相繼出現(xiàn)行為異常的現(xiàn)象,如精神狀態(tài)不佳、后腹拖地、共濟失調(diào)等狀況。上述行為表現(xiàn)在給藥后有明顯改善。

2.1.1 轉(zhuǎn)棒實驗 實驗結(jié)果表明,與空白對照組比較,模型組轉(zhuǎn)棒停留時間明顯縮短(P<0.001),轉(zhuǎn)棒掉落次數(shù)明顯增多(P<0.001,見圖1)。與模型組比較,黃芩葉總提物中劑量組和高劑量組小鼠轉(zhuǎn)棒停留時間明顯升高(P<0.05),水飛薊賓組和黃芩葉總提物低、中、高劑量組轉(zhuǎn)棒掉落次數(shù)均顯著性回調(diào)(P<0.001或P<0.01,見圖1)。提示黃芩葉具有改善乙醇所致小鼠平衡失調(diào)現(xiàn)象。

2.1.2 攀爬實驗 從實驗結(jié)果可以看出,模型組小鼠攀爬時間較空白組減少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。相較于模型組,給藥后黃芩葉低、中劑量組攀爬時間差異無統(tǒng)計學意義,而黃芩葉總提物高劑量組較模型組攀爬時間提升,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見圖1)。以上結(jié)果說明經(jīng)黃芩葉干預后醉酒后小鼠的動作協(xié)調(diào)性與肌肉力量得以改善。

2.1.3 爬桿實驗 與正常對照組比較,模型組小鼠爬桿時間顯著減少(P<0.001),爬桿得分明顯增大(P<0.001,見圖1)。與模型組比較,低劑量、中劑量和高劑量組小鼠爬桿時間顯著減少(P<0.01或P<0.001),低劑量和中劑量組小鼠爬桿得分較模型組差異無統(tǒng)計學意義,而黃芩葉總提物高劑量組干預的小鼠爬桿得分明顯增加(P<0.05,見圖1)。說明乙醇灌胃小鼠在給予SBLE治療后,可起到改善其運動遲緩、協(xié)調(diào)肢體平衡的作用。

2.1.4 步態(tài)實驗 與空白組比較,模型組小鼠的左右側(cè)的前后肢平均步長均縮短(P<0.05)。與模型組比較,低劑量和中劑量組小鼠平均步長差異無統(tǒng)計學意義,但是黃芩葉總提物高劑量組小鼠左前肢和左后肢平均步長顯著增加(P<0.05)。同時水飛薊賓組小鼠的左前肢、左后肢、右前肢、右后肢平均步長較模型組均顯著增加(P<0.05或P<0.01,見圖1)。以上結(jié)果說明SBLE可緩解醉酒小鼠的步態(tài)紊亂,延長平均步長延長,從而改善其醉酒步態(tài)。

與空白組比較,#P<0.05,###P<0.001;與模型組比較,*P<0.05,* *P<0.01,* * *P<0.001圖1 SBLE對醉酒小鼠運動協(xié)調(diào)能力的影響Figure 1 The effect of SBLE on the motor coordination ability of drunk mice

2.2 SBLE對小鼠認知功能的影響

訓練期間1～4 d,相比空白對照組,模型組小鼠尋找到平臺的時間略有下降,但是尋找到平臺的時間仍多于其余各組;同時各給藥組的逃逸潛伏期有下降趨勢,但相較于模型組差異無統(tǒng)計學意義(見圖2)。實驗第5天,與正常對照組比較,模型組逃逸潛伏期明顯延長(P<0.001);給藥后,黃芩葉總提物中劑量組的潛伏期較模型組顯著縮短(P<0.001,見圖2)。與空白組比較,模型組小鼠穿越平臺次數(shù)明顯減少(P<0.001),穿越目標象限的時間也顯著下降(P<0.05,見圖2),表明乙醇誘導小鼠空間探索能力和學習記憶能力有所下降。與模型組比較,黃芩葉總提物中、高劑量組小鼠的穿越平臺次數(shù)明顯增多(P<0.01),而穿越目標平臺時間差異無統(tǒng)計學意義。以上實驗結(jié)果表明,急性酒精誘導會對空間識別和學習記憶能力造成一定的損傷,損傷的程度可能與飲酒的劑量和周期有一定的關(guān)系。而黃芩葉可以通過縮短逃逸潛伏期、增加穿越平臺次數(shù)表現(xiàn)出對醉酒小鼠空間學習記憶能力的保護作用。

空白組比較,#P<0.05,###P<0.001;與模型組比較,* *P<0.01,* * *P<0.001圖2 SBLE對醉酒小鼠學習記憶的影響Figure 2 The effect of SBLE on the learning and memory of drunk mice

2.3 SBLE對小鼠體質(zhì)量及肝指數(shù)的影響

從實驗開始時(第0天),各組別之間的體質(zhì)量差異沒有統(tǒng)計學意義。第14天,與正常對照比較,模型組小鼠體質(zhì)量減輕(P<0.001)。給予SBLE治療后,與模型組相比,黃芩葉總提物低、中劑量組體質(zhì)量差異不具有統(tǒng)計學意義,而高劑量組體質(zhì)量較模型組相比明顯升高(P<0.05,見圖3)。與空白組比較,模型組肝臟指數(shù)顯著升高(P<0.01),經(jīng)過藥物干預后,黃芩葉總提物高劑量組和水飛薊賓組較模型組均有顯著回調(diào)(P<0.05,見圖3)。以上結(jié)果表明,黃芩葉總提物能夠有效逆轉(zhuǎn)酒精引起的體質(zhì)量減輕和肝臟指數(shù)升高。

2.4 SBLE對小鼠血清肝損傷指標的影響

與正常組比較,模型組中小鼠血清AST、ALT和TG水平顯著性升高(P<0.001或P<0.05)。相較于模型組,黃芩葉總提物中劑量組和高劑量組AST水平顯著下降(P<0.001或P<0.05);中劑量組ALT水平顯著降低(P<0.01);高劑量組和水飛薊賓組TG水平均明顯下降(P<0.05,見圖4)。實驗結(jié)果顯示黃芩葉提取物具有一定的保肝作用。

2.5 SBLE對小鼠肝臟氧化應激指標的影響

相較于空白組,模型組SOD和GSH-Px活性顯著衰減(P<0.01),MDA水平明顯增高(P<0.01),提示肝損傷小鼠體內(nèi)氧化還原失衡。相較于模型組,黃芩葉總提物中劑量組肝臟SOD和GSH-Px活性顯著提升(P<0.05),MDA水平顯著降低(P<0.01);黃芩葉總提物高劑量組GSH-Px活性明顯增強(P<0.05),MDA水平顯著降低(P<0.01,見圖5)。說明SBLE可通過提高機體抗氧化能力,來緩解乙醇對小鼠肝臟造成的損傷。

與空白組比較,##P<0.01,###P<0.001;與模型組比較,*P<0.05圖3 SBLE對小鼠體質(zhì)量及肝指數(shù)的影響Figure 3 The effect of SBLE on body weight and liver index of mice

與空白組比較,#P<0.05,###P<0.001;與模型組比較,*P<0.05,* *P<0.01,* * *P<0.001圖4 SBLE對小鼠血清肝損傷指標的影響Figure 4 The effect of SBLE on liver injury indicators in serum of mice

空白組比較,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,* *P<0.01圖5 SBLE對小鼠肝臟氧化應激指標影響Figure 5 The influence of SBLE on the oxidative stress indicators of mouse liver

2.6 小鼠肝臟ADH的活性變化及其與神經(jīng)行為學的關(guān)聯(lián)分析

相對于空白組,模型組中小鼠肝臟的ADH活力極顯著下降(P<0.05),但給予黃芩葉中劑量提取物預處理后,其活力明顯增強(P<0.05,見圖6),而低劑量組和高劑量組ADH活性相較于模型組差異不具有統(tǒng)計學意義。說明黃芩葉總提物通過提高小鼠肝臟中ADH活性,加速體內(nèi)酒精的代謝,從而減輕酒精對機體的毒性作用,達到改善酒精引起的行為異常的目的。除此之外,通過對小鼠肝組織ADH活性與醉酒小鼠行為學指標進行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)ADH活性與乙醇誘導的醉酒行為學指標存在相關(guān)性,其中與轉(zhuǎn)棒停留時間呈正相關(guān)(r=0.756 3,P<0.001),與轉(zhuǎn)棒掉落次數(shù)呈負相關(guān)(r=-0.635 0,P<0.001),與攀爬時間呈正相關(guān)(r=0.501 0,P<0.05),與爬桿時間呈負相關(guān)(r=-0.537 6,P<0.01),與逃逸潛伏期呈負相關(guān)(r=-0.670 2,P<0.001),與穿越平臺次數(shù)呈正相關(guān)(r=0.633 0,P<0.001,見圖6)。從圖中可以看出,隨著肝組織中ADH活性越強,體內(nèi)酒精代謝速度明顯加快,此時醉酒引起的共濟失調(diào)和學習記憶能力下降等癥狀得到明顯改善,表現(xiàn)為轉(zhuǎn)棒實驗中在棒運動時間隨之增加、掉落次數(shù)減少;攀爬實驗中攀爬時間隨之增加;爬桿實驗中爬行總時間隨之減少;水迷宮實驗中逃逸潛伏期也隨之降低、目標象限穿越次數(shù)隨之增加。其中與ADH活性相關(guān)性最強的為轉(zhuǎn)棒實驗中在棒運動時間,提示轉(zhuǎn)棒實驗可以作為反映醉酒平衡狀態(tài)失調(diào)可靠的行為學指標。

圖6 肝臟ADH活性的變化與酒精誘導小鼠醉酒行為之間的相關(guān)性Figure 6 Changes of hepatic ADH activity and its correlation with alcohol-induced drunkeness behavior in mice

3 討論

近年來,黃芩葉作為黃芩的非藥用部位,資源量豐富卻尚未得到充分利用就被丟棄的現(xiàn)象受到人們的廣泛關(guān)注?，F(xiàn)代醫(yī)學研究表明,黃芩葉具有解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、抗氧化、保肝等豐富的藥理活性和藥用價值,顯示出良好的應用前景[19]。開發(fā)的產(chǎn)品主要有可清熱燥濕、瀉火解毒、消炎、促消化的“黃芩茶”[11]、用于急性咽炎、急性扁桃體炎的“黃芩莖葉解毒膠囊”等[20]。于是為了進一步開發(fā)出具有保健功能的產(chǎn)品,我們對其保肝活性進行文獻調(diào)研,發(fā)現(xiàn)黃芩莖葉總黃酮對乙醇損傷的小鼠肝細胞有明顯的保護作用[21]。于是本實驗針對黃芩葉總提物對于酒精誘導小鼠的解酒及抗酒精性肝損傷作用展開進一步研究。水飛薊賓作為保肝藥在臨床上被廣泛應用,其作用機制與抗氧化、清除自由基、防止脂質(zhì)過氧化、促進肝細胞再生等有關(guān),因此本研究以其為陽性對照藥。乙醇經(jīng)由消化道吸收后,在肝臟內(nèi)代謝,當血液中乙醇濃度過高時進一步會隨著血液循環(huán)短時間內(nèi)大量入腦,抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng),從而產(chǎn)生明顯的醉酒反應。臨床表現(xiàn)為昏睡、平衡失調(diào)、學習認知能力減退等癥狀。同時還會嚴重損害肝功能等[22,23]。因此,本研究采用急性酒精誘導,從協(xié)調(diào)運動、改善學習記憶能力、保肝護肝等多個方面研究黃芩葉的解酒保肝功效,初步探索其作用機制。

目前,針對酒精對機體造成的損傷主要集中在對肝損傷的研究,而對于乙醇誘發(fā)的神經(jīng)行為學變化的研究仍不是很多。因此為了較為全面地評價SBLE的解酒功效,我們對醉酒小鼠進行了行為學評價。文獻報道轉(zhuǎn)棒實驗、網(wǎng)格實驗、爬桿實驗、步態(tài)實驗常用于評價小鼠醉酒后肌力和運動協(xié)調(diào)能力[15,17,24]。Morris迷宮法較為廣泛地應用于研究動物學習記憶、空間探索與認知能力[25]。于是在本研究中,通過酒精致小鼠共濟失調(diào)實驗和水迷宮實驗,對SBLE的解酒作用進行考察。結(jié)果顯示SBLE對急性酒精中毒的小鼠平衡運動功能失調(diào)有一定的逆轉(zhuǎn)作用。Morris水迷宮實驗結(jié)果顯示SBLE對急性酒精誘導所致的小鼠空間探索能力和學習記憶障礙有一定緩解作用。說明SBLE可改善小鼠醉酒后的共濟失調(diào)和學習記憶障礙,提示SBLE可能具有良好的解酒作用。

保肝功效的研究主要對實驗小鼠的體質(zhì)量、肝臟系數(shù)、血清肝損傷指標、肝組織乙醇脫氫酶和氧化應激指標進行了測定。當攝入過量酒精時,肝臟內(nèi)代謝生成的大量乙醛會導致其抗氧化系統(tǒng)的活性降低,SOD等抗氧化能力減弱,從而致使機體的氧化和抗氧化失衡,誘發(fā)氧化應激,導致脂質(zhì)過氧化等連鎖反應,從而引起肝損傷。此時變化較為明顯的是肝臟中血清酶類,其中轉(zhuǎn)氨酶類的變化最為突出,如ALT和AST,被認為是肝損傷的敏感指標[26]。當脂乙醇進入體內(nèi)后,大量增多的磷酸甘油進一步生成TG,導致脂肪在肝臟內(nèi)沉積,因此酒精性肝病往往伴隨著肝重增大。在ADH氧化系統(tǒng)中,乙醇氧化生成的乙醛是致使肝損傷的直接原因。ADH活性表現(xiàn)為降低時,肝細胞內(nèi)大量蓄積的乙醛會進一步加劇肝細胞的損傷[27]。酒精對肝組織產(chǎn)生氧化應激損傷[28],表現(xiàn)為SOD與GSH-Px活性降低,致使MDA等脂質(zhì)過氧化物大量積聚,加速損傷肝細胞。因此,藥物一方面可以通過直接加快體內(nèi)的乙醇氧化代謝來解酒,另一方面通過增強清除自由基的抗氧化能力來保肝。實驗結(jié)果證實,水飛薊賓可以顯著降低血清TG水平、增強肝組織GSH-Px和ADH活性。SBLE能顯著降低乙醇導致的小鼠血清AST、ALT、TG水平的升高;通過提高小鼠肝組織SOD和GSH-Px活性,降低肝組織MDA含量,來達到減弱酒精代謝產(chǎn)物對機體損害的目的;通過升高肝臟內(nèi)ADH活性、加強肝細胞中乙醇代謝來減弱酒精對肝臟造成的損害。除此之外,將ADH和行為學進行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)SBLE可以通過提高ADH活性來逆轉(zhuǎn)乙醇所致的小鼠學習認知障礙及平衡性失調(diào)現(xiàn)象,因此具有良好的解酒及中樞保護作用。結(jié)果表明SBLE可以通過加速乙醇在肝臟內(nèi)的快速代謝,改善乙醇代謝物及其誘導的氧化應激所致的肝細胞損傷,來發(fā)揮保護肝臟的作用。以上實驗結(jié)果提示,在肝損傷保護作用方面,黃芩葉通過發(fā)揮其顯著的抗氧化功效,體現(xiàn)出與水飛薊賓同樣良好的治療作用。除此之外,對于醉酒和肝損傷指標的逆轉(zhuǎn)方面黃芩葉表現(xiàn)出一定的效果。而且針對于目前化學藥療效不明顯、不良反應多等問題,黃芩葉具有多成分、多靶點、多通路協(xié)調(diào)發(fā)揮藥效,毒副作用較小、安全性較高等優(yōu)勢,具有良好的研發(fā)潛力。

本研究發(fā)現(xiàn)SBLE對酒精誘導的小鼠共濟失調(diào)和認知記憶功能障礙具有一定的緩解作用,而且對于酒精所致小鼠的肝損傷有良好的保護作用。并通過初步探討其作用機制,發(fā)現(xiàn)SBLE可以提高ADH的活性從而加速乙醇在肝內(nèi)代謝,同時也減輕了乙醇對肝細胞的氧化損傷。這為黃芩葉新食品原料的研發(fā)提供一定的研究基礎(chǔ),同時為黃芩葉的資源開發(fā)利用提供一定的思路。