何曉旭，劉克明，汪笑宇，郝爽，賈磊，邵蓬，羅璋*

(1.天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津 300384；2.天津市水產(chǎn)研究所，天津 300221)

半滑舌鰨CynoglossussemilaevisGünther隸屬于鰈形目Pleuronectiformes舌鰨科Cynoglossidae舌鰨屬Cynoglossus，是一種暖溫性近海底層魚(yú)類(lèi)，其味道鮮美、肉質(zhì)細(xì)嫩、營(yíng)養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者青睞。隨著人們生活水平的提高，對(duì)半滑舌鰨的需求量不斷增大，推動(dòng)了半滑舌鰨養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展。目前，半滑舌鰨已成為中國(guó)北方沿海地區(qū)重要的海水工廠化養(yǎng)殖品種，2018年產(chǎn)量達(dá)1.2萬(wàn)t[1]。但是，隨著養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大，病害也日趨嚴(yán)重，病害已經(jīng)成為半滑舌鰨養(yǎng)殖業(yè)的重大威脅。多種細(xì)菌性病原，包括溶藻弧菌[2]、哈維氏弧菌[3]、海藻希瓦氏菌[4]、海分枝桿菌[5]、美人魚(yú)發(fā)光桿菌[6-7]等被報(bào)道。此外，也發(fā)現(xiàn)了病毒性病原[8]。

2020年9月，天津市濱海新區(qū)某半滑舌鰨養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生病害，發(fā)病速度慢，發(fā)病20 d后累計(jì)死亡率為15%?；疾◆~(yú)表現(xiàn)除反應(yīng)遲鈍、離群獨(dú)游外，顯著的特征為脫肛，腸套疊。為了探明其病因，從患病魚(yú)腎臟分離到一株疑似病原，本研究中采用組織病理學(xué)、生理生化反應(yīng)及分子生物學(xué)等方法對(duì)病原進(jìn)行了鑒定，并篩選出敏感性藥物，這是半滑舌鰨腸套疊癥狀的首次報(bào)道，以期為今后該病的有效防控提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)魚(yú)：體長(zhǎng)10～15 cm的患病半滑舌鰨從天津市濱海新區(qū)的某海水養(yǎng)殖場(chǎng)收集，將瀕死的魚(yú)裝入氧氣袋后被快速送往實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行診斷和病原分離；體長(zhǎng)8～10 cm的健康半滑舌鰨由天津市天世農(nóng)海水養(yǎng)殖有限公司提供，無(wú)發(fā)病史。

主要試劑：腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司，藥敏紙片購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司，DNA分子Marker和2×Taq Master Mix購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病原的分離 用75%乙醇(體積分?jǐn)?shù)，下同)棉球反復(fù)擦拭病魚(yú)體表后，在無(wú)菌操作臺(tái)中對(duì)病魚(yú)進(jìn)行解剖，用接種環(huán)分別從患病魚(yú)的腎和脾中取少量樣品劃線接種于腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)和血平板，于28 ℃下培育48 h后進(jìn)行觀察，選取優(yōu)勢(shì)菌的單菌落進(jìn)一步劃線純化，得到優(yōu)勢(shì)菌株并命名為ST-2020-2。取患病魚(yú)的鰭條、鰓、黏液等樣品在顯微鏡下進(jìn)行寄生蟲(chóng)檢查。

1.2.2 組織病理切片觀察 取患病魚(yú)腸、肝、腎、脾等組織，用中性甲醛固定，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，切成5 μm厚度，然后進(jìn)行蘇木精伊紅染色(H.E)，同時(shí)取正常魚(yú)組織作為對(duì)照。

1.2.3 人工感染試驗(yàn) 將菌株ST-2020-2劃線接種于BHI平板，于28 ℃下培養(yǎng)24 h后，挑取單菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基中。28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后，以6 000g離心10 min后收集細(xì)菌，利用無(wú)菌PBS將細(xì)菌濃度調(diào)整至1.2×107cfu/mL。將60尾健康的半滑舌鰨隨機(jī)分為2組(每組30尾)，試驗(yàn)組每尾魚(yú)腹腔注射0.1 mL 菌懸液，對(duì)照組每尾魚(yú)注射0.1 mL無(wú)菌PBS。試驗(yàn)魚(yú)在22 ℃循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中養(yǎng)殖14 d，每天觀察試驗(yàn)魚(yú)的發(fā)病和死亡情況，統(tǒng)計(jì)死亡數(shù)，瀕死的魚(yú)進(jìn)行病原菌分離和鑒定。

1.2.4 病原的生理生化特性測(cè)試 將菌株ST-2020-2接種于BHI和血平板進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，按照東秀珠等[9]的方法對(duì)分離菌株進(jìn)行生理生化測(cè)試，包括革蘭氏染色、運(yùn)動(dòng)性、37 ℃生長(zhǎng)、溶血性、氧化酶反應(yīng)和葡萄糖發(fā)酵等。

1.2.5 病原的16S rDNA序列分析 利用引物(27F)5′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3′和(1492R)5′TACGGCTACCTTGTTACGCTT 3′對(duì)菌株ST-2020-2的16S rRNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增[10]。PCR反應(yīng)程序：95 ℃下預(yù)變性6 min；94 ℃下變性1 min，52 ℃下復(fù)性1 min，72 ℃下延伸2 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃下溫育6 min。擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中已登錄GenBank的基因片段進(jìn)行同源性比較，并利用MEGA 4.1 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.6 藥物敏感性試驗(yàn) 采用K-B藥敏紙片法測(cè)定菌株ST-2020-2的藥物敏感性[11]。將0.1 mL 108cfu/mL ST-2020-2菌懸液涂布于BHI平板，然后將氨芐西林(10 μg)、鏈霉素(10 μg)、四環(huán)素(30 μg)等16種藥敏紙片黏貼在平板上，28 ℃下培養(yǎng)18～24 h后測(cè)定抑菌圈直徑,按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)判定對(duì)藥物的敏感度。

2 結(jié)果與分析

2.1 自然發(fā)病魚(yú)癥狀

患病魚(yú)主要癥狀表現(xiàn)為食欲下降、游泳異常，離群后游至水體表層，對(duì)外界反應(yīng)遲鈍。體表黏液增多，鰭條充血，腹部膨脹，脫肛(圖1A)，腹腔內(nèi)有大量積水，部分魚(yú)腸道充血(圖1B)，腸道套疊明顯(圖1C)，10尾患病魚(yú)共檢查到8尾有腸套疊現(xiàn)象。

A—脫肛，鰭條基部出血；B—腸道充血；C—腸套疊。A—rectal prolapse and hyperemia at the base of the fins；B—hyperemia in intestinal tract；C—intussusception.圖1 患病半滑舌鰨的典型癥狀Fig.1 Typical symptom of half-smooth tongue sole with intussusception disease

2.2 病理分析

通過(guò)病理切片觀察發(fā)現(xiàn)，患病半滑舌鰨脾臟中部分細(xì)胞壞死，并出現(xiàn)大量空泡，此外，發(fā)現(xiàn)大量直徑約為30 μm的小型結(jié)節(jié)(圖2B)；腎臟中白細(xì)胞增多，腎小管上皮細(xì)胞壞死、解體(圖2D)；腸道肌肉層松弛，肌肉層和黏膜層中有大量的紅細(xì)胞聚集，腸絨毛和腸黏膜組織腐爛并脫落(圖2F)。

A—正常脾臟組織；B—患病脾臟，部分細(xì)胞壞死，出現(xiàn)大量空泡，含有大量小型結(jié)節(jié)(★所示)；C—正常腎臟組織；D—患病腎臟，白細(xì)胞增多，腎小管上皮細(xì)胞壞死、解體(★所示)；E—正常腸道組織；F—患病腸道，肌肉層和黏膜層中有大量的紅細(xì)胞聚集(★所示)，腸絨毛和腸黏膜組織腐爛脫落。A—normal spleen appearance;B—diseased spleen,showing numerous necrotic cells and abundant nodules (stars);C—normal kidney appearance;D—diseased kidney,showing vacuolar degeneration and necrosis of epithelial cells of renal tubule (stars);E—normal intestinal tract;F—diseased intestinal tract,showing intestinal villi and mucosal tissue largely rotted and separated from the lining of the intestine,and red blood cell accumulation in the muscle layer and mucous layer(stars).圖2 患病半滑舌鰨組織病理變化Fig.2 Histopathological changes of diseased half-smooth tongue sole

2.3 病原的分離和鑒定

利用顯微鏡進(jìn)行寄生蟲(chóng)檢測(cè)，除體表黏液和鰓絲有少量纖毛蟲(chóng)外，其他部位未檢測(cè)到寄生蟲(chóng)。從腎臟中分離到一株細(xì)菌，將其命名為ST-2020-2。將該菌在BHI平板上28 ℃下培養(yǎng)48 h后，菌落呈圓形、濕潤(rùn)、扁平、光滑、淡黃色、不透明、邊緣整齊，菌落直徑為1.5～2.0 mm，在TCBS培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)。

通過(guò)生理生化試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，菌株ST-2020-2為革蘭氏陰性桿菌，無(wú)運(yùn)動(dòng)性，不溶血，37 ℃不生長(zhǎng)，氧化酶和VP反應(yīng)陽(yáng)性，能利用葡萄糖，不能利用蔗糖、阿拉伯糖、鼠李糖、甘露醇、蜜二糖(表1)。

PCR擴(kuò)增獲得菌株ST-2020-2的16S rDNA序列，片段大小約1 500 bp，在NCBI的登錄號(hào)為(MW850501)。利用NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)分析，結(jié)果表明，該菌株與Photobacteriumdamselaesubsp.piscicidaPN510(登錄號(hào)AY147860)和Photobacteriumdamselaesubsp.piscicidaCVD1(登錄號(hào)AY147856)菌株的一致性均為100%。將該菌與GenBank中相近種16S rDNA基因進(jìn)行匹配排列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果表明,菌株ST-2020-2先與美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種聚成一支，然后與美人魚(yú)發(fā)光桿菌美人魚(yú)亞種聚為一大支(圖3)。結(jié)合生理生化特征和分子生物學(xué)分析，將ST-2020-2鑒定為美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種Photobacteriumdamselaesubsp.piscicida。

圖3 基于鄰接法構(gòu)建的不同物種16S rDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of the 16S rDNA sequences in different species based on Neighbor-joining method

2.4 人工感染試驗(yàn)

從人工感染后的第3天開(kāi)始，半滑舌鰨開(kāi)始出現(xiàn)死亡，至第14天時(shí)，試驗(yàn)組半滑舌鰨的累計(jì)死亡率為90%，對(duì)照組在第2天時(shí)有1尾死亡，可能是人為操作不慎造成，累計(jì)死亡率為3.33%(圖4)。死亡魚(yú)的主要癥狀為腹部膨脹，腹水。從瀕死半滑舌鰨腎臟和脾臟分離細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)菌落形態(tài)單一，隨機(jī)挑取單菌落進(jìn)行純化，命名為ST-2020-3，其生理生化反應(yīng)結(jié)果與菌株ST-2020-2完全一致(表1)。

圖4 人工感染半滑舌鰨的累計(jì)死亡率Fig.4 Cumulative mortalities of experimentally infected half-smooth tongue sole

表1 菌株ST-2020-2和ST-2020-3的生理生化反應(yīng)結(jié)果Tab.1 Physiological and biochemical identification of isolated strains ST-2020-2 and ST-2020-3

2.5 藥物敏感性試驗(yàn)

菌株ST-2020-2的藥敏試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，在測(cè)定的16種抗生素中，菌株ST-2020-2除了對(duì)鏈霉素、環(huán)丙沙星和氟苯尼考敏感外，對(duì)四環(huán)素、卡那霉素、氨芐西林中度敏感，對(duì)新霉素、多黏菌素、復(fù)方新諾明等10種藥物具有耐藥性。

表2 菌株ST-2020-2對(duì)16種抗生素的敏感性分析Tab.2 Sensitivity of strain ST-2020-2 to 16 kinds of antibiotics

3 討論

3.1 美人魚(yú)發(fā)光桿菌的致病性

美人魚(yú)發(fā)光桿菌包括美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種Photobacteriumdamselaesubsp.piscicida和美人魚(yú)發(fā)光桿菌美人魚(yú)亞種Photobacteriumdamselaesubsp.damselae兩個(gè)亞種，美人魚(yú)亞種以前被稱(chēng)為美人魚(yú)弧菌，具有弧菌的部分特性，37 ℃能生長(zhǎng)，能感染多種海洋魚(yú)類(lèi)和人類(lèi)，引起人類(lèi)傷口感染和壞死性筋膜炎[11-13]。殺魚(yú)亞種曾被稱(chēng)為殺魚(yú)巴斯德氏菌Pasteurellapiscicida，37 ℃不能生長(zhǎng)，故對(duì)人沒(méi)有致病性[14]，是魚(yú)類(lèi)巴斯德氏菌病亦稱(chēng)類(lèi)結(jié)節(jié)癥的病原，對(duì)多種養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)有高致病性，鰤Seriolaquinqueradiata[15]、大黃魚(yú)Pseudosciaenacrocea[16]、龍膽石斑魚(yú)Epinepheluslanceolatus[17]、金頭鯛Sparusaurata[18]、軍曹魚(yú)Rachycentroncanadum[19]、卵形鯧鲹Trachinotusovatus[20]、豹紋鰓棘鱸Plectropomusleopardus[21]、大菱鲆Scophthalmusmaximus[22]和半滑舌鰨[6]等海水魚(yú)類(lèi)都能被其感染。美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種因宿主范圍廣、死亡率高而被認(rèn)為是世界范圍內(nèi)海水養(yǎng)殖中最具威脅性的細(xì)菌性病原之一，給歐洲、美國(guó)、日本和中國(guó)等國(guó)家和地區(qū)的海水養(yǎng)殖業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失[23]。

本試驗(yàn)中，從患病半滑舌鰨腎臟中分離到大量菌落形態(tài)一致的細(xì)菌，通過(guò)生理生化反應(yīng)和分子生物學(xué)分析，將分離菌株ST-2020-2鑒定為美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種。通過(guò)回感試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該菌株能引起半滑舌鰨發(fā)病并導(dǎo)致90%的死亡率，這說(shuō)明菌株具有較強(qiáng)的致病性，是導(dǎo)致半滑舌鰨套腸癥病害的病原。研究表明，美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種攜帶溶血素基因，能分泌溶血素，在血平板中呈現(xiàn)α或β溶血[20-21]。溶血素可以溶解動(dòng)物血液中的紅細(xì)胞，從而對(duì)動(dòng)物組織造成損傷，是細(xì)菌的主要毒力因子之一。本試驗(yàn)中分離的菌株ST-2020-2雖不具備溶血性，但同樣能導(dǎo)致半滑舌鰨的發(fā)病和死亡，這表明美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種還存在其他重要的致病因子。此外，本研究中分離到的無(wú)溶血性的美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種是否代表一種新的血清型還有待進(jìn)一步研究，這為今后該菌血清型的分析提供了材料。

本研究中，通過(guò)回感試驗(yàn)證明了分離菌株ST-2020-2的致病性，但在被人工感染的半滑舌鰨中未能觀察到腸套疊現(xiàn)象，腸套疊是指動(dòng)物的部分腸管及腸系膜套入鄰近腸腔所致的一種絞窄性腸梗阻，并導(dǎo)致腸內(nèi)容物通過(guò)障礙。嬰幼兒和豬、犬、羊等的腸套疊是一種比較常見(jiàn)的病癥[24-27]。該癥狀在魚(yú)類(lèi)中較為少見(jiàn)，目前，僅見(jiàn)于斑點(diǎn)叉尾鮰和羅非魚(yú)發(fā)生腸套疊的報(bào)道，并從這兩種患病魚(yú)體內(nèi)分離到嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonasmaltophilia[28]、遲緩愛(ài)德華氏菌Edwardsiellaictaluri[29]、嗜水氣單胞菌Aeromonashydrophila[30-31]、溫和氣單胞菌Aeromonassobria[32]、熒光假單胞菌Pseudomonasfluoresces[33]和海豚鏈球菌Streptococcusiniae[34]等病原菌，這些細(xì)菌都是魚(yú)類(lèi)的常見(jiàn)病原，在人工感染試驗(yàn)中都能導(dǎo)致斑點(diǎn)叉尾鮰或羅非魚(yú)發(fā)生病害和死亡，但在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)都很難復(fù)制出典型的腸套疊癥狀，本試驗(yàn)中的結(jié)果與之類(lèi)似。這可能是由于魚(yú)類(lèi)產(chǎn)生腸套疊癥狀是一個(gè)復(fù)雜的機(jī)理過(guò)程，需要多種因素共同發(fā)揮作用。此外，也有學(xué)者提出，也可能是先發(fā)生腸套疊現(xiàn)象然后才造成細(xì)菌感染[33]，由于某些原因造成魚(yú)類(lèi)腸道血流減少后，容易對(duì)腸道黏膜造成損傷，從而引起腸道蛋白酶類(lèi)參與的腸黏膜自溶，導(dǎo)致腸道不規(guī)則收縮、套疊、斷裂等現(xiàn)象，為繼發(fā)感染創(chuàng)造了條件[35]。因此，這些病原菌與腸套疊癥狀發(fā)生的因果關(guān)系還需要進(jìn)一步研究。

3.2 美人魚(yú)發(fā)光桿菌病害的控制

研究表明，患病魚(yú)腎臟和脾臟中產(chǎn)生肉眼可見(jiàn)的白色結(jié)節(jié)是感染美人魚(yú)發(fā)光桿菌的典型癥狀[15-16,20-21]。本試驗(yàn)中，在患病半滑舌鰨體內(nèi)并未觀察到此現(xiàn)象，通過(guò)組織病理切片，在脾臟中觀察到直徑約30 μm 的小結(jié)節(jié)，這可能與脾和腎出現(xiàn)白色結(jié)節(jié)是個(gè)緩慢的感染過(guò)程相關(guān)，隨著病害的持續(xù)，小結(jié)節(jié)之間會(huì)逐漸融合形成大結(jié)節(jié)[5]，由此推測(cè)，患病魚(yú)還處于發(fā)病初期。由于內(nèi)臟結(jié)節(jié)的形成使藥物難以滲透，從而加大了藥物治療的難度，有學(xué)者提出在尚未形成結(jié)節(jié)前，通過(guò)殺菌抑菌進(jìn)行預(yù)防是最為有效的措施[36]，因此，在發(fā)病初期分離病原菌并開(kāi)展藥物敏感性試驗(yàn)十分必要。本試驗(yàn)中，通過(guò)藥物敏感性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在測(cè)定的16種藥物中，分離菌株ST-2020-2對(duì)13種藥物呈現(xiàn)耐藥或中度耐藥。鄧益琴等[37]檢測(cè)了35株從海水魚(yú)中分離的美人魚(yú)發(fā)光桿菌對(duì)15種抗生素的敏感性,結(jié)果顯示，35株菌表現(xiàn)出27種耐藥譜，多重耐藥率(菌株耐抗生素種類(lèi)>3)達(dá)到60%。這可能與水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中大量使用和濫用這些抗生素有關(guān)。為了減少抗生素的使用，應(yīng)采用其他的控制手段，更多地關(guān)注疫苗的使用。

綜上所述，本研究中首次報(bào)道了半滑舌鰨套腸癥，從患病魚(yú)體內(nèi)分離出疑似病原，經(jīng)鑒定為美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種，通過(guò)藥敏試驗(yàn)篩選了敏感藥物，為該病的防治提供了技術(shù)支撐。

4 結(jié)論

1)從患套腸癥半滑舌鰨體內(nèi)分離疑似病原，綜合生理生化特征和16S rDNA基因序列分析將其鑒定為美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種，該分離菌株能引起健康半滑舌鰨發(fā)病，致死率為90%，說(shuō)明美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種是導(dǎo)致半滑舌鰨套腸癥病害的病原。

2)分離菌株美人魚(yú)發(fā)光桿菌殺魚(yú)亞種對(duì)鏈霉素、環(huán)丙沙星、氟苯尼考敏感，對(duì)四環(huán)素、卡那霉素、氨芐西林中度敏感，對(duì)新霉素、多黏菌素、復(fù)方新諾明等10種藥物具有耐藥性，說(shuō)明分離菌株具有多重耐藥。今后應(yīng)采取多種防控措施，為魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供技術(shù)支撐。