汪倩，翟萬營，韓爽，朱新鵬，涂翰卿，陳良標*

(1.上海海洋大學 水產(chǎn)種質(zhì)資源發(fā)掘與利用教育部重點實驗室，上海 201306；2.上海海洋大學 海洋生物科學國際聯(lián)合研究中心，上海 201306；3.江蘇中洋集團股份有限公司，江蘇 海安 226600)

魚類是水生變溫動物，溫度變化對其生理和行為有著深遠的影響[1-2]。低溫會導致細胞的結(jié)構(gòu)、功能、脂質(zhì)代謝，以及蛋白質(zhì)的折疊、組裝和穩(wěn)定性發(fā)生改變[3]。當溫度低于魚類最適生存溫度時，魚類新陳代謝速度減慢，導致其捕食、躲避敵害等能力降低；而溫度急劇下降(如寒潮)或出現(xiàn)極端低溫時，可能導致魚類行為紊亂、側(cè)翻或昏迷[4-5]。近年來，寒潮給中國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟損失，其過境后，最低氣溫可能會下降到4 ℃以下，引起水溫水質(zhì)的劇烈變化，導致中國南方魚類養(yǎng)殖大面積死亡現(xiàn)象的發(fā)生[6-7]。同時，極端低溫不僅會導致魚類出現(xiàn)嚴重凍傷、凍死現(xiàn)象，還會誘發(fā)魚類感染水霉、寄生蟲并暴發(fā)魚類流行病[8-9]。研究發(fā)現(xiàn)，牙鲆Paralichthysolivaceus在低溫條件下更易感染病毒性出血敗血癥病毒，死亡率顯著升高[10]。此外，溫度變化還會改變魚類的棲息和產(chǎn)卵區(qū)域，對食物網(wǎng)和漁業(yè)產(chǎn)量造成嚴重影響[11-12]。

低溫也會影響魚類腸道微生物群落結(jié)構(gòu)。Hagi等[13]研究發(fā)現(xiàn)，魚類腸道內(nèi)乳酸菌的豐度與水溫緊密相關(guān)，在夏季(水溫大于20 ℃)，乳酸乳球菌Lactococcuslactis豐度較大，而在冬季(4～10 ℃)，棉子糖乳球菌Lactococcusraffinolactis占優(yōu)勢。溫度的劇烈變化會加劇魚類腸道微生物群落中病原菌和非病原菌間的競爭，破壞腸道微生物菌群的平衡[14]。當溫度從26 ℃急劇下降到18 ℃時，羅非魚Oreochromsmossambcus腸道內(nèi)弧菌Vibriospp.的豐度顯著增加，黃桿菌Flavobacterium的豐度則顯著降低，腸道微生物可以通過促進能量需求的調(diào)節(jié)，提高宿主對低溫的適應(yīng)[15-16]。魚類作為變溫動物，其體溫通常受水溫影響，一些魚類相對更能耐受寒冷的環(huán)境，但目前尚不清楚其腸道微生物是否也會受到低溫脅迫的影響。

河鲀是中國重要的淡水養(yǎng)殖魚類，在2018年，中國淡水養(yǎng)殖的河鲀已達到1.271 萬t，其中暗紋東方鲀Takifugufasciatus養(yǎng)殖量較大[17-18]。中國暗紋東方鲀養(yǎng)殖主要分布于南方，大部分集中在廣東、江蘇、安徽等地[19]。目前，中國河鲀養(yǎng)殖過程中，工廠化養(yǎng)殖能維持河鲀冬季生長，但成本高、發(fā)病率高，而成本低、效益好的土地養(yǎng)殖和網(wǎng)箱養(yǎng)殖卻無法維持河鲀越冬，因此，培育良好耐寒特性的河鲀品種成為中國河鲀養(yǎng)殖的關(guān)鍵因素[19]。

本研究中，以江蘇中洋集團南通和廣州養(yǎng)殖基地采集的暗紋東方鲀?yōu)檠芯繉ο?，比較了兩個品系在不同程度低溫脅迫下腸道微生物群落組成的差異，以探究低溫脅迫對不同品系暗紋東方鲀腸道微生物的影響，以期為解析這些腸道微生物對宿主適應(yīng)耐寒(低溫)機制提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用耐寒型和野生型暗紋東方鲀分別取自江蘇中洋集團南通龍洋水產(chǎn)有限公司養(yǎng)殖基地和中洋漁業(yè)發(fā)展(廣東)有限公司養(yǎng)殖基地，耐寒型暗紋東方鲀是由江蘇中洋集團培育的具有穩(wěn)定遺傳耐寒性狀的品系“中洋1號”(“Zhongyang No.1”)暗紋東方鲀(以下簡稱“中洋1號”)，該品系在水溫7 ℃時也能穩(wěn)定存活，最低耐受溫度可以低至5 ℃，養(yǎng)殖水溫為24 ℃；廣州養(yǎng)殖基地所飼養(yǎng)的為不耐寒的野生型暗紋東方鲀(以下簡稱“野生型鲀”)，養(yǎng)殖水溫為26 ℃。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計 分別從兩個養(yǎng)殖基地各取20尾體質(zhì)量為300 g左右的暗紋東方鲀，將從養(yǎng)殖基地取回的暗紋東方鲀放在24 ℃培養(yǎng)箱(恒溫恒濕箱 HWS-1000，寧波江南儀器廠 )中適應(yīng)5 d，從每個品系中各取3尾以上暗紋東方鲀進行解剖，提取腸道內(nèi)容物；從第6天開始，以0.5 ℃/h的速度降溫，直至降至4 ℃，其中，分別在17、10 ℃下各維持6 h，并分別在17、10、4 ℃時，提取腸道微生物樣品，其中，野生型鲀溫度試驗組分別記為WT_24、WT_17、WT_10和WT_4，“中洋1號”溫度試驗組分別記為ZY_24、ZY_17、ZY_10和ZY_4。具體試驗設(shè)計如圖1所示。

圖1 低溫處理示意圖及取樣時間點Fig.1 Schematic diagram of cold treatment and the sampling time

1.2.2 腸道微生物的提取 使用FastDNA SPIN Kit for Feces(MP Biomedical)試劑盒，按照說明書對暗紋東方鲀腸道內(nèi)容物的微生物群落進行細菌總DNA提取。設(shè)計16S rDNA引物進行PCR擴增，其上、下游引物序列分別為338F(5′ACTCCTACGGGAGGCAGCA 3′)和806R (5′GGACTACHVGGGTWTCTAAT 3′)，其由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系(共20 μL)：模板DNA 2 μL，上、下游引物各1 μL，2×Taq PCR Mix 10 μL，ddH2O 6 μL。PCR擴增程序：95 ℃下預變性5 min；95 ℃下變性30 s，55 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸30 s，共進行29個循環(huán)；最后在72 ℃下再穩(wěn)定延伸10 min。將提取的DNA送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行高通量測序。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和生物信息學分析

在97%的相似水平下，使用Uparse 7.1軟件對所有序列進行OTU聚類，并進行生物信息學分析。每個采樣時間點選3個重復性一致的樣品，對所有測序數(shù)據(jù)過濾后進行抽平歸一化處理，統(tǒng)計相對應(yīng)的OTUs，繪制稀釋曲線(rarefaction curve)。為比較不同品系及不同溫度處理的暗紋東方鲀腸道微生物差異，根據(jù)其共有和獨有的OTUs分別繪制Venn圖。

使用Mothur 1.30.1計算不同溫度處理的兩個品系暗紋東方鲀腸道微生物Alpha多樣性指數(shù)(Chao1、Shannon和Simpson)，并通過t-test比較兩個品系在不同溫度下的微生物群落豐富度和多樣性差異，計算結(jié)果以平均值±標準差表示。

采用RDP Classifier貝葉斯算法對OTU代表序列進行分類學分析，分別在門和屬水平上比較兩個品系的暗紋東方鲀腸道微生物差異，在屬水平上比較不同溫度處理的暗紋東方鲀腸道微生物豐度變化。在屬水平上，通過主成分分析(PCA)和非度量多維尺度分析(NMDS)比較兩個品系暗紋東方鲀腸道菌群的組成差異。

基于蛋白質(zhì)直系同源簇(COG)數(shù)據(jù)庫對兩個品系的暗紋東方鲀腸道微生物進行PICRUSt1功能預測。所有的生物信息學分析都通過上海美吉生物云(cloud.majorbio.com)在線平臺進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀釋曲線

對測序數(shù)據(jù)進行抽平分析，“中洋1號”和野生型鲀腸道微生物的稀釋曲線趨于平緩，說明測序數(shù)據(jù)量滿足后續(xù)生物信息學分析(圖2)。

圖2 野生型(WT)和“中洋1號”(ZY)暗紋東方鲀腸道微生物樣品測序稀釋曲線Fig.2 Rarefaction curves of gut microbiome sequencing of wild-type(WT)and “Zhongyang No.1”(ZY)obscure puffer Takifugu fasciatus

2.2 微生物物種多樣性

從整體上看，野生型鲀腸道微生物OTUs數(shù)目多于“中洋1號”(分別為322和311)。不同溫度處理的野生型和“中洋1號”暗紋東方鲀腸道微生物共有28個OTUs，隨溫度降低，野生型鲀腸道微生物OTUs數(shù)目逐漸增多，而“中洋1號”腸道微生物OTUs數(shù)目則呈先增加后減少的趨勢(圖3)。在24、10、4 ℃下，野生型鲀腸道微生物OTUs數(shù)目(分別為139、163、170)多于“中洋1號”(分別為125、150、122)，而在17 ℃時，“中洋1號”腸道微生物OTUs數(shù)目(170)則多于野生型鲀(157)。

圖3 野生型鲀和“中洋1號”腸道微生物群落組成Venn圖(OTU水平)Fig.3 Venn diagram of gut microbiome community of wild-type and “Zhongyang No.1”obscure puffer Takifugu fasciatus (OTU level)

2.3 Alpha多樣性

對不同程度低溫應(yīng)激處理的“中洋1號”和野生型鲀腸道微生物進行Alpha多樣性分析，結(jié)果顯示，覆蓋率(coverage)均超過99.9%，其中，Chao1、Simpson和Shannon指數(shù)在每個溫度下均表現(xiàn)出相同的變化趨勢(表1)。Chao1指數(shù)顯示：在每個溫度下，野生型鲀的Chao1指數(shù)均高于“中洋1號”，但無顯著性差異(P>0.05)；隨著溫度降低，兩個品系的腸道微生物Chao1指數(shù)變化不大，但溫度從24 ℃降至17 ℃時，野生型鲀的微生物豐富度略有升高，而在“中洋1號”中，溫度從17 ℃降至4 ℃過程中，腸道微生物豐富度呈降低趨勢(表1)。

Simpson和Shannon指數(shù)顯示：在每個處理溫度下野生型鲀Simpson指數(shù)均低于“中洋1號”，而Shannon指數(shù)則相反；隨著溫度降低，“中洋1號”腸道微生物的Simpson和Shannon指數(shù)總體上均無顯著性變化(P>0.05)，而在17 ℃時，與24 ℃相比，野生型鲀腸道微生物的Simpson指數(shù)顯著性降低(P<0.05)，Shannon指數(shù)顯著性升高(P<0.05)(表1)。

表1 野生型和“中洋1號”暗紋東方鲀腸道微生物的Alpha多樣性指數(shù)Tab.1 Alpha diversity index of gut microbiome of wild-type and “Zhongyang No.1”obscure puffer Takifugu fasciatus

2.4 微生物群落組成分析

總體上看，兩個品系的暗紋東方鲀腸道微生物群落中主要細菌組成相似，但不同細菌間豐度差異較大。從圖4可見：在門水平上，暗紋東方鲀腸道微生物主要優(yōu)勢細菌門包括變形菌門Proteobacteria、Campilobacterota、擬桿菌門Bacteroidota和螺旋體門Spirochaetota，“中洋1號”腸道微生物中變形菌門豐度顯著低于野生型鲀；在屬水平上，野生型鲀腸道中主要為希瓦氏菌屬Shewanella(28.14%)、弓形桿菌norank_f_Arcobacteraceae(13.95%)、伊麗莎白金菌屬Elizabethkingia(12.71%)、螺旋體屬Brevinema(10.06%)、假單胞菌屬Pseudomonas(7.65%)、氣單孢菌屬Aeromonas(5.10%)和弧菌屬Vibrio(3.98%)，而在“中洋1號”腸道微生物中，主要為弓形桿菌(43.33%)、希瓦氏菌屬(10.56%)、螺旋體屬(14.09%)、伊麗莎白金菌屬(11.40%)和氣單胞菌屬(4.77%)，“中洋1號”腸道微生物中與暗紋東方鲀毒素相關(guān)的細菌(如嗜水氣單胞菌Aeromonashydrophila、霍亂弧菌Vibriocholera)等豐度顯著低于野生型鲀。

不同程度的低溫脅迫對兩個品系暗紋東方鲀腸道微生物具有重要影響。從圖5可見：在不同溫度下，野生型鲀腸道微生物群落中希瓦氏菌屬豐度均始終大于“中洋1號”，而弓形桿菌豐度均小于“中洋1號”；在24 ℃和17 ℃時，野生型鲀腸道內(nèi)伊麗莎白金菌屬豐度大于“中洋1號”，當溫度降低至4 ℃時，其豐度則小于“中洋1號”；在24、17、10 ℃時，“中洋1號”腸道內(nèi)螺旋體屬豐度均大于野生型鲀，但當溫度降低至4 ℃時，其豐度則小于野生型鲀。

不同處理間的差異0.01

圖5 野生型和“中洋1號”暗紋東方鲀腸道微生物屬水平群落組成Fig.5 Community composition of gut microbiome of wild-type and “Zhongyang No.1”obscure puffer Takifugu fasciatus on genus level

對兩個品系暗紋東方鲀腸道微生物進行主成分分析(PCA)，結(jié)果顯示，主成分PC1、PC2方差貢獻率分別為62.52%、13.17%，“中洋1號”腸道微生物樣品間距離較近，呈明顯聚類，而野生型鲀腸道微生物呈無規(guī)律分布(圖6(a))。同時,采用非度量多維尺度分析(NMDS)對PCA分析結(jié)果進行驗證，也顯示相似的結(jié)果，“中洋1號”腸道微生物聚為一簇，野生型鲀腸道微生物呈無規(guī)律分布(圖6(b))。

圖6 基于屬水平的主成分分析和非度量多維尺度分析Fig.6 Principal component analysis and non-metric multidimensional scaling analysis on genus level

2.5 腸道微生物功能預測

基于腸道微生物測序結(jié)果和COG數(shù)據(jù)庫對兩個品系的腸道微生物進行PICRUSt1功能預測。結(jié)果顯示：在兩個品系的暗紋東方鲀中，具有氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝(amino acid transport and metabolism)、轉(zhuǎn)錄(transcription)、無機離子轉(zhuǎn)運與代謝(inorganic ion transport and metabolism)等功能占比較高；此外，與野生型鲀相比，“中洋1號”腸道中，具有碳水化合物運輸與代謝(carbohydrate transport and metabolism)、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運與代謝(lipid transport and metabolism)等12個功能豐度增加(圖7)。

3 討論

3.1 兩個品系暗紋東方鲀腸道微生物的多樣性

宿主對腸道微生物組成有顯著性影響，不同種魚的腸道微生物群落組成和結(jié)構(gòu)不同，而在同一種魚中，腸道微生物也會隨著攝食條件、環(huán)境條件(溫度、pH、環(huán)境污染等)的改變而發(fā)生變化[20]。此外，即使在相同環(huán)境中，同一種魚的腸道微生物也有可能因為營養(yǎng)狀態(tài)、發(fā)育階段的不同而有所差異[21-22]。本研究中，野生型鲀腸道微生物OTUs顯著高于“中洋1號”，這可能與其養(yǎng)殖環(huán)境水溫較高、腸道微生物更豐富有關(guān)[23]。Erwin等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在海綿中，其微生物群落呈現(xiàn)明顯的季節(jié)性變化，在夏季水溫較高時，微生物多樣性增加，而在秋、冬季，微生物多樣性則降低。本研究中，在24、17、10 ℃時，“中洋1號”腸道微生物群落的Shannon指數(shù)均低于野生型，其Chao1指數(shù)也較低。本研究結(jié)果與Erwin等[23]的研究結(jié)果一致。

圖例中不同字母代表不同COG功能。Different letters in the legend represent different COG functions.圖7 野生型和“中洋1號”暗紋東方鲀腸道微生物功能預測Fig.7 Functional prediction of gut microbiome of wild-type and “Zhongyang No.1”obscure puffer Takifugu fasciatus

魚類腸道微生物群落結(jié)構(gòu)也會受到溫度的影響。本研究中，PCA和NMDS分析結(jié)果表明，在較低溫度環(huán)境中生長的“中洋1號”腸道微生物樣品差異較小，而野生型鲀腸道微生物群落結(jié)構(gòu)組成差異較大，低溫可能是導致微生物群落結(jié)構(gòu)更為相似的主要原因[23-24]。Zarkasi等[24]研究發(fā)現(xiàn)，溫度升高導致大西洋鮭Salmosalar腸道微生物群落差異變大，多樣性更為豐富。Kokou等[25]研究表明，在低溫條件下，耐寒羅非魚與不耐寒羅非魚腸道微生物群落組成趨于一致。而Al-Harbi等[26]也發(fā)現(xiàn)，在夏、秋、冬3個季節(jié)中，雜交羅非魚Oreochromisniloticus×O.aureus腸道內(nèi)微生物組成在不同季節(jié)差別較大。這些結(jié)果表明，低溫對魚的腸道微生物可能具有較強的選擇性，對微生物群落可能存在潛在的限制，從而降低其多樣性[27]。

3.2 兩個品系暗紋東方鲀腸道微生物豐度及功能

本研究表明，兩個品系的暗紋東方鲀腸道微生物群落中的細菌組成相似，但其豐度不同。與野生型鲀相比，“中洋1號”腸道微生物中希瓦氏菌屬、伊麗莎白金菌屬、假單胞菌屬、氣單孢菌屬和弧菌屬豐度降低，而一些在低溫下生長的細菌，如弓形桿菌豐度升高，這可能是在相對低溫環(huán)境下長期馴化形成的[28-30]，Van Driessche等[31]研究表明，弓形桿菌在4 ℃時也能保持較長時間的活性，其在魚類腸道中可能對促進“中洋1號”的低溫耐受能力有一定貢獻。Kokou等[25]研究發(fā)現(xiàn)，在耐寒型羅非魚中，弧菌目Vibrionales和交替單胞菌目Alteromonadales等變形菌門細菌在低溫脅迫下豐度會升高。這可能與耐寒型羅非魚在低溫下其生理功能變化及種間差異有關(guān)[32]。魚類受到低溫脅迫時，腸道微生物作為魚類特殊的功能性器官，其微生物組成的這些變化可能有助于魚類適應(yīng)低溫。

此外，河鲀作為一種特殊的魚類，其體內(nèi)含有河鲀毒素，這與其腸道微生物的組成有一定關(guān)系[33-34]。在人工馴化和養(yǎng)殖期間，可以通過人為控制水源和飼料控制河鲀體內(nèi)產(chǎn)河鲀毒素的細菌(如嗜水氣單胞菌、霍亂弧菌等)產(chǎn)生[35-36]。溫度變化會影響河豚毒素相關(guān)微生物的生長，從而影響河鲀毒素在河鲀體內(nèi)的積累、代謝等過程。Ji等[37]研究發(fā)現(xiàn)，河鲀體內(nèi)的河鲀毒素會隨水溫變化，在水溫較高時(5—7月)，其體內(nèi)河鲀毒素含量較高，而隨著水溫降低，河豚毒素含量也隨之降低。同時，產(chǎn)河鲀毒素細菌(如溶藻弧菌Vibrioalginolyticus)在低溫時生長受限，河鲀毒素含量較低[38-39]。本研究中“中洋1號”在長期的低溫馴化下，其腸道內(nèi)微生物群落中與河鲀毒素相關(guān)的細菌(如希瓦氏菌屬、弧菌屬等)豐度可能會有所降低。

腸道微生物變化是一個長期與宿主和環(huán)境相互作用的過程，本研究中由于低溫脅迫時間短，腸道微生物群落組成可能不會發(fā)生大規(guī)模變化，后續(xù)將研究長期低溫脅迫對魚類腸道微生物的影響。

本研究結(jié)果有助于加深對魚類在低溫條件下腸道微生物結(jié)構(gòu)及功能變化的理解，對培育具有強勁耐寒能力的養(yǎng)殖品種及促進水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展具有重要意義。

4 結(jié)論

在本研究中，通過比較快速降溫后野生型(不耐寒)和長期低溫適應(yīng)(耐寒，“中洋1號”)的兩個品系的暗紋東方鲀腸道微生物群落組成變化，得出如下結(jié)論。

1)經(jīng)過長期低溫馴化，“中洋1號”腸道微生物多樣性顯著低于野生型暗紋東方鲀。隨著溫度降低，“中洋1號”腸道微生物的多樣性也呈現(xiàn)下降的趨勢，這表明，低溫對降低魚類腸道微生物群落多樣性組成有重要影響。

2)兩個品系的暗紋東方鲀腸道微生物組成相似，但豐度不同，腸道內(nèi)微生物的豐度會隨著溫度變化而改變。

3)“中洋1號”腸道中具有碳水化合物運輸與代謝、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運與代謝等功能的比例高于野生型鲀，這可能會有助于暗紋東方鲀對低溫的適應(yīng)。