衛(wèi)鵬，畢相東，戴偉，張達(dá)娟，李宛津，董少杰

(天津農(nóng)學(xué)院 水產(chǎn)學(xué)院，天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗室，天津 300384)

浮游植物是水生態(tài)系統(tǒng)中重要的初級生產(chǎn)者，直接影響著水域的生產(chǎn)性能，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中發(fā)揮著重要作用。浮游植物根據(jù)粒徑大小可以分為3種類型，即小型浮游植物(microphytoplankton，粒徑為20～200 μm)、微型浮游植物(nanophytoplankton，粒徑為3～20 μm)和超微型浮游植物(picophytoplankton，粒徑為0.2～3.0 μm)[1-2]。與小型和微型浮游植物相比，超微型浮游植物具有更小的營養(yǎng)吸收半飽和常數(shù)及更高的生長速率[3-4]，在水生生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量流動中發(fā)揮著重要作用[5-6]。超微型浮游植物作為微食物環(huán)的起點(diǎn)，被異養(yǎng)鞭毛蟲或纖毛蟲等原生動物攝食后進(jìn)入微食物環(huán)，再通過橈足類等后生浮游動物的捕食進(jìn)入經(jīng)典食物網(wǎng)，在較大程度上影響著漁業(yè)產(chǎn)量[7]。然而自20世紀(jì)70年代末被發(fā)現(xiàn)以來，有關(guān)超微型浮游植物的研究主要集中在海洋[8-9]、湖泊[3,5]和水庫[10]中，關(guān)于養(yǎng)殖水體中超微型浮游植物的研究較少，僅限于養(yǎng)殖海區(qū)中少量報道[11]，淡水養(yǎng)殖水體中超微型浮游植物研究仍處于空白狀態(tài)。

加州鱸Micropterussalmoides是中國主要的養(yǎng)殖魚類之一，具有適應(yīng)性強(qiáng)、生長快、肉質(zhì)鮮美且刺少等優(yōu)點(diǎn)。加州鱸養(yǎng)殖方式以池塘養(yǎng)殖為主，主要通過調(diào)控水體中藻相和菌相管理養(yǎng)殖水環(huán)境，實(shí)現(xiàn)養(yǎng)殖水體物質(zhì)和能量的良性循環(huán)，從而促進(jìn)加州鱸健康快速生長并減少疾病發(fā)生[12]。目前，有關(guān)加州鱸養(yǎng)殖池塘藻相的研究[13]與調(diào)控[12]主要集中在微型浮游植物，尤其是藍(lán)藻[14]，往往忽略超微型浮游植物的影響。而超微型浮游植物大量繁殖亦能形成有害藻華，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[15]。本研究中，對加州鱸養(yǎng)殖池塘微型和超微型浮游植物種群結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行了研究，以期為池塘養(yǎng)殖水體中藻類調(diào)控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

采樣池塘為天津市薊州區(qū)藍(lán)科水產(chǎn)有限公司加州鱸覆膜養(yǎng)殖Ⅰ號塘和Ⅱ號塘，平均面積約為4 000 m2，養(yǎng)殖密度約為3尾/m2。每2 000 m2池塘面積安裝1.5 kW增氧機(jī)1臺，維持水體溶解氧濃度大于4 mg/L。養(yǎng)殖池塘以持續(xù)微流水方式換水，每天交換量為池塘水體的50%。在加州鱸養(yǎng)殖期間，6—7月以投喂冰鮮雜魚為主，8—9月以投喂鱸配合飼料為主，總體上按照魚體質(zhì)量8%投喂冰鮮雜魚，按照魚體質(zhì)量4%投喂配合飼料。

1.2 方法

1.2.1 浮游植物樣品的采集 2018年6—9月每月12日采集浮游植物樣品一次，每個養(yǎng)殖池塘設(shè)3個平行采樣點(diǎn)。使用 5 L采水器采集表層(水面以下0.5 m)水樣，將采集的水樣混勻。

1.2.2 葉綠素a含量的測定 取混勻后1 L水樣用3.0、0.2 μm濾膜進(jìn)行逐級過濾，分別得到微型(粒徑>3 μm)和超微型(0.2 μm≤粒徑≤3.0 μm)浮游植物，用體積分?jǐn)?shù)95%的乙醇溶液萃取葉綠素a后，采用分光光度計測定葉綠素a含量。

1.2.3 微型浮游植物的定性與定量 取1 L混勻后的水樣加入體積分?jǐn)?shù)15%的魯哥氏試劑進(jìn)行現(xiàn)場固定，沉淀48 h后，濃縮至50 mL的定量瓶中，之后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行浮游植物鑒定和顯微計數(shù)(參考《中國淡水藻類》[16]和《淡水浮游生物研究方法》[17])。

1.2.4 超微型浮游植物群落結(jié)構(gòu)分析 取混勻后2 L水樣分別采用3.0、0.2 μm的濾膜進(jìn)行逐級過濾，以獲得0.2 μm≤粒徑≤3.0 μm超微型浮游植物，用于超微型浮游植物總DNA提取。

1.2.5 超微型浮游植物DNA的提取 利用試劑盒(PowerWater?DNA Isolation Kit)提取純化粒徑為0.2～3.0 μm超微浮游植物基因組DNA。每個池塘設(shè)3個平行樣，共計24個樣品。將提取的基因組DNA用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測后，置于-20 ℃冰箱中保存待用。

1.2.6 16S rDNA基因高通量測序 按指定測序區(qū)域16S rDNA V4區(qū)合成特異引物，上游引物為5′AYTGGGYDTAAAGNG 3′，下游引物為5′TACNVGGGTATCTAATCC 3′[18]。PCR體系為25 μL。擴(kuò)增條件為:94 ℃下變性30 s，50 ℃下退火30 s，72 ℃下延伸30 s，將樣本的PCR產(chǎn)物用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，使用AMPure XP Beads (Beckman Coulter)進(jìn)行產(chǎn)物純化。得到純化產(chǎn)物進(jìn)行2次PCR，連接“Y”字形接頭及引物序列編碼。利用AMPureXP磁珠純化篩選目的條帶，并通過瓊脂糖凝膠電泳對純化產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)控。隨后采用Hiseq測序平臺對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。

1.2.7 18S rDNA基因高通量測序 按指定測序區(qū)域18S rDNA V4合成基因擴(kuò)增引物，上游引物為5′GCGGTAATTCCAGCTCCAATA 3′，下游引物為5′GATCCCCHWACTTTCGTTCTTGA 3′[19]。PCR反應(yīng)體系(共50 μL)：Buffer 5 μL，dNTP Mixture 8 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各2 μL，模板DNA 2 μL，Taq DNA聚合酶 2.5 U，加適量滅菌水補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)條件：94 ℃下預(yù)變性3 min；94 ℃下變性30 s，58 ℃下退火復(fù)性45 s，72 ℃下延伸45 s，共進(jìn)行33個循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸5 min。隨后參照與16S rDNA相似的試驗流程對最終的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序。

1.2.8 生物多樣性分析 微型浮游植物多樣性：基于顯微計數(shù)后各種微型浮游植物數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計分析。超微型浮游植物多樣性：將Hiseq測序得到的原始雙端序列數(shù)據(jù)經(jīng)過拼接、質(zhì)控、過濾、去嵌合體，最終得到有效序列，然后根據(jù)有效序列數(shù)據(jù)將97%相似性的非重復(fù)序列(不含單序列)進(jìn)行OTU聚類，采用RDP Classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，并基于各分類水平中OTU數(shù)量統(tǒng)計各樣本中的超微真核浮游植物和超微原核浮游植物的群落結(jié)構(gòu)組成。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 22.0軟件進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計，采用Qiime 2進(jìn)行擴(kuò)增子測序數(shù)據(jù)的處理及相關(guān)生物多樣性統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 微型和超微型浮游植物對總浮游植物生物量的貢獻(xiàn)

從圖1可見：加州鱸養(yǎng)殖池塘水體中，微型浮游植物的葉綠素a含量為5.25 ～9.79 μg/L，對總浮游植物葉綠素a的貢獻(xiàn)率為82.8%～90.2%，超微型浮游植物的葉綠素含量為0.62～2.03 μg/L，對總浮游植物葉綠素a的貢獻(xiàn)率為9.8%～17.2%；微型浮游植物和超微型浮游植物的葉綠素a含量最高值均出現(xiàn)在6月份的Ⅰ號塘和Ⅱ號塘。

圖1 微型和超微型浮游植物葉綠素a含量及對總浮游植物的貢獻(xiàn)率Fig.1 Chl-a concentrations and contributions rate to total phytoplankton in nannophytoplankton and picophytoplankton

2.2 微型浮游植物群落結(jié)構(gòu)分析

調(diào)查結(jié)果顯示，Ⅰ號和Ⅱ號養(yǎng)殖池塘的微型浮游植物共有4門24屬，主要為藍(lán)藻門Cyanophyta、硅藻門Bacillariophyta、綠藻門Chlorophyta和裸藻門Euglenophyta，其中，藍(lán)藻門包括席藻屬Phormidium、顫藻屬Oscillatoria等11種，硅藻門包括直鏈藻屬M(fèi)elosira、針桿藻屬Synedra等5種，綠藻門包括新月藻屬Closterium、纖維藻屬Ankistrodesmus等6種，裸藻門包括裸藻屬Euglena和扁裸藻屬Phacus2種(表1)。

表1 加州鱸養(yǎng)殖池塘微型浮游植物的種類組成Tab.1 Nanophytoplankton species composition in culture ponds of largemouth bass Micropterus salmoides

進(jìn)一步分析顯示:Ⅰ、Ⅱ號養(yǎng)殖池塘微型浮游植物中，主要以藍(lán)藻門為主，在6—9月，隨著時間的推移，其占比逐漸減少，但與其他微型浮游植物相比，其占比始終最大；綠藻門占比則呈逐漸升高趨勢，最大占比出現(xiàn)在9月份；硅藻門占比在8月份達(dá)到最高值；而裸藻門浮游植物在整個調(diào)查期間所占比例變化較小(圖2)。

圖2 各門微型浮游植物在全部微型浮游植物中的占比Fig.2 Percent of each phylum of nanophytoplankton in the whole nanophytoplankton

2.3 超微型浮游植物群落結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 超微原核浮游植物群落組成 對6—9月2個池塘的24個樣品進(jìn)行高通量測序，將分析后得到的235個OTUs進(jìn)行群落組成分析，結(jié)果顯示，加州鱸養(yǎng)殖池塘中超微原核浮游植物種類并不局限于聚球藻Synechococcus，且聚球藻豐度占比較小，Ⅰ號和Ⅱ號池塘中聚球藻的相對豐度在6、7月較高，但兩池塘聚球藻的相對豐度差異較大，其中，6月Ⅰ號和Ⅱ號池塘中聚球藻的相對豐度分別為2.7%和6.3%，7月分別為3.1%和5.9%，在8、9月其豐度均有下降的趨勢(圖3)。將占比不足1%的物種歸入其他類，除聚球藻屬外，還發(fā)現(xiàn)微囊藻屬M(fèi)icrocystis、浮絲藻屬Planktothrix、席藻屬、擬柱胞藻Cylindrospermopsis、長孢藻Dolichospermum和節(jié)球藻屬Nodularia6個藻屬，其中，微囊藻屬、浮絲藻屬和席藻屬在整個超微原核浮游植物中的相對豐度均較高，而其余4 個藻屬所占比例均較??；微囊藻屬和席藻屬的相對豐度在8、9月相對較高，而浮絲藻屬在6、7月的相對豐度明顯高于8、9月；從總體上來看，聚球藻屬的相對豐度較其他藻屬仍處在較低水平(圖3)。

圖3 超微原核浮游植物的群落結(jié)構(gòu)Fig.3 Community structure of prokaryotic picophytoplankton

2.3.2 超微真核浮游植物的群落組成 超微真核浮游植物的物種組成非常復(fù)雜，多樣性極高，因此，本研究中選擇在綱級水平上對其進(jìn)行研究。對養(yǎng)殖池塘6—9月的24個樣品進(jìn)行18S rDNA高通量測序，將分析后得到的896個OTUs進(jìn)行群落組成分析(圖4)，其中，將占比不足1%的物種歸入其他類，共發(fā)現(xiàn)4門7綱，分別為不等鞭毛類Stramenopiles淡色藻門Ochrophyta中的硅藻綱Bacillariophyceae、間藻綱Mediophyceae、真眼點(diǎn)藻綱Eustigmatophyceae 和金藻綱Chrysophyceae，囊泡蟲類Alveolata雙鞭毛蟲門Dinoflagellata中的甲藻綱Dinophyceae，隱藻門Cryptophyta中的隱藻綱Cryptophyceae，以及綠藻門Chlorophyta中的綠藻綱Chlorophyceae。各月份Ⅰ號塘和Ⅱ號塘中均以綠藻綱真核浮游植物占絕對優(yōu)勢，相對豐度為33.4%～56.5%，其次為間藻綱，相對豐度為10.3%～37.9%，硅藻綱、甲藻綱和真眼點(diǎn)藻綱真核浮游植物相對豐度在6、7月相對較高，而金藻綱在8、9月相對豐度明顯高于6、7月(圖4)。

圖4 超微真核浮游植物的群落結(jié)構(gòu)Fig.4 Community structure of eukaryotic picophytoplankton

3 討論

3.1 養(yǎng)殖池塘超微型浮游植物對總浮游植物生物量的貢獻(xiàn)

本研究顯示，加州鱸養(yǎng)殖池塘中超微型浮游植物對總浮游植物生物量的貢獻(xiàn)率為9.8%～17.2%，平均貢獻(xiàn)率為12.0%，與中營養(yǎng)湖泊相吻合[20],而微型浮游植物對總浮游植物生物量的貢獻(xiàn)率(82.8%～90.2%)明顯高于超微型浮游植物?？紤]到過濾中的阻滯作用，隨著大孔徑濾膜孔徑逐漸變小，小粒徑微藻也可能被截留在大孔徑濾膜上。另外，因過濾擠壓某些大粒徑細(xì)胞通過了小孔徑濾膜，或某些桿狀等大粒徑微藻短軸通過孔徑也可能偶然截留在小孔徑濾膜上[21]，濾膜分級過程中無法避免的過濾阻滯作用和過濾擠壓作用可能會造成超微型浮游植物對總浮游植物生物量的貢獻(xiàn)被低估或高估。浮游植物的生長速率和種群豐度與水環(huán)境中營養(yǎng)鹽的供應(yīng)情況及自身對營養(yǎng)鹽的吸收速率有關(guān)[22]。浮游植物對營養(yǎng)鹽吸收的半飽和常數(shù)(Ks)與細(xì)胞大小成正比，隨著浮游植物粒徑增大，其Ks也隨之增大。在營養(yǎng)鹽含量較高情況下，Ks大的浮游植物對營養(yǎng)鹽的吸收速率高于Ks小的浮游植物，而在營養(yǎng)鹽缺乏情況下，則Ks小的浮游植物對營養(yǎng)鹽的吸收速率更高，因此，在貧營養(yǎng)水環(huán)境中，個體較小的超微型浮游植物較個體較大的具有更高的營養(yǎng)鹽吸收速率和較高的生長速率，并能夠在浮游植物群落中占據(jù)優(yōu)勢[23-24]。但在營養(yǎng)鹽含量豐富的養(yǎng)殖池塘水環(huán)境中，微型浮游植物不受營養(yǎng)鹽缺乏的抑制，生長速率正常，雖然超微型浮游植物保持同樣或更高的營養(yǎng)鹽吸收速率和生長速率，但因個體微小故對浮游植物群落的貢獻(xiàn)率明顯低于個體較大的微型浮游植物。雖然超微型浮游植物在總浮游植物中的比例隨著水體營養(yǎng)鹽水平的增加而降低，但其生物量與營養(yǎng)條件呈正相關(guān)[25]。所以在淡水養(yǎng)殖系統(tǒng)中，當(dāng)水體貧營養(yǎng)時超微藻對初級生產(chǎn)力和生物量的作用比微型浮游植物更重要。而當(dāng)水體富營養(yǎng)化后雖然其貢獻(xiàn)率下降，但因其自身的生物量和微型浮游植物一樣急劇增加，亦會由于強(qiáng)烈的夜間呼吸作用導(dǎo)致養(yǎng)殖水體缺氧，給養(yǎng)殖業(yè)帶來危害。

目前，淡水池塘養(yǎng)殖加州鱸主要采用冰鮮魚配合飼料投喂的養(yǎng)殖模式，因冰鮮魚的投放會導(dǎo)致養(yǎng)殖水體水質(zhì)有機(jī)污染和富營養(yǎng)化。本研究中發(fā)現(xiàn)，加州鱸養(yǎng)殖池塘微型浮游植物中，藍(lán)藻一直占絕對優(yōu)勢，在6—9月，其含量逐漸減少，與6—7月以投喂冰鮮雜魚為主而8—9月以投喂鱸配合飼料為主的投喂方式相符。藍(lán)藻不僅影響加州鱸攝食，同時因其能夠產(chǎn)生藻毒素，還會造成加州鱸肝臟受損，影響其生長。另外，藍(lán)藻大量增殖，夜晚呼吸作用過強(qiáng)而大量耗氧，容易誘發(fā)加州鱸浮頭，而白天由于光合作用過強(qiáng)，溶解氧含量過高，又容易造成魚體發(fā)生氣泡病。因此，藍(lán)藻防控一直是養(yǎng)殖池塘加州鱸水質(zhì)管理的重點(diǎn)。

3.2 養(yǎng)殖池塘超微型原核和真核浮游植物群落結(jié)構(gòu)特征

本研究中，對粒徑為0.2～3.0 μm超微型浮游植物16 S擴(kuò)增子進(jìn)行高通量測序，結(jié)果顯示，除聚球藻外還發(fā)現(xiàn)包括微囊藻屬在內(nèi)的其他6個藻屬?；诔靥琉B(yǎng)殖水體自身的特殊性，分析其原因可能有以下幾方面：(1)進(jìn)行抽濾的水樣中可能存在一些游離藍(lán)藻的環(huán)狀DNA，因其比一般線性DNA結(jié)合更緊密和穩(wěn)定，致使其最后截留在了0.2 μm濾膜上；(2)某些長孢藻其藻絲呈直線狀[26]，浮絲藻屬也是一種絲狀藍(lán)藻[27]，這些絲狀的大粒徑藍(lán)藻短軸可能通過3.0 μm孔徑但被截留在0.2 μm濾膜上；(3)本研究中所調(diào)查的加州鱸養(yǎng)殖系統(tǒng)采用的是微流水循環(huán)系統(tǒng)，因為某些藍(lán)藻可產(chǎn)生內(nèi)生孢子或外生孢子以進(jìn)行無性生殖，混在水中的這些孢子隨著抽濾過程的進(jìn)行截留在0.2 μm濾膜上，導(dǎo)致產(chǎn)生誤差；(4)由于水體營養(yǎng)鹽的變化，相對體積較小的自養(yǎng)型生物吸收和利用營養(yǎng)鹽的速率更快，故粒徑更小的浮游植物往往具有競爭性優(yōu)勢[28]，導(dǎo)致某些藻類出現(xiàn)粒徑小型化的發(fā)展趨勢。因此，可能出于以上幾種原因，最終導(dǎo)致測序分析后出現(xiàn)了本不屬于超微原核浮游植物的藻屬。

對加州鱸養(yǎng)殖池塘24個樣品進(jìn)行18S rDNA高通量測序獲得的896個OTUs中，隱藻綱的多性最高，具有16個OTUs，其次是甲藻綱，有8個OTUs，但其相對豐度均低于綠藻綱，而綠藻綱的多樣性卻較低。謝薇薇等[29]對太湖超微真核藻遺傳多樣性的研究發(fā)現(xiàn)，太湖超微真核藻主要為隱藻門，其次為硅藻門、金藻門和定鞭藻門。吳凡等[3]對撫仙湖超微真核藻的群落結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，該湖主要為金藻綱、硅藻綱、甲藻綱等，其中金藻綱占絕對優(yōu)勢。雷瑾等[30]研究發(fā)現(xiàn)，白洋淀超微真核藻主要以綠藻綱、硅藻綱、中心硅藻綱、金藻綱為主。而本研究中發(fā)現(xiàn)，加州鱸養(yǎng)殖池塘中綠藻綱超微真核浮游植物占絕對優(yōu)勢，其次為間藻綱和隱藻綱，而金藻綱的相對豐度處于較低水平。在加州鱸養(yǎng)殖池塘中未發(fā)現(xiàn)常見的定鞭藻門超微真核藻[29]，卻發(fā)現(xiàn)了從黃藻綱中分出來的一個新綱——真眼點(diǎn)藻綱[31]。雖然淡水系統(tǒng)中的超微真核藻近些年才逐漸被關(guān)注，但已發(fā)現(xiàn)其組成十分復(fù)雜，不僅具有環(huán)境異質(zhì)性，且其多樣性與水環(huán)境營養(yǎng)水平密切相關(guān)，此外，其他非生物因素對其群落組成也可能存在重要影響[32]。

4 結(jié)論

1)在加州鱸養(yǎng)殖池塘中，微型浮游植物對總浮游植物的貢獻(xiàn)率顯著高于超微型浮游植物。因為水質(zhì)有機(jī)污染和富營養(yǎng)化，導(dǎo)致微型浮游植物中的藍(lán)藻占絕對優(yōu)勢，隨著投喂模式的改變，超微型浮游植物的貢獻(xiàn)率有所提升。微型和超微型浮游植物在養(yǎng)殖池塘中起到的作用不容忽視。

2)養(yǎng)殖池塘中除含有典型超微原核藻聚球藻外，還存在有其他6 屬超微原核藻，藻類可能出現(xiàn)粒徑小型化的發(fā)展趨勢。

3)超微真核浮游植物相對于超微原核浮游植物，其組成更復(fù)雜，多樣性更高。