關(guān)靈 鄭銳年 勞喬聰

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，乳腺癌的發(fā)病率逐年穩(wěn)步上升，預(yù)計還會繼續(xù)不斷增加，是女性最常見的癌癥相關(guān)死亡原因。乳腺癌的發(fā)病因素眾多，大齡妊娠和生殖模式的改變以及母乳喂養(yǎng)持續(xù)時間的縮短促進了乳腺癌發(fā)病的加速進展[1]。雖然乳腺癌的診斷和治療策略有所改進，但腫瘤轉(zhuǎn)移、藥物副作用和耐藥性的諸多障礙仍然是對治療的重大挑戰(zhàn)。

癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲是影響乳腺癌患者預(yù)后的重要因素，尤其是缺氧的腫瘤微環(huán)境導(dǎo)致大約一半的晚期乳腺癌患者對治療表現(xiàn)出抵抗。根據(jù)基因表達(dá)譜，乳腺癌細(xì)胞可分為4個亞型：Luminal A、Luminal B、HER2過度表達(dá)、三陰型，其中乳腺癌中HER-2/neu陽性類型是難治腫瘤之一[2]。乳腺癌病灶部位的血管生成對腫瘤進展起到重要作用，HER-2對腫瘤的營養(yǎng)重要供應(yīng)部位新生血管生成具有重要作用[3-4]。HER-2/neu是表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的家族成員，其高表達(dá)對乳腺癌血管生成有促進作用，增殖迅速，惡性程度高，預(yù)后較差，K-ras基因與腫瘤的生成、增殖、遷移、擴散以及血管生成均有關(guān)系[5]。

植物化學(xué)藥物對正常細(xì)胞的細(xì)胞毒性較低，但可能針對異質(zhì)癌細(xì)胞和多種信號通路發(fā)揮作用。研究表明，植物化學(xué)藥物對乳腺癌具有良好的治療效果；包括 姜黃素、白藜蘆醇和萊菔硫烷可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯，并減少其增殖。此外，研究表明[6-7]，植物化學(xué)藥物可以靶向化療耐藥的乳腺癌干細(xì)胞。因此，植物化學(xué)藥物被認(rèn)為是徹底治療乳腺癌的有希望的藥物[8]。香豆素及其衍生物的生物學(xué)效應(yīng)已被廣泛研究。香豆素衍生物已被用作抗凝劑、抗HIV藥物和中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療[9]。蛇床子素 [7-甲氧基-8-（3-甲基-2-丁烯基）香豆素] 是從蛇床子中提取的一種植物化學(xué)藥物，廣泛用作傳統(tǒng)治療。眾所周知，蛇床子素具有抗炎、抗菌和抗過敏的作用[10]，并且由于其抗癌活性而受到越來越多的關(guān)注。蛇床子素也被認(rèn)為對幾種癌癥有治療作用，包括肺癌、肝癌、宮頸癌和卵巢癌。此外，蛇床子素誘導(dǎo)永生化肝癌細(xì)胞凋亡，抑制小鼠肝腫瘤的生長，但對HER-2/neu陽性乳腺癌的作用機制尚未完全闡明[11]。因此本研究擬分析K-ras基因和不同分期HER-2陽性乳腺癌的相關(guān)性及蛇床子對其調(diào)控作用，進而為臨床上中醫(yī)治療HER-2陽性乳腺癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組

本研究所用HER-2/neu高表達(dá)4T1細(xì)胞由本實驗室制備并凍存，蛇床子素由筆者所在醫(yī)院藥劑科提供并由制劑室煎制。細(xì)胞復(fù)蘇后傳代，所有細(xì)胞在DMEM培養(yǎng)基（Invitrogen）中培養(yǎng)，并添加10% FBS（Invitrogen）和1%抗生素（100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL鏈霉素），溫度為37℃。將細(xì)胞分為兩組，分別為4T1組作為對照組和Osthole組，在4T1細(xì)胞中加入20μM蛇床子素，作用48 h。

1.2 細(xì)胞增殖影響的分析

在定量增殖實驗中，在常規(guī)培養(yǎng)基中種植細(xì)胞數(shù)，將消化之后的細(xì)胞按照設(shè)計的密度分別接種于24孔板中。清洗細(xì)胞，細(xì)胞附著于24孔板厚，然后撫育在含有5% CO2的培養(yǎng)基中。在各組細(xì)胞依照各個作用條件處理后分別再作用48 h。細(xì)胞增殖評價在第6 d使用自動細(xì)胞計數(shù)儀進行分析，吸光度使用分光計記錄490 nm處的值進行分析。

1.3 Caspase3 活性檢測

根據(jù)試劑盒說明進行，基于分光光度法生色團檢測，從標(biāo)記底物上解離后，DEVD-ρNA。首先用各組1×106細(xì)胞處理48 h，通過消化等方法收集細(xì)胞，反復(fù)清洗細(xì)胞后，在溶解緩沖液中溶解。細(xì)胞用半胱天冬氨酸特異性測定裂解產(chǎn)物的蛋白酶活性與顯色分子ρNA結(jié)合的肽。這個caspase裂解生色團ρNA用波長405 nm的分光光度計分析。

1.4 Real-time PCR檢測

用Trizol（Invitrogen）從各組細(xì)胞中提取總RNA。用檢測試劑盒（QuantiTect reverse transcription kit，Qiagen，USA）從RNA逆轉(zhuǎn)錄中提取cDNA。使用SYBRTM綠色PCR試劑盒（Life Technologies）的實時PCR系統(tǒng)（Life Technologies，美國）。GAPDH被定義為內(nèi)部參考。從每個實驗組中提取用TRIzol試劑（Invitrogen）制備總RNA，然后用PureLink RNA mini kit（Invitrogen）進行提取并應(yīng)用Nanodrop ND-100分光光度計測定RNA濃度（Nanodrop公司）。利用cDNA與2X iTaq通用SYBR綠色混合物（Bio-Rad）、200 nm通用PCR引物和200 nm PerfeCTa檢測引物。cDNA合成應(yīng)用iScript cDNA合成試劑盒（購自于Bio-Rad公司）。500 nm 雙向引物和稀釋后的（1∶10）cDNA分別混合（見表1）。應(yīng)用Bio-Rad-CFX-96實時PCR（Bio-Rad公司）進行PCR反應(yīng)。制備標(biāo)準(zhǔn)曲線后，利用2-△△CT計算表達(dá)量。

表1 引物序列

1.5 Western blot檢測

使用加有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液（ProMab Biotechnologies，Inc.，Richmond，CA，USA）提取總蛋白。蛋白質(zhì)用10% SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜（Invitrogen）上，然后與5%脫脂乳孵育1 h。接下來，將PVDF膜與小鼠抗人抗體，在4℃孵育過夜，然后用TBST洗滌3次，并用次級山羊抗鼠IgG HRP（1∶2 000，ab6789，Abcam）抗體孵育1 h。用TBST沖洗2次后，使用ECL Western印跡檢測試劑（Amersham Pharmacia Biotech，Inc.）檢測蛋白質(zhì)，并使用BCA蛋白質(zhì)分析試劑盒（Pierce Biotechnology，Radford，IL，USA）定量。

1.6 觀察指標(biāo)

觀察指標(biāo)包括分析K-ras基因在不同分期HER-2陽性乳腺癌的表達(dá)；蛇床子對HER-2/neu 高表達(dá)4T-1細(xì)胞增殖的影響；蛇床子對HER-2/neu 高表達(dá)4T-1細(xì)胞凋亡活性的影響；蛇床子對HER-2/neu 高表達(dá)4T-1細(xì)胞EMT的影響；蛇床子對HER-2/neu 高表達(dá)4T-1細(xì)胞中K-ras基因表達(dá)的影響；蛇床子對HER-2/neu 高表達(dá)4T-1細(xì)胞Ras/MAPK信號通路的影響。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

利用R軟件（3.6.3版本）（統(tǒng)計分析與可視化），分析TCGA 數(shù)據(jù)庫中BRCA（乳腺浸潤癌）項目中 level 3 HTSeq-FPKM格式的RNAseq數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)，轉(zhuǎn)換成了TPM（transcripts per million reads）格式并進行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化后進行分析，用Mann-Whitney U檢驗（Wilcoxon rank sum test）分析。使用GraphPad Prism 6.0（GraphPad Prism 6.0軟件，La Jolla，CA，USA）進行統(tǒng)計分析。數(shù)值記錄為（±s）。

2 結(jié)果

2.1 K-ras基因在不同分期HER-2陽性乳腺癌的表達(dá)分析

利用TCGA 數(shù)據(jù)庫中BRCA（乳腺浸潤癌）數(shù)據(jù)庫分析K-ras基因在不同分期HER-2陽性乳腺癌的表達(dá)分析，結(jié)果可見，K-ras基因表達(dá)在HER-2陽性乳腺癌顯著增高。在不同TNM分期HER-2陽性乳腺癌中，可見K-ras基因表達(dá)顯著增高，與TNM分期顯著相關(guān)（見圖1）。

圖1 K-ras基因和不同分期HER-2陽性乳腺癌的相關(guān)性分析

2.2 蛇床子對HER-2/neu 高表達(dá)4T-1細(xì)胞增殖的影響

MTT法分析蛇床子對HER-2/neu 高表達(dá)4T-1細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果可見，蛇床子可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見圖2）。

圖2 蛇床子對4T-1細(xì)胞增殖的影響

2.3 蛇床子對HER-2/neu 高表達(dá)4T-1細(xì)胞凋亡活性的影響

分析蛇床子對4T-1細(xì)胞凋亡因子Caspase 3活性的影響，進而分析蛇床子對4T-1細(xì)胞凋亡活性的影響，結(jié)果可見，蛇床子可顯著促進乳腺癌細(xì)胞的Caspase 3活性增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見圖3）。

圖3 蛇床子對4T-1細(xì)胞凋亡活性的影響

2.4 蛇床子對HER-2/neu 高表達(dá)4T-1細(xì)胞EMT的影響

分析蛇床子對4T-1細(xì)胞中E-cadherin 和Vimentin 表達(dá)影響，進而分析蛇床子對4T-1細(xì)胞中EMT的影響，結(jié)果可見，蛇床子可顯著促進乳腺癌細(xì)胞的E-cadherin表達(dá)增加，Vimentin 表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見圖4）。

圖4 蛇床子對4T-1細(xì)胞EMT的影響

2.5 蛇床子對HER-2/neu 高表達(dá)4T-1細(xì)胞中K-ras基因表達(dá)的影響

分析蛇床子對4T-1細(xì)胞中K-ras基因表達(dá)的影響，結(jié)果可見，蛇床子可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的K-ras基因表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（見圖5）。

圖5 蛇床子對4T-1細(xì)胞中K-ras基因表達(dá)的影響

2.6 蛇床子對HER-2/neu 高表達(dá)4T-1細(xì)胞Ras/MAPK信號通路的影響

Western blot分析蛇床子對4T-1細(xì)胞Ras/MAPK信號通路的影響，結(jié)果可見，蛇床子可抑制4T-1細(xì)胞Ras/MAPK信號通路的激活，進而發(fā)揮調(diào)控作用（見圖6）。

圖6 蛇床子對4T-1細(xì)胞Ras/MAPK信號通路的影響

3 討論

HER-2 陽性乳腺癌生長速度快，易復(fù)發(fā)，易轉(zhuǎn)移，與細(xì)胞增殖、分化及細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[12]。而對其治療往往是具有相應(yīng)的抵抗性，因此急需找到一個藥物有效治療HER-2陽性乳腺癌患者[13]。

蛇床子素（Osthole）來源于蛇床子植物中，是傳統(tǒng)中藥蛇床子的重要成分，研究[14]表明它的作用具有多樣性，在治療多種病理病變中具有不容忽視的藥理作用，不僅可以用作治療變態(tài)反應(yīng)，抗風(fēng)濕性疾病，治療骨質(zhì)疏松，在對抗惡性疾病中具有積極作用，已被廣泛應(yīng)用于臨床治療中。但蛇床子對HER-2陽性乳腺癌的作用和機制尚未見報道。本研究選用HER-2/neu 高表達(dá)的人乳腺癌4T-1細(xì)胞，進而分析蛇床子對HER-2陽性乳腺癌的作用。結(jié)果可見，蛇床子導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖活性受抑制，凋亡活性增加。眾所周知，EMT發(fā)生和腫瘤的惡性進展密切相關(guān)，由于它能夠改變細(xì)胞的生物性質(zhì)，導(dǎo)致惡性增生細(xì)胞得以侵襲能力增強，進而轉(zhuǎn)移等，因此是腫瘤進展的關(guān)鍵之一，其中是E-cadherin主要保證細(xì)胞之間的連接，防止惡性細(xì)胞從連接處突圍而出，其表達(dá)的減少和Vimentin表達(dá)增加可促進上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）發(fā)生[9，15-16]。本研究證實，蛇床子素對HER-2/neu高表達(dá)的人乳腺癌4T-1細(xì)胞中EMT是發(fā)揮抑制作用。進一步分析其機制，K-ras基因是RAS基因家族成員之一， K-ras基因及其編碼的蛋白和疾病的惡性進展具有顯著關(guān)聯(lián)，它的下游信號通路包括Ras/MAPK信號通路[17]。信號通路改變引起的異常細(xì)胞增殖和侵襲是癌癥的標(biāo)志。Ras/MAPK信號通路在正常細(xì)胞生理學(xué)中很重要，是治療多種人類癌癥（包括乳腺癌）的共同靶點。特別是，Ras/MAPK信號通路在腫瘤細(xì)胞增殖、生長和存活中起著重要作用。因此，Ras/MAPK信號通路在幾種類型的癌細(xì)胞中被激活；HER2受體家族激活Ras/MAPK信號通路信號通路，并導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞中持續(xù)的增殖信號傳導(dǎo)，通過磷酸化活化，進而相應(yīng)活化相關(guān)細(xì)胞因子，從而促進惡性細(xì)胞的生存、分化、抑制凋亡等[18-19]。研究[15]發(fā)現(xiàn)，蛇床子素可抑制Ras/MAPK信號通路，并誘導(dǎo)HER2過度表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞凋亡。此外，蛇床子素通過抑制大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的Ras/MAPK和ERK1/2信號通路抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。而本研究證實，蛇床子對HER-2/neu高表達(dá)的人乳腺癌4T-1細(xì)胞中K-ras基因可發(fā)揮抑制作用，進而抑制其下游信號通路Ras/MAPK信號通路，進而抑制細(xì)胞通路活化，抑制核轉(zhuǎn)錄因子激活，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖。

綜上所述，K-ras基因表達(dá)增高和HER-2陽性乳腺癌不同TNM分期顯著相關(guān)，蛇床子可調(diào)控K-ras基因，進而下調(diào)Ras/MAPK信號通路，抑制乳腺癌進展。本研究為蛇床子應(yīng)用于HER-2陽性乳腺癌的治療提供了理論依據(jù)。