呂建國，張 晗，周薈慧，余 祎，湯秘密，方國平，吳 喆，孫燕玲**

(1.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部國家級(jí)全科醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院；3.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

全球癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告表明[1-2]，2020年原發(fā)性肝癌新發(fā)病例約為90.6萬，而我國的肝癌病例約占全球病例的一半。肝細(xì)胞癌是原發(fā)性肝癌的主要類型，占原發(fā)性肝癌的75%～85%，通常起病隱匿，病程進(jìn)展快，預(yù)后較差，病死率高[3]。目前，中醫(yī)藥已應(yīng)用于原發(fā)性肝癌各階段的治療，其對(duì)肝癌的作用主要為拮抗腫瘤血管生成、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、提高機(jī)體免疫力、降低放化療的不良反應(yīng)等[4-5]。金線蓮苷是從開唇蘭屬植物金線蓮中提取到的有效活性成分，文獻(xiàn)報(bào)道[6]，金線蓮苷具有降血糖和治療糖尿病、降血脂和減肥、保肝護(hù)肝、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞等藥理活性。因此，本研究選取不同濃度金線蓮苷作用于人肝癌HepG2細(xì)胞，旨在揭示金線蓮苷對(duì)HepG2細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株

人肝癌HepG2細(xì)胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.1.2 儀器和試劑

儀器：HERAcell 150i型美國Thermo ScientificCO2細(xì)胞培養(yǎng)箱；MDF-U53V型日本Sanyo-80℃超低溫冰箱；3K15型德國Sigma高速冷凍離心機(jī)；Epoc型美國Biotek全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀；DMIL LED型德國Leica普通光學(xué)顯微鏡。

試劑：金線蓮苷購自上海源葉生物科技有限公司；高糖DMEM培養(yǎng)基、普通級(jí)胎牛血清購自美國Gibco公司；MTT試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；CCK-8檢測(cè)試劑盒購自日本同仁化學(xué)研究所；Transwell板購自美國Coming公司；Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞在5%CO2，37℃條件下用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時(shí)，用0.25%胰酶消化，制備成單細(xì)胞懸液。

1.2.2 四唑鹽比色法(MTT)

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，以每孔5000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞貼壁后分別加入不同濃度的金線蓮苷，使金線蓮苷最終濃度分別為0、5、10、20、40、80μmol/L，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔；繼續(xù)孵育48h后加入5mg/mL的MTT溶液20μL，4h后終止培養(yǎng)，每孔加入150μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min。在酶標(biāo)儀490nm處測(cè)定各孔的吸光度，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。增殖抑制率=(1-實(shí)驗(yàn)孔OD值/對(duì)照孔OD值)×100%。

1.2.3 細(xì)胞增殖-毒性實(shí)驗(yàn)(CCK-8)

分別用0、5、10、20、40、80μmol/L金線蓮苷對(duì)貼壁后的HepG2細(xì)胞進(jìn)行處理，每組3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48h，每孔加入10μL CCK-8溶液，孵育1.5h，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm波長(zhǎng)處的吸光度(OD)，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)孔OD值-空白孔OD值)/(對(duì)照孔OD值-空白孔OD值)×100%。

1.2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且已饑餓處理12h的HepG2細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基制備成單細(xì)胞懸液，以每孔5×104個(gè)細(xì)胞接種于Transwell上室，分別加入不同濃度的金線蓮苷，使金線蓮苷最終濃度分別為0、5、10、20、40、80μmol/L；將Transwell上室放入24孔板下室，下室每孔加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)的每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中，預(yù)先在Transwell上室的底部均勻鋪入Matrigel。繼續(xù)培養(yǎng)18h，棄去培養(yǎng)基后用棉簽輕輕擦拭上室內(nèi)部，4%多聚甲醛室溫固定30min，0.5%結(jié)晶紫染色15min，清水洗3次，自然風(fēng)干。在顯微鏡下進(jìn)行觀察，每個(gè)Transwell小室隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照，計(jì)數(shù)后取平均值。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，以每孔8×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，細(xì)胞鋪滿板底后，用200μL無菌的槍頭尖端垂直于孔板，在每孔相同位置做線性劃痕，用PBS輕輕沖洗2～3遍，然后分別用0、5、10、20、40、80μmol/L金線蓮苷處理細(xì)胞，于0、24、48h在顯微鏡下拍照取樣，采用Image J軟件觀察計(jì)算細(xì)胞劃痕面積，細(xì)胞遷移率(%)=(0h劃痕寬度-培養(yǎng)后劃痕寬度)/0h劃痕寬度×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異的比較，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 金線蓮苷對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞增殖活性的影響

隨著金線蓮苷濃度的增加，HepG2細(xì)胞的增殖抑制率也逐漸上升；40μmol/L和80μmol/L金線蓮苷作用于HepG2細(xì)胞后，細(xì)胞增殖抑制率明顯高于0μmol/L組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖1。

(與0μmol/L組比較，**P<0.01)

2.2 金線蓮苷對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞存活率的影響

隨著金線蓮苷濃度的增加，HepG2細(xì)胞的存活率逐漸下降；40μmol/L和80μmol/L金線蓮苷作用于HepG2細(xì)胞后，細(xì)胞存活率明顯低于0μmol/L組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

2.3 金線蓮苷對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響

隨著金線蓮苷濃度的增加，遷移和侵襲的HepG2細(xì)胞數(shù)逐漸減少；與0 μmol/L組比較，40μmol/L和80μmol/L金線蓮苷作用于HepG2細(xì)胞后，遷移和侵襲的HepG2細(xì)胞數(shù)顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖3。

(與0μmol/L組比較，**P<0.01)

2.4 金線蓮苷對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞遷移能力的影響

不同濃度金線蓮苷作用HepG2細(xì)胞，隨著作用時(shí)間的增加，劃痕面積越來越小，遷移率越來越高；其中40μmol/L和80μmol/L金線蓮苷作用于HepG2細(xì)胞后，細(xì)胞劃痕面積明顯大于0μmol/L組，而遷移率與0μmol/L組比較顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。見圖4。

(與0μmol/L組比較，*P<0.05，**P<0.01)

3 討 論

金線蓮為蘭科開唇蘭屬植物，全草均可入藥，其味平、性甘，在民間傳說具有治療百病之功效，素有"藥王"之美稱[7]。金線蓮苷是從金線蓮中分離提取到的8種丁酸衍生物葡萄糖苷之一。研究表明，金線蓮苷對(duì)四氯化碳(CCl4)所致小鼠急、慢性肝損傷模型有保護(hù)作用，模型小鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性，小鼠肝臟系數(shù)、脾臟系數(shù)均顯著降低[8]。肝細(xì)胞癌是由于正常肝細(xì)胞惡變所導(dǎo)致，其臨床表現(xiàn)主要為進(jìn)行性肝損傷及全身性癥狀[3]。近年來，中醫(yī)藥越來越多的應(yīng)用于臨床肝癌各階段的治療[9]，對(duì)金線蓮苷藥理活性的研究也越來越全面和深入，但目前尚未見金線蓮苷對(duì)肝癌作用的相關(guān)報(bào)道。

本研究選取不同濃度金線蓮苷作用于人肝癌HepG2細(xì)胞，用MTT和CCK-8檢測(cè)HepG2細(xì)胞的增殖和活性，結(jié)果顯示，隨著金線蓮苷濃度的增加，HepG2細(xì)胞的增殖抑制率逐漸上升，存活率逐漸下降，且40μmol/L和80μmol/L金線蓮苷作用于HepG2細(xì)胞后，細(xì)胞增殖抑制率和存活率與0μmol/L組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明金線蓮苷對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞有細(xì)胞毒性，能明顯抑制HepG2細(xì)胞的增殖活性，且具有劑量依賴性。Transwell實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著金線蓮苷濃度的增加，遷移和侵襲的HepG2細(xì)胞數(shù)逐漸減少，且隨著作用時(shí)間的增加，細(xì)胞劃痕面積越來越小，遷移率越來越高；與0μmol/L組相比，40μmol/L和80μmol/L金線蓮苷作用于HepG2細(xì)胞后，遷移和侵襲的HepG2細(xì)胞數(shù)顯著減少，細(xì)胞劃痕面積明顯較大，遷移率顯著降低，表明金線蓮苷能明顯減弱人肝癌HepG2細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力，抑制HepG2細(xì)胞的侵襲和遷移能力。

總之，金線蓮苷能明顯抑制人肝癌HepG2細(xì)胞的增殖活性，對(duì)HepG2細(xì)胞的侵襲和遷移能力也有抑制作用，且存在劑量依賴性。金線蓮活性成分有多種抗癌作用機(jī)制，包括干擾細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、免疫調(diào)節(jié)等[10]，金線蓮苷的抗腫瘤作用機(jī)制是否與以上機(jī)制有關(guān)仍需進(jìn)一步研究，其具體的分子機(jī)制將是我們下一步研究的方向。