劉 靜，周 權(quán)，王 浩，夏雨晨，湯思齊，朱 薿**

(1.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 咸寧 437100；2.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是世界上第三大最常見的癌癥，發(fā)病率和死亡率不斷上升。目前結(jié)直腸癌主要通過外科手術(shù)、化學(xué)療法和放射療法治療，但是容易復(fù)發(fā)。研究發(fā)現(xiàn)炎性腸病是結(jié)直腸癌發(fā)生的重要誘因之一[1]，因此，開發(fā)新的防治炎性腸病相關(guān)結(jié)直腸癌的藥物刻不容緩。百里醌(thymoquinone，TQ)是從黑種草籽中提取的主要活性單體，具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤作用。研究發(fā)現(xiàn)百里醌可抑制炎性腸病[2]和結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖[3]，但具體作用機制尚不明確。本文通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析百里醌治療炎性腸病相關(guān)結(jié)直腸癌的潛在分子機制，為百里醌的臨床應(yīng)用提供指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 百里醌相關(guān)作用靶點篩選

以“Thymoquinone”為關(guān)鍵詞，通過篩選PharmMapper[4]、STITCH[5]、SwissTargetPrediction[6]數(shù)據(jù)庫得到百里醌相關(guān)潛在作用靶點。同時在GEO[7]數(shù)據(jù)庫中通過關(guān)鍵詞“Thymoquinone”篩選獲得GSE122860數(shù)據(jù)集原始文件，運用GEO2R分析百里醌處理的結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116顯著差異表達(dá)基因，并繪制火山圖。上述數(shù)據(jù)庫得到百里醌相關(guān)的潛在靶點基因合并去重。在Uniprot[8]蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中標(biāo)準(zhǔn)化蛋白質(zhì)靶點信息。

1.2 篩選炎性腸病和結(jié)直腸癌的疾病靶點

分別以“inflammatory bowel disease，IBD”和“Colorectal cancer，CRC”為關(guān)鍵詞，在TTD[9]、OMIM[10]、GeneCards[11]疾病數(shù)據(jù)庫中篩選炎性腸病和結(jié)直腸癌疾病相關(guān)靶點。運用炎性腸病靶點、結(jié)直腸癌疾病靶點和百里醌預(yù)測靶點繪制韋恩圖，得到藥物—疾病共同靶點。

1.3 藥物—作用靶點蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及拓?fù)鋵W(xué)分析

運用STRING[12]數(shù)據(jù)庫構(gòu)建藥物-疾病共同靶點蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)圖，同時采用 Cytoscape軟件及NetworkAnalyzer工具計算PPI網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點的自由度(Degree)、介度(Betweeness)、聚類系數(shù)(Clustering coefficient)等拓?fù)鋵W(xué)屬性。以大于中位數(shù)的Degree 值為關(guān)鍵靶點，重構(gòu)PPI圖。

1.4 GO富集與KEGG通路分析

運用DAVID[13]和KEGG[14]數(shù)據(jù)庫對藥物—疾病共同靶基因進(jìn)行GO富集與KEGG通路分析，繪制GO富集、KEGG氣泡圖和相關(guān)通路圖。

1.5 百里醌—共同靶點—通路網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建

將1.4中KEGG篩選出的百里醌與疾病共同作用靶點，在疾病相關(guān)的作用通路上標(biāo)注出來，再用cytoscape軟件整合繪制主要的通路圖，驗證其多靶點、多途徑協(xié)同作用于疾病的分子機制。

1.6 百里醌與靶蛋白分子對接

分別從PDB[15]和PubChem[16]數(shù)據(jù)庫下載蛋白結(jié)構(gòu)和百里醌結(jié)構(gòu)，使用Pymol軟件去除溶劑分子與配體，使用AutoDock軟件進(jìn)行加氫、加電子、加ROOT等操作，最后用AutoDock軟件Local Search Parameters算法進(jìn)行分子對接，使用Pymol軟件對得到的最佳結(jié)果進(jìn)行繪圖。

2 結(jié) 果

2.1 百里醌潛在作用靶點篩選

在PharmMapper、STITCH、SwissTargetPrediction三個數(shù)據(jù)庫中篩選百里醌潛在藥物靶點，共計得到123個百里醌靶點。通過檢索GEO數(shù)據(jù)庫找到GSE122860數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集中包含了3個百里醌處理HCT116細(xì)胞的干預(yù)組和3個百里醌未處理的細(xì)胞對照組。以P<0.05，logFC>1或logFC<-1為限定值，得到百里醌干預(yù)差異表達(dá)基因86個，見圖1。這86個差異表達(dá)基因也可能是百里醌潛在的藥物靶點。將123個由三個數(shù)據(jù)庫預(yù)測的百里醌潛在藥物靶點與GSE122860數(shù)據(jù)集差異表達(dá)基因合并后去除重復(fù)，最終獲得207個百里醌潛在作用靶點。

(下調(diào)基因用藍(lán)色點表示，上調(diào)基因用紅色點表示)

2.2 百里醌與炎性腸病和結(jié)直腸癌疾病共同靶點篩選

通過疾病數(shù)據(jù)庫合并去重后得到5256個炎性腸病疾病靶點和7611個結(jié)直腸癌疾病靶點。將百里醌藥物靶點與炎性腸病和結(jié)直腸癌疾病靶點取交集，最終得到73個共同靶點，繪制韋恩圖，見圖2。

(TQ：百里醌；IBD：炎性腸??；CRC：結(jié)直腸癌)

2.3 共同靶點蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)

通過STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建得到73個共同靶點蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3A。Cytoscape軟件插件Network Analyzer發(fā)現(xiàn)該網(wǎng)絡(luò)包含58個節(jié)點，72個邊；節(jié)點平均度值是2.7，核心靶點篩選條件設(shè)置為degree大于5.4，共篩選出3個靶點，分別是絲裂原激活的蛋白激酶3(mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)和CREB結(jié)合蛋白(CREB binding proein，CREBBP)，見圖3B，它們與其他蛋白相互作用更強，在該網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

(A：STRING中繪制的靶點PPI圖；B：Cytoscape繪制的PPI靶點圖)

2.4 GO富集與KEGG通路分析

用DAVID數(shù)據(jù)庫對藥物-疾病共同靶基因進(jìn)行GO富集與KEGG通路分析，以“P≤0.05”為條件篩選出具有顯著性差異的基因本體和通路。GO富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些靶點與172個生物過程(biology process，BP)、25個細(xì)胞組分(cellular component，CC)，41個分子功能(molecular function，MF)有關(guān)。圖4A顯示了各項排名前10的條目。GO富集結(jié)果顯示共同靶點主要與啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、非折疊蛋白結(jié)合、過氧化物合酶活性、NF-kB誘導(dǎo)的激酶活性、初級胺氧化酶活性、ATPase酶活性、受體拮抗活性等密切相關(guān)。KEGG分析后發(fā)現(xiàn)73個共同靶點主要富集在79個通路中，取前20個通路繪制圖4B。結(jié)果表明，這些共同靶點主要富集在Pathways in cancer、PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signaling pathway、Hepatitis B、HTLV-I infection、Melanoma、Proteoglycans in cancer、Focal adhesion、Prostate cancer、FoxO signaling pathway等通路中。其中前三個通路富集的共同靶點>15，根據(jù)共同靶點在KEGG數(shù)據(jù)庫獲得其中PI3K-Akt信號通路(圖5)和MAPK信號通路(圖6)。

(A：GO分析柱狀圖；B：KEGG通路分析氣泡圖)

(紅色代表的是百里醌—疾病共同靶點)

2.5 構(gòu)建百里醌治療炎性腸病相關(guān)結(jié)直腸癌通路圖

將百里醌與疾病共同靶點和通路構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，見圖7。該網(wǎng)絡(luò)圖包含百里醌、73個共同靶點、前20個KEGG信號通路。

(紅色：百里醌；內(nèi)圈黃色：共同靶點；外圈黃色：相關(guān)KEGG通路)

2.6 百里醌與關(guān)鍵靶蛋點蛋白MAPK3的分子對接

構(gòu)建百里醌與關(guān)鍵靶點MAPK3、EGF、CREB對接模型，計算對接后RMSD及-CDOCKER ENERGY 值。百里醌與EGF、CREB分子對接不成功，與MAPK3分子對接結(jié)果見圖8。結(jié)果發(fā)現(xiàn)分子對接模型 RMSD 值為1.672，小于2?；結(jié)合能為-3.1kj/mol，小于0，表明配體分子(百里醌)能和受體蛋白(MAPK3)自發(fā)地結(jié)合。提示百里醌與潛在關(guān)鍵靶點MAPK3具有較好的結(jié)合活性。

圖8 百里醌與關(guān)鍵靶點MAPK3分子對接構(gòu)象圖

3 討 論

本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)方法，結(jié)合分子對接技術(shù)，篩選到73個百里醌治療炎性腸病相關(guān)結(jié)直腸癌潛在靶點，這說明百里醌可能參與調(diào)節(jié)多個靶點發(fā)揮抗腫瘤作用。目前研究發(fā)現(xiàn)百里醌可通過抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，選擇性抑制胰腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、肝癌、宮頸癌和白血病等多種腫瘤的作用[17]。在許多癌癥中，百里醌通過多種信號通路調(diào)節(jié)促凋亡和抗凋亡基因的表達(dá)來誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，百里醌是否調(diào)控其他蛋白介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡還未可知。本研究發(fā)現(xiàn)73個潛在治療靶點，為探討百里醌其他作用機制提供可能。

本研究構(gòu)建的關(guān)鍵作用靶點PPI網(wǎng)絡(luò)包含58個節(jié)點，72條邊，得到MAPK3、EGF和CREBBP共 3個關(guān)鍵靶點，這3個靶點在炎性腸病和結(jié)直腸癌疾病發(fā)生發(fā)展中均發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)MAPK3在炎性腸病的進(jìn)展和發(fā)展中起關(guān)鍵作用[18]；在結(jié)直腸癌中研究發(fā)現(xiàn)MAPK3表達(dá)下降，且與結(jié)直腸癌預(yù)后有關(guān)[19]，提示MAPK3在炎性腸病相關(guān)結(jié)直腸癌中發(fā)揮重要作用。EGF是細(xì)胞增殖和組織修復(fù)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，在炎性腸病組織修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用[20]，而且EGF還參與調(diào)控G/S 期細(xì)胞周期[21]，百里醌可通過抑制EGF介導(dǎo)G/S 期細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變來抑制細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化。研究發(fā)現(xiàn)CREBBP觸發(fā)的 KDM2B 乙?；铀倭私Y(jié)腸癌的致癌作用[22]，而且CREBBP可能與 STAT1 相互作用參與IBD的發(fā)生發(fā)展[23]。百里醌調(diào)控CREBBP可能抑制炎性腸病相關(guān)結(jié)直腸癌進(jìn)展。這些研究表明百里醌可能通過調(diào)控這3個關(guān)鍵靶點介導(dǎo)炎性腸病相關(guān)結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展。

在GO功能和KEGG通路富集分析中，本研究發(fā)現(xiàn)百里醌主要與啟動子轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡等密切相關(guān)；相關(guān)信號通路主要富集在PI3K-Akt和MAPK通路上。結(jié)直腸癌體內(nèi)外研究[24]表明百里醌可通過抑制p-PI3K、p-Akt、p-GSK3β和β-catenin來抑制LoVo結(jié)腸癌細(xì)胞中前列腺素受體EP2和EP4的活化，從而抑制細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果證實百里醌是通過調(diào)控PI3K-Akt信號通路抑制炎性腸病相關(guān)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖。MAPK通路調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，包括細(xì)胞增殖、分化、遷移和細(xì)胞凋亡。研究[25]發(fā)現(xiàn)MAPK信號通路的遺傳變異會影響結(jié)直腸癌診斷后的風(fēng)險和生存率。在結(jié)腸炎體內(nèi)外模型中研究[26]已證實百里醌可通過抑制MAPK和NF-κB信號通路并轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié) PPAR-γ表達(dá)發(fā)揮抗炎活性。結(jié)合本研究結(jié)果推斷百里醌也可通過調(diào)控MAPK通路發(fā)揮抗炎性腸病相關(guān)結(jié)直腸癌的作用。由此可見，百里醌可能通過多個通路同時抑制抗炎性腸病相關(guān)結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展。

本研究分子對接結(jié)果顯示百里醌能與MAPK3自發(fā)結(jié)合，并形成較為穩(wěn)定的構(gòu)象。研究發(fā)現(xiàn)結(jié)腸炎癥中MAPK3的表達(dá)顯著增加[27]。下調(diào)MAPK3及其相關(guān)信號通路可抑制細(xì)胞增殖，由此可見，百里醌可能通過靶向MAPK3調(diào)控相關(guān)通路抑制炎性腸病相關(guān)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖。

綜上所述，百里醌通過靶向MAPK3調(diào)控多個信號通路，以抗炎和抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖的方式治療炎性腸病相關(guān)結(jié)直腸癌。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)的應(yīng)用為中藥研究提供新的技術(shù)和方法，有助于更高效的探索藥物作用靶點及通路，后續(xù)還需要體內(nèi)外實驗驗證本研究結(jié)果。