桑賢軻，冉 蝶，吳鳴虎,**，曾志剛**

(1.湖北科技學(xué)院醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，湖北 咸寧 437100;2.湖北科技學(xué)院核技術(shù)與化學(xué)生物學(xué)院)

作為一種羰基官能團(tuán)的保護(hù)策略與對羰基化合物進(jìn)行分離和純化的手段，肟類化合物在有機(jī)合成中具有重要地位，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥以及相關(guān)工業(yè)合成領(lǐng)域。例如，哈佛大學(xué)E.J.Corey課題組曾在紅霉內(nèi)酯A的全合成中利用肟化-脫肟策略來保護(hù)羰基[1]；具有農(nóng)用殺蟲與殺菌活性的紫蘇醛可通過紫蘇葶的脫肟反應(yīng)制備[2]；工業(yè)上香料香芹酮即以檸檬烯為原料，經(jīng)香芹酮肟脫肟獲取[3]。

脫除肟基再生為羰基的化學(xué)方法主要有酸性水解脫肟、還原脫肟、氧化脫肟以及電化學(xué)脫肟等[4]。這些化學(xué)脫肟方法成功實(shí)現(xiàn)了相關(guān)羰基化合物的高產(chǎn)率合成，且具有廣泛的底物范圍，為有機(jī)合成提供了高效成熟的工具。但是，這些方法往往伴隨著苛刻的反應(yīng)條件與昂貴的設(shè)備要求，或者催化劑用量較大，并且常產(chǎn)生大量難于降解的有機(jī)廢料，對生態(tài)環(huán)境保護(hù)形成壓力。相對化學(xué)脫肟方法，生物酶催化脫肟具有選擇性高、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，在降低反應(yīng)廢物排放,即綠色合成方面優(yōu)勢突出，具有廣闊的發(fā)展前景。

釩依賴型氯過氧化物酶(CiVCPO)可以利用過氧化氫(H2O2)、有機(jī)氫過氧化物作為氧化劑，催化烯烴化合物的羥鹵化反應(yīng)、鹵代內(nèi)酯化反應(yīng)等[5-7]。本文以來源于曲霉菌(curvulariainaequalis)的CiVCPO為生物酶催化劑，通過催化模板反應(yīng)苯甲醛肟脫肟探索了緩沖液pH、CiVCPO濃度、H2O2濃度等因素對脫肟反應(yīng)的影響，并在此基礎(chǔ)上與醇脫氫酶(TgADH)級聯(lián)以擴(kuò)大脫肟反應(yīng)應(yīng)用范圍。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

溶菌酶(F8BBA0007，索萊寶)；Dnase I(B00B10303，北京鼎國昌盛)；還原型輔酶Ⅰ(618D021，索萊寶)；異丙醇(0511190802，上海星可)；過氧化氫(30%，20150409，國藥)；氯化鈉(阿拉丁，A2104024)；磷酸氫二鈉(20210104，天津市大茂化學(xué)試劑廠)；檸檬酸(C11622689，麥克林)；苯甲醛肟(BLA369，畢得醫(yī)藥)；環(huán)己酮肟(EJ280111，安耐吉)；丙酮肟(BJ220099，安耐吉)；二苯甲酮肟(931KRGMH，安耐吉)；苯乙酮肟(BNY146，安耐吉)；環(huán)戊酮肟(OK210813T，OKA)；苯乙酮(K1919046，阿拉丁)；苯乙醇(20180806，沃凱)；苯甲醛(H2010099，阿拉丁)；環(huán)己酮(C10234465，麥克林)；環(huán)戊酮(69706947，邁瑞爾)；環(huán)己醇(C12412594，麥克林)；環(huán)戊醇(C1813034)。

BE-3200恒溫混勻儀(其林貝爾儀器)；GC-2010 Pro氣相色譜儀(島津)。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 苯甲醛肟儲備液配制

將苯甲醛肟(12mg，0.10mmol)溶于10mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(100mmol/L，pH=4)中，得底物濃度為10mmol/L的儲備液。

1.2.2 氯化鈉儲備液配制

稱量0.20g NaCl轉(zhuǎn)移至1mL頂空瓶，使用去離子水定容至1mL，得3.43mol/L NaCl儲備液。

1.2.3CiVCPO酶催化苯甲醛肟脫肟反應(yīng)

取1mL苯甲醛肟儲備液于1.5mL EP管中，依次加入30.0μL NaCl儲備液(終濃度為100mmol/L)，12.5μL 3.95mol/L H2O2(終濃度為50mmol/L)以及3.0μLCiVCPO(0.2mmol/L，終濃度為0.5μmol/L)。將EP管置于恒溫混勻儀中，設(shè)置溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為800rpm進(jìn)行反應(yīng)，GC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程。同樣的方法合成2b-7b，在GC上均與市售標(biāo)品保留時間一致。

1.2.4CiVCPO酶與TgADH級聯(lián)反應(yīng)

取1mL苯甲醛肟儲備液于1.5mL EP管中，依次加入30.0μL NaCl儲備液(終濃度為100mmol/L)，12.5μL 3.95mol/L H2O2(終濃度為50mmol/L)以及3.0μLCiVCPO(0.2mmol/L，終濃度為0.5μmol/L)。將EP管置于恒溫混勻儀中，設(shè)置溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為800rpm進(jìn)行反應(yīng)。4h后，取反應(yīng)液100μL，加入500μL pH=9的100mmol/L磷酸氫二鈉緩沖溶液，混勻后加入TgADH粗酶液(1mg/mL)，然后依次加入10mg/mL溶菌酶100μL(終濃度為1mg/mL)，50μL 20mmol/L NADH(終濃度為1mmol/L)，異丙醇50μL(占總體積5%)，20μL 300U/L DnaseⅠ(終濃度為6U/mL)，總體積為1mL，GC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程。同樣的方法合成3c、5c、6c，在GC上均與市售標(biāo)品保留時間一致。

2 結(jié) 果

2.1 pH對反應(yīng)的影響

以苯甲醛肟脫肟為模板反應(yīng)，探索檸檬酸鹽緩沖體系pH對脫肟反應(yīng)的影響。研究結(jié)果表明，緩沖溶液pH對CiVCPO催化活性具有較大的影響(圖1)。當(dāng)pH小于4時，目標(biāo)產(chǎn)物苯甲醛濃度偏低，可能是酶的活性受到抑制所致；當(dāng)pH等于4時，目標(biāo)產(chǎn)物濃度顯著提升；而當(dāng)pH大于4時，目標(biāo)產(chǎn)物濃度顯著降低。究其原因是苯甲醛被進(jìn)一步氧化生成產(chǎn)物苯甲酸，由此可見，緩沖溶液體系pH為4時最有利于CiVCPO催化脫肟反應(yīng)發(fā)生。

2.2 CiVCPO濃度對反應(yīng)的影響

在確定檸檬酸鹽緩沖體系最適pH后，對CiVCPO酶的用量進(jìn)行了考察，以期進(jìn)一步提高反應(yīng)的總轉(zhuǎn)化率。CiVCPO濃度對反應(yīng)的影響如圖2所示。當(dāng)CiVCPO濃度為1μmol/L時，催化效果最佳，產(chǎn)物濃度最高，約1.442mmol/L。當(dāng)酶濃度提高到2μmol/L時，目標(biāo)產(chǎn)物苯甲醛濃度僅為0.502mmol/L。總的來說，基于經(jīng)濟(jì)性因素考慮，CiVCPO酶濃度為0.5μmol/L時原子經(jīng)濟(jì)性最高。

2.3 H2O2濃度對反應(yīng)的影響

在前述研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析了H2O2濃度對反應(yīng)的影響，結(jié)果如圖3所示。從中可以看出，H2O2濃度為50mmol/L時，反應(yīng)情況最好，目標(biāo)產(chǎn)物苯甲醛濃度最高(2.29mmol/L)。但隨著H2O2濃度的升高，目標(biāo)產(chǎn)物濃度并沒有隨之增加而是逐漸降低，推測是過高濃度的H2O2對酶活性產(chǎn)生了抑制。

圖3 H2O2濃度對反應(yīng)的影響(產(chǎn)物濃度根據(jù)GC峰面積計(jì)算)

2.4 脫肟反應(yīng)的底物范圍及級聯(lián)反應(yīng)測試

在確定了最優(yōu)的反應(yīng)條件后，考察了CiVCPO催化脫肟反應(yīng)的底物范圍(表1)?？傮w來看，苯環(huán)上存在羥基等供電子基團(tuán)時，脫肟反應(yīng)較易發(fā)生，產(chǎn)率較高，如對羥基苯甲醛肟(2a)產(chǎn)率44%，接近苯甲醛肟(1a)產(chǎn)率的2倍。此外，酮肟類化合物整體脫肟效率高于醛肟類化合物，如在本研究中酮肟類化合物效率最低的二苯甲酮肟(4a)其產(chǎn)率也明顯優(yōu)于醛肟類化合物。

表1 脫肟反應(yīng)底物范圍*

為了擴(kuò)大該脫肟反應(yīng)的應(yīng)用前景，首先選擇脫肟效率較高的脂肪環(huán)類酮肟(5a，6a)與芳香族酮肟(3a)進(jìn)行脫肟，并通過一鍋法與TgADH進(jìn)行級聯(lián)，得到相應(yīng)的醇類化合物，結(jié)果如表2所示。芳香族酮肟(3a)經(jīng)過CiVCPO與TgADH一鍋法以8.7%的產(chǎn)率得到1-苯乙醇(3c)；脂肪族酮肟5a、6a分別以7.3%、15.8%的產(chǎn)率得到環(huán)戊醇(5c)、環(huán)己醇(6c)。接著選擇脫肟效率相對較低的苯甲醛肟(1a)進(jìn)行了級聯(lián)反應(yīng)測試，同樣也得到了目標(biāo)化合物苯甲醇(1c)。

表2 級聯(lián)反應(yīng)測試*

3 討 論

作為手性技術(shù)和綠色化學(xué)的重要組成部分，生物酶催化現(xiàn)已成為化學(xué)和生物學(xué)交叉領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)，許多酶催化工藝已經(jīng)用于手性藥物、農(nóng)藥等精細(xì)化學(xué)品的生產(chǎn)[8]。本研究首次報(bào)道了CiVCPO催化脫肟反應(yīng)，并以苯甲醛肟脫肟反應(yīng)為模板，探索了檸檬酸緩沖體系pH、CiVCPO濃度和H2O2濃度對反應(yīng)的影響，確定了脫肟反應(yīng)最優(yōu)條件為50mmol/LH2O2、100mmol/L檸檬酸緩沖液(pH=4)及0.5μmol/LCiVCPO。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步測試了7種肟類底物，順利得到了相應(yīng)的醛酮產(chǎn)物，產(chǎn)率23%～98%。隨后，選擇4種肟類底物測試了CiVCPO與TgADH的級聯(lián)反應(yīng)，均得到預(yù)期的醇類化合物，拓展了反應(yīng)應(yīng)用范圍。與傳統(tǒng)的脫肟方法相比，CiVCPO催化情況下，使用的氧化劑為廉價(jià)的H2O2，反應(yīng)后僅生成水，不會對環(huán)境造成任何危害，符合綠色化學(xué)的理念。

綜上所述，本研究探索了CiVCPO催化肟類化合物制備醛酮和醇的新方法，為醛酮及醇結(jié)構(gòu)單元的藥物分子合成提供了新思路。