劉文倩，趙順英，葉維貞，姜鳴鈺，陳文濤，陳青芳，溫少紅，董雯，劉向榮

我國面臨著嚴(yán)重的卒中負(fù)擔(dān)，卒中在所有死亡原因中位列第三，其中缺血性卒中占所有卒中的64.9%[1]。及時(shí)有效的治療能減少缺血性卒中的復(fù)發(fā)、致殘及死亡不良結(jié)局[2-3]。毛柳苷也稱紅景天苷，是我國傳統(tǒng)中藥紅景天的提取物，也是其主要的藥效成分。紅景天具有益氣活血的功效，可用于卒中后偏癱的治療。近年來的研究及本課題組的前期研究均發(fā)現(xiàn)，毛柳苷在缺血性腦損傷后可能通過抑制氧化應(yīng)激、反應(yīng)性膠質(zhì)增生、調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞極化等機(jī)制發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[4-5]，但其作用詳細(xì)的分子機(jī)制尚不十分清楚。

白介素4誘導(dǎo)蛋白1（interleukin-4 induced protein 1，IL4I1）是在IL-4的誘導(dǎo)下產(chǎn)生的一種氨基酸氧化酶，可將苯丙氨酸氧化為苯丙酮酸，該反應(yīng)同時(shí)釋放氨和過氧化氫[6]。IL4I1作為免疫調(diào)節(jié)蛋白參與機(jī)體免疫應(yīng)答的過程[7]。針對(duì)多發(fā)性硬化的研究發(fā)現(xiàn)，IL4I1可調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞極化并促進(jìn)神經(jīng)髓鞘再生[8]。由此推測(cè)毛柳苷可能通過影響IL4I1的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)腦缺血再灌注后小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和炎癥表型變化，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象及藥物 ①實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選取8～12周C57BL/6J雄性小鼠38只，體質(zhì)量20.0±0.5 g（北京華阜康生物科技控股有限公司）。本實(shí)驗(yàn)遵照動(dòng)物倫理相關(guān)要求進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)于22～26 ℃，相對(duì)濕度50%～60%，12 h循環(huán)照明的環(huán)境中，自由攝食水。②小膠質(zhì)細(xì)胞：BV2小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心）復(fù)蘇后，培養(yǎng)于含10%胎牛血清（HyClone，美國）的基礎(chǔ)培養(yǎng)基（HyClone，美國）中。③實(shí)驗(yàn)藥物：毛柳苷粉末（Sigma，美國）按1 mg/mL溶解于生理鹽水后備用。

1.2 模型制作與藥物注射 小鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組4只、腦缺血再灌注后注射毛柳苷組（簡(jiǎn)稱毛柳苷組）17只、腦缺血再灌注后注射生理鹽水組（簡(jiǎn)稱生理鹽水組）17只。

模型制作：小鼠經(jīng)異氟烷麻醉，仰臥位，分離頸總動(dòng)脈起始段，通過頸內(nèi)動(dòng)脈插入線栓至大腦中動(dòng)脈，60 min后拔栓以恢復(fù)血流實(shí)現(xiàn)再灌注，逐層縫合皮膚。手術(shù)期間使用保溫墊，監(jiān)測(cè)小鼠肛溫，保持在37.0±0.5 ℃。激光散斑儀（瑞沃德，中國）檢測(cè)缺血前基線、缺血后60 min的腦血流，缺血后60 min腦血流低于基線水平的30%為模型成功。腦缺血再灌注后10 min，毛柳苷組與生理鹽水組小鼠分別經(jīng)尾靜脈按照10 mg/kg注射毛柳苷與生理鹽水，每天1次，持續(xù)28 d。

1.3 血清IL4I1濃度檢測(cè)

1.3.1 血清制備 采集假手術(shù)組及缺血再灌注（毛柳苷組和生理鹽水組）后48 h、7 d、28 d血清，其中假手術(shù)組4只，缺血再灌注28 d時(shí)每組各5只，其余時(shí)間點(diǎn)每組各4只。使用10%水合氯醛麻醉小鼠，通過摘眼球法獲取全血，靜置2 h后，在常溫下以4000 r/min離心15 min，取上清液即為血清。

1.3.2 ELISA法檢測(cè)血清IL4I1濃度 使用ELISA試劑盒（MyBioSource，美國）檢測(cè)小鼠血清中IL4I1的濃度。設(shè)置2個(gè)復(fù)孔，每孔加入40 μL血清、10 μL IL4I1抗體與50 μL辣根過氧化物酶標(biāo)記生物素，37 ℃下避光反應(yīng)60 min，清洗96孔板5次，先后加入底物溶液A與B各50 μL，37 ℃下避光反應(yīng)10 min，加入50 μL終止液，10 min內(nèi)在450 nm檢測(cè)光密度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣本的IL4I1濃度。

1.4 腦梗死體積測(cè)定 取毛柳苷組與生理鹽水組小鼠各4只，缺血再灌注后7 d取腦并進(jìn)行冰凍切片6層，使用神經(jīng)元特異核蛋白抗體（neuronal nuclei，NeuN）抗體，（Millipore，美國）進(jìn)行免疫熒光染色標(biāo)記6個(gè)層面的神經(jīng)元，以確定梗死體積。通過Vectra Polaris全自動(dòng)成像系統(tǒng)（Perkin-Elmer，美國）拍攝熒光圖片。使用Image J軟件統(tǒng)計(jì)不同層面的腦梗死體積，梗死體積=各層健側(cè)腦組織體積之和-各層損傷側(cè)正常腦組織體積之和。

1.5 小膠質(zhì)細(xì)胞三維形態(tài)及突起長度和數(shù)量分析 取生理鹽水組與毛柳苷組小鼠各4只，缺血再灌注后7 d腦組織冰凍切片，進(jìn)行離子化鈣結(jié)合適配分子1（ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba1）熒光染色標(biāo)記損傷區(qū)周圍小膠質(zhì)細(xì)胞。使用LSM710激光共聚焦顯微鏡Z-stack拍攝小膠質(zhì)細(xì)胞3D圖像，并通過Imaris 9.0.1軟件Filament插件計(jì)算小膠質(zhì)細(xì)胞的突起長度、突起數(shù)量、突起的分叉點(diǎn)數(shù)量及突起的終末端點(diǎn)數(shù)量。

1.6 免疫組織熒光染色 取毛柳苷組與生理鹽水組缺血再灌注后7 d的腦組織冰凍切片，每組各4只小鼠，進(jìn)行Iba1（和光純藥，日本）和CD16/32（BD Pharmingen，美國）及Iba1和CD206（R&D Systems，美國）免疫熒光共染，分別標(biāo)記損傷區(qū)M1和M2型小膠質(zhì)細(xì)胞。使用LSM710激光共聚焦顯微鏡（Carl Zeiss AG，德國）拍攝Iba1分別與CD16及CD206共定位圖像，Image J軟件統(tǒng)計(jì)M1、M2型小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量。

1.7 BV2小膠質(zhì)細(xì)胞不同表型IL4I1表達(dá)測(cè)定

1.7.1 BV2小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)與表型誘導(dǎo) 設(shè)置空白對(duì)照組為M0型小膠質(zhì)細(xì)胞，使用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（10 μg/mL，Sigma，美國）和INF-γ（10 μg/mL，Peprotech，美國）誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞極化為M1型小膠質(zhì)細(xì)胞；使用IL-4（10 μg/mL）（Peprotech，美國）和IL-13（10 μg/mL）（Peprotech，美國）誘導(dǎo)BV2小膠質(zhì)細(xì)胞極化為M2型小膠質(zhì)細(xì)胞。

1.7.2 BV2小膠質(zhì)細(xì)胞蛋白提取 收集M0型及誘導(dǎo)48 h后的M1型和M2型細(xì)胞，每107細(xì)胞使用500 μL放射免疫沉淀法緩沖液（radio immunoprecipitation assay buffer，RIPA）蛋白裂解液（索萊寶，中國）提取小膠質(zhì)細(xì)胞蛋白，4 ℃，12 000 r/min離心20 min，取上清即為細(xì)胞蛋白裂解液。

1.7.3 蛋白印跡測(cè)定BV2小膠質(zhì)細(xì)胞IL4I1表達(dá)使用10%的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（sodium dodecyl sulfonate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）進(jìn)行電泳（每孔40 μg蛋白），后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene，PVDF）。使用含0.1%吐溫20和5%胎牛血清白蛋白的Tris緩沖液室溫封閉膜60 min，兔來源抗鼠IL4I1抗體（博奧森，中國）、鼠來源抗鼠β-Actin抗體（景杰生物科技有限公司，中國）4 ℃孵育過夜，辣根過氧化物酶耦聯(lián)抗兔、抗鼠二抗（CST，美國）室溫孵育1 h，使用化學(xué)發(fā)光試劑盒（Abcam，英國）通過G：BOX化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Syngene，英國）檢測(cè)蛋白條帶，并使用Image J分析圖像計(jì)算IL4I1相對(duì)表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法 使用GraphPad Prism 8.0.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，用表示，單時(shí)間點(diǎn)兩組比較采用獨(dú)立t檢驗(yàn)；單時(shí)間點(diǎn)多組比較采用單因素方差分析，在整體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的情況下進(jìn)行Tukey檢驗(yàn)兩兩比較；多時(shí)間點(diǎn)多組比較采用雙因素方差分析，在整體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的情況下進(jìn)行Bonferroni法兩兩比較。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦缺血再灌注后血清IL4I1的表達(dá) 生理鹽水組腦缺血再灌注后48 h、7 d、28 d與假手術(shù)組相比血清中IL4I1濃度整體差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0235）。兩兩比較發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，生理鹽水組腦缺血再灌注后48 h血清中IL4I1濃度降低（P=0.0302）；生理鹽水組腦缺血再灌注后7 d和28 d較48 h血清中IL4I1濃度有升高趨勢(shì)，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.8160，P=0.2874）。毛柳苷組與生理鹽水組腦缺血再灌注后48 h、7 d、28 d血清中IL4I1濃度整體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.0001），兩兩比較發(fā)現(xiàn)兩組腦缺血再灌注后48 h血清中IL4I1濃度無差異（P=0.1581），毛柳苷組腦缺血再灌注后7 d和28 d血清中IL4I1濃度較生理鹽水組升高（P=0.0229，P=0.0076）。上述結(jié)果提示毛柳苷能促進(jìn)小鼠缺血性腦損傷后早期及恢復(fù)期血清中IL4I1的表達(dá)（表1）。

表1 缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)不同組小鼠血清IL4I1濃度比較[單位：ng/L]

2.2 腦缺血再灌注后7 d腦梗死體積 NueN免疫熒光染色結(jié)果顯示，腦缺血再灌注后7 d毛柳苷組小鼠腦梗死體積顯著低于生理鹽水組腦梗死體積（16.47±5.44 mm3vs.30.20±8.90 mm3，P=0.0389），表明毛柳苷可降低小鼠缺血再灌注后的腦梗死體積（圖1）。

圖1 生理鹽水組和毛柳苷組小鼠缺血再灌注后7 d腦梗死體積比較

2.3 腦缺血再灌注后7 d小膠質(zhì)細(xì)胞三維形態(tài)及突起變化 圖2顯示了腦缺血再灌注后7 d小鼠腦損傷區(qū)周圍小膠質(zhì)細(xì)胞的三維形態(tài)。與生理鹽水組相比，毛柳苷組小膠質(zhì)細(xì)胞的突起長度更長（110.60±24.93 μmvs. 95.64±27.65 μm，P=0.0040），單個(gè)小膠質(zhì)細(xì)胞突起數(shù)量更多（104.60±60.21個(gè)vs. 50.58±33.47個(gè)，P＜0.001），單個(gè)小膠質(zhì)細(xì)胞突起的分叉點(diǎn)數(shù)量（53.43±33.99個(gè)vs. 24.83±16.41個(gè)，P＜0.001）和終末端點(diǎn)數(shù)量（56.03±35.20個(gè)vs. 26.85±17.12個(gè)，P＜0.001）均增多。結(jié)果提示毛柳苷可促進(jìn)小鼠缺血性腦損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞的進(jìn)一步活化，促進(jìn)突起伸長，增加突起分支（圖3）。

圖2 生理鹽水組和毛柳苷組缺血再灌注后7 d腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞三維形態(tài)

圖3 生理鹽水組和毛柳苷組缺血再灌注后7 d腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞突起長度與數(shù)量變化

2.4 腦缺血再灌注后小膠質(zhì)細(xì)胞極化狀態(tài) Iba1+CD16/32+標(biāo)記損傷區(qū)域周圍M1型小膠質(zhì)細(xì)胞，Iba1+CD206+標(biāo)記M2型小膠質(zhì)細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)皮層與紋狀體區(qū)域小膠質(zhì)細(xì)胞總數(shù)量、M1型與M2型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果顯示毛柳苷組與生理鹽水組腦缺血再灌注后7 d皮層及紋狀體區(qū)域小膠質(zhì)細(xì)胞總數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與生理鹽水組相比，毛柳苷組腦缺血再灌注后7 d梗死區(qū)域周圍皮層及紋狀體的M1型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量減少（皮層：P=0.0407，紋狀體：P=0.0032），M2型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著增多（皮層：P=0.0206，紋狀體：P=0.0075）（表2）。上述結(jié)果提示毛柳苷可促進(jìn)小鼠缺血性腦損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型抗炎表型小膠質(zhì)細(xì)胞極化（圖4）。

圖4 生理鹽水組和毛柳苷組缺血再灌注后7 d腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞極化狀態(tài)

表2 生理鹽水組和毛柳苷組缺血再灌注后7 d腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞不同表型數(shù)量[單位：個(gè)/mm2]

2.5 BV2小膠質(zhì)細(xì)胞不同極化表型IL4I1的表達(dá)水平 檢測(cè)BV2小膠細(xì)胞不同表型（M0、M1、M2）中IL4I1的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，三種表型的小膠質(zhì)細(xì)胞IL4I1的表達(dá)差異整體具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.001）。與M0型相比，M1型與M2型BV2小膠質(zhì)細(xì)胞IL4I1表達(dá)均下降（P=0.0008，P=0.0155），M1型與M2型相比IL4I1表達(dá)下降（P=0.0406）。表明小膠質(zhì)細(xì)胞在激活狀態(tài)下降低IL4I1表達(dá)，M1型比M2型下降更多（圖5）。

圖5 BV2小膠質(zhì)細(xì)胞不同極化狀態(tài)下IL4I1表達(dá)情況

3 討論

急性缺血性卒中是致殘率較高的疾病，腦組織損傷后由于氧化應(yīng)激、興奮性毒性作用導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡，造成感覺、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能損傷[9-10]，因此腦缺血后進(jìn)行神經(jīng)保護(hù)治療尤為重要。在本課題組前期的研究中，發(fā)現(xiàn)毛柳苷可通過調(diào)節(jié)小鼠腦缺血再灌注后14 d小膠質(zhì)細(xì)胞極化促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞分化及有髓神經(jīng)纖維髓鞘的再生，從而保護(hù)神經(jīng)功能，減少小鼠腦缺血后的認(rèn)知功能障礙[4]。但前期實(shí)驗(yàn)對(duì)毛柳苷是否影響缺血早期的腦組織損傷范圍并沒有進(jìn)行分析，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在腦缺血損傷早期，毛柳苷可減少腦梗死體積。

IL4I1參與機(jī)體抗感染防御，通過抑制T細(xì)胞增殖分化及限制B細(xì)胞增殖發(fā)揮免疫抑制作用，抑制機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)，參與腫瘤免疫逃逸[11-12]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)缺血性腦損傷發(fā)生后48 h，小鼠血清中IL4I1濃度下降，隨著損傷恢復(fù)到28 d又逐漸回升，而毛柳苷能夠減輕腦缺血后7 d IL4I1水平的下降程度，促進(jìn)恢復(fù)期IL4I1濃度回升。缺血性腦損傷后血清中IL4I1濃度變化與損傷發(fā)生和恢復(fù)相關(guān)，因此IL4I1可能成為新的缺血性腦損傷診斷與預(yù)后的生物標(biāo)志物。

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的固有免疫細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞在生理狀態(tài)下為靜息狀態(tài)（M0），在疾病狀態(tài)下可激活為促炎表型（M1）和抗炎表型（M2）。M1型細(xì)胞分泌IL-1β、TNF-α等促炎細(xì)胞因子介導(dǎo)神經(jīng)炎癥[13]；M2型細(xì)胞則分泌精氨酸酶-1、轉(zhuǎn)化生長因子-β等細(xì)胞因子抑制炎癥反應(yīng)[14]。損傷發(fā)生后小膠質(zhì)細(xì)胞由纖細(xì)分支狀變?yōu)槎毯裢黄鸲喾种?，便于快速地?yīng)答[15-17]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)毛柳苷使缺血區(qū)周圍小膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)出多突起分支狀，增加了小膠質(zhì)細(xì)胞的監(jiān)測(cè)范圍，促使其更快地感知損傷區(qū)域的炎癥并發(fā)揮炎癥調(diào)節(jié)作用。另外，毛柳苷促使腦組織損傷區(qū)周圍的小膠質(zhì)細(xì)胞由M1促炎表型向M2抗炎表型轉(zhuǎn)化。而M2型細(xì)胞的增多有助于損傷區(qū)域的炎癥修復(fù)，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，提示毛柳苷可能通過調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞極化，抑制腦損傷區(qū)域的炎癥，保護(hù)神經(jīng)功能。本實(shí)驗(yàn)中BV2小膠質(zhì)細(xì)胞IL4I1表達(dá)的研究發(fā)現(xiàn)，活化后小膠質(zhì)細(xì)胞不同表型中，IL4I1表達(dá)均降低，其中M1型較M2型細(xì)胞表達(dá)有更明顯的下降趨勢(shì)，提示IL4I1可能在小膠質(zhì)細(xì)胞激活和表型轉(zhuǎn)化中發(fā)揮重要作用。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)缺血性腦損傷后毛柳苷促進(jìn)腦組織IL4I1表達(dá)，且有研究發(fā)現(xiàn)IL4I1可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞/小膠質(zhì)細(xì)胞的極化[8，18]，提示毛柳苷可能通過促進(jìn)缺血性腦損傷后免疫調(diào)節(jié)蛋白IL4I1的表達(dá)，調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活與極化。不過，本實(shí)驗(yàn)中未對(duì)IL4I1在缺血性腦損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞極化中的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制進(jìn)行研究，因此免疫調(diào)節(jié)蛋白IL4I1對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞極化的調(diào)節(jié)作用仍有待深入研究。

【點(diǎn)睛】本研究通過小鼠腦缺血再灌注模型和細(xì)胞培養(yǎng)，探索了毛柳苷在缺血性腦損傷后腦保護(hù)作用的分子機(jī)制，提示毛柳苷可能通過促進(jìn)IL4I1表達(dá)調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞激活與極化，從而達(dá)到神經(jīng)保護(hù)的作用。