周梅 姬文莉 周小軍 禤瑞霞 陳鈺偉 王書芹

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是鼻咽部的惡性腫瘤，具有獨(dú)特的地理分布特點(diǎn)，2018 年國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)報(bào)告的70%以上的新增病例發(fā)生在東亞和東南亞[1]。鼻咽癌在我國(guó)多發(fā)于南方，尤其是兩廣地區(qū)，發(fā)病率有逐年上升趨勢(shì)。鼻咽癌惡性程度較高，具有很強(qiáng)的侵襲性，易發(fā)生局部浸潤(rùn)及頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，很多鼻咽癌患者直到晚期才被診斷，因此存活率較低，如何有效預(yù)測(cè)鼻咽癌的侵襲轉(zhuǎn)移潛能，尋找潛在的分子治療靶點(diǎn)，對(duì)于選擇合適的治療方案及判斷預(yù)后具有重要意義。

NF-КBp65（nuclear transcription factor-p65,NF-КB-p65）是重要的核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，參與調(diào)控機(jī)體多條關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，與多種腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡相關(guān)[2]。據(jù)報(bào)道NF-КB 在多種惡性腫瘤中被激活，如淋巴瘤、胃腸道腫瘤、婦科腫瘤、胸部腫瘤、頭頸部腫瘤和泌尿生殖系腫瘤。但NF-КB 與廣東地區(qū)鼻咽癌的關(guān)系尚未明確，本研究運(yùn)用免疫組化和RT-PCR 的方法檢測(cè)NF-КB p65 蛋白和mRNA 在廣東地區(qū)鼻咽癌組織中的表達(dá)情況，分析其與鼻咽癌各臨床病理指標(biāo)間的關(guān)系，探討NF-КB p65 在鼻咽癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為預(yù)后判斷和靶向治療方面提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

資料與方法

1 一般資料

收集2018 年1 月～2019 年12 月廣東中山市中醫(yī)院病理科存檔鼻咽蠟塊90 例，其中鼻咽癌60 例（男性41 例，女性19 例），本組男性發(fā)病稍高，鼻咽炎組織30 例，鼻咽癌患者的年齡分布為16～80 歲，平均（49.1±14.0）歲。根據(jù)分化程度，鼻咽癌可分為3種組織學(xué)類型:非角化性癌（分化型和未分化型）、角化性和基底樣型鱗狀細(xì)胞癌。鼻咽癌的組織學(xué)分型及分期標(biāo)準(zhǔn)參照2006 年世界衛(wèi)生組織的標(biāo)準(zhǔn)[3]。

2 主要試劑及方法

2.1 免疫組織化學(xué)

NF-КBp65 一抗購(gòu)自Santa Cruz 公司，二抗購(gòu)自福州邁新公司。所有樣本均按照說明書的程序處理。切4μm 厚粘膠白片，用二甲苯和酒精脫蠟，檸檬酸鹽緩沖液高壓修復(fù)抗原4min，加過氧化氫10min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，切片用10%的山羊血清阻斷，NF-КBp65（1:200）一抗孵育2h，二抗孵育30min，DAB 顯色，脫水，封片。

2.2 結(jié)果判定

所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4μm 厚連續(xù)切片，敷貼于10%多聚賴氨酸預(yù)處理的載玻片上。NF-КBp65 蛋白陽性表達(dá)為胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。陽性染色強(qiáng)度評(píng)分：無染色顆粒為0 分，微弱染色顆粒為1 分，清晰染色顆粒且細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色為2 分，細(xì)胞質(zhì)呈深棕色為3 分；陽性細(xì)胞數(shù)評(píng)分：無陽性細(xì)胞為0 分，陽性細(xì)胞數(shù)≤20%為1 分，陽性細(xì)胞數(shù)21%～50%為2 分，陽性細(xì)胞數(shù)>50%為3 分；上述兩項(xiàng)評(píng)分相乘，0～2 分為陰性，≥3 分為陽性表達(dá)。

2.3 提取總RNA 與合成cDNA

取樣本6 片，厚6μm，用QIAquick PCR Purification Kit 試劑盒（美國(guó)，QIAGEN）提取總RNA，測(cè)其純度(紫外分光法)，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega 生物公司）說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將500ng 總RNA 加入20μL 反應(yīng)體系中，經(jīng)37℃15min、85℃5s、4℃延伸，獲得cDNA 后行PCR 檢測(cè)或冰箱（-20℃）保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 RT-PCR 檢測(cè)

檢測(cè)NF-КBp65 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量，RTPCR 具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。反應(yīng)體系：SYBR 10μL，上下游引物各0.4μL，cDNA2μL，加入去離子水至20μL；在實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀上進(jìn)行熱循環(huán)反應(yīng)，PCR 反應(yīng)條件：95℃30min 預(yù)變性；95℃5s，60℃30s，PCR 循環(huán)40 次；溶解并繪制溶解曲線：95℃15s、60℃15s、45℃15s。每份樣本設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3 次。依據(jù)內(nèi)參的標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。引物由上海生工生物公司合成。NFКBp65-上游引物：5'-CGCGGATCCGCCACCATGGA CGAACTG-3'，NF-КBp65-下游引物：5'-CCGCTCG AGTTAGGAGCTGATCTG-3'；內(nèi)參GAPDH-上游引物：5'-TCGACCAGTCAGCCGCATCTTCTTT-3'，GAPDH-下游引物：5'-ACCAAATCCGTTGACTCCG ACCTT-3'。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（版本17.0），數(shù)據(jù)資料以±s 表示，兩組間的比較用t 檢驗(yàn)，各組間頻數(shù)的比較用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05 差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 NF-КBp65 蛋白在鼻咽癌和鼻咽炎組織中的表達(dá)活性比較

采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)NF-КBp65 蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明NF-КBp65 蛋白在鼻咽癌組織中高表達(dá)（圖1A）。在鼻咽炎中低表達(dá)或陰性（圖1B）。NF-КBp65 蛋白在鼻咽癌組織中的陽性表達(dá)率為88.3%，在鼻咽炎組織中的陽性表達(dá)率為60%，NFКBp65 蛋白在鼻咽癌組織中的陽性表達(dá)率明顯高于鼻咽炎組織（P<0.05)，見表1。

表1 NF-КBp65 蛋白在鼻咽癌和鼻咽炎組織中的表達(dá)活性比較

圖1 免疫組化染色

2 NF-КBp65 蛋白表達(dá)與鼻咽癌臨床病理特征的關(guān)系

在鼻咽癌中，NF-КBp65 蛋白的陽性表達(dá)率與鼻咽癌腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM 分期均具有相關(guān)性（P<0.05），腫瘤體積越大、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期越高的鼻咽癌NF-КBp65 蛋白的陽性表達(dá)率越高；但NF-КBp65 蛋白的陽性表達(dá)率與性別、年齡、組織學(xué)分型無顯著相關(guān)性（P>0.05），見表2。

表2 鼻咽癌組織NF-КBp65 蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

3 NF-КBp65 mRNA 在鼻咽癌與鼻咽炎組織中的表達(dá)活性比較

NF-КBp65 mRNA 表達(dá)水平運(yùn)用相對(duì)定量法通過2-ΔΔct計(jì)算。觀察溶解曲線及擴(kuò)增循環(huán)圖，了解擴(kuò)增情況（圖3）。NF-КBp65 mRNA 在鼻咽癌中的相對(duì)表達(dá)量（0.6237±1.2085）明顯高于鼻咽炎組織（0.3414±0.2497），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見圖4。

圖3 熒光定量擴(kuò)增曲線圖

圖4 NF-КBp65mRNA 在鼻咽癌和鼻咽炎中的相對(duì)表達(dá)量

4 NF-КBp65 mRNA 表達(dá)活性與鼻咽癌臨床病理特征的相關(guān)性分析

RT-PCR 結(jié)果顯示，NF-КBp65 mRNA 在鼻咽癌T1 組中的相對(duì)表達(dá)量明顯高于T2+T3 組（P<0.05）；NF-КBp65 mRNA 在鼻咽癌有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的相對(duì)表達(dá)量明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（P<0.05）；NF-КBp65 mRNA 在III-IV 期鼻咽癌組織中相對(duì)表達(dá)量明顯高于I-II 期（P<0.05）；NF-КBp65 mRNA 表達(dá)與鼻咽癌腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況、臨床分期相關(guān)，而與組織學(xué)分級(jí)無顯著相關(guān)性（P>0.05），見表3。

表3 鼻咽癌組織NF-КBp65 mRNA 表達(dá)活性與臨床病理特征的關(guān)系

討論

鼻咽癌具有多個(gè)風(fēng)險(xiǎn)因素，包括愛潑斯坦-巴爾病毒（EBV）感染、遺傳易感性和環(huán)境因素等，其中EB 病毒與鼻咽癌的發(fā)生關(guān)系最密切，血液循環(huán)中的病毒DNA 是檢測(cè)鼻咽癌高度敏感和特異性的檢測(cè)標(biāo)記[4]。由于鼻咽癌的位置較深，與顱底緊密相連，且鼻咽癌具有較強(qiáng)的侵襲性，極易侵犯顱底、咽旁及頸動(dòng)脈鞘等周圍組織結(jié)構(gòu)。鼻咽癌的主要治療手段為放射治療。早期鼻咽癌的治療效果較為顯著，但局部進(jìn)展的鼻咽癌存活期仍不理想。Sun 等[5]研究報(bào)道Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期和Ⅳ期鼻咽癌患者的5年生存率分別為72%、64%、62%和38%。由于早期鼻咽癌的臨床癥狀多不典型，且病變較為隱匿，患者就診時(shí)往往已到中晚期，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及局部復(fù)發(fā)是鼻咽癌治療失敗的主要原因，然而目前為止鼻咽癌轉(zhuǎn)移的分子病理機(jī)制尚未完全闡明。

NF-КB 家族參與許多信號(hào)傳導(dǎo)途徑，失調(diào)可導(dǎo)致包括癌癥和炎癥疾病在內(nèi)的多種疾病[6]。它涉及調(diào)節(jié)大約150 個(gè)基因的激活，這些基因涉及從免疫反應(yīng)到代謝多種功能[7]。NF-КB 信號(hào)系統(tǒng)是一個(gè)高度動(dòng)態(tài)的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，由相互調(diào)節(jié)的幾種成分組成，該系統(tǒng)包括五個(gè)轉(zhuǎn)錄單體，兩個(gè)前體蛋白，三個(gè)包含抑制性IКB 蛋白的錨蛋白重復(fù)序列，三個(gè)刺激反應(yīng)抑制激酶（IKK 復(fù)合物：IKK-α 和IKK-β，以及IKK-γ 或NF-КB 必需調(diào)節(jié)劑/NEMO）和錨蛋白重復(fù)序列[8]。NF-КB 家族共有五個(gè)成員，p65（RelA），RelB，c-Rel，p105/p50（NF-КB1）和p100/52（NF-КB2）[9]，NF-КB p65 亞基被認(rèn)為是該家族中最有效的轉(zhuǎn)錄激活因子[10]，p65 在細(xì)胞質(zhì)中與p50 形成穩(wěn)定的異二聚體[11]，在未受刺激的細(xì)胞中，p65-p50 二聚體與КB 蛋白抑制劑(IКB)結(jié)合，經(jīng)典激活途徑通常由NEMO 依賴的IKK 激活觸發(fā)，IКB 蛋白磷酸化，隨后泛素化并被蛋白酶體降解，隨后，p65/p50 異二聚體轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核[10]，異二聚體通過保守的Rel 同源區(qū)域（RHR）與目標(biāo)DNA 調(diào)控元件結(jié)合[12]，與DNA 結(jié)合后，p65 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活受兩個(gè)反式激活域（TAD）TAD1 和TAD2 的控制，通過TAD1 和TAD2 介導(dǎo)的蛋白質(zhì)相互作用，在目標(biāo)基因的啟動(dòng)子處募集轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，最終導(dǎo)致RNA聚合酶II（RNA pol-II）的募集和基因的表達(dá)激活[13]。

研究發(fā)現(xiàn)NF-КB 在乳腺、肺、膀胱和卵巢癌中過表達(dá)，NF-КB 的過表達(dá)進(jìn)一步促進(jìn)了腫瘤的發(fā)展[14]。該信號(hào)系統(tǒng)可能促成鼻咽癌的發(fā)生，其與EBV 感染和大量淋巴樣浸潤(rùn)密切相關(guān)。從本研究結(jié)果分析可以看出，在鼻咽癌中，NF-КB p65 蛋白和mRNA 的陽性表達(dá)率明顯高于鼻咽炎組織（P<0.05）；且NFКBp65 蛋白的陽性表達(dá)率與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期相關(guān)（P<0.05）；NF-КBp65 mRNA 在不同腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期中的相對(duì)表達(dá)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），在腫瘤較大、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期較高的鼻咽癌中NFКBp65 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量越高，NF-КBp65 蛋白和mRNA 表達(dá)與鼻咽癌臨床病理諸因素的關(guān)系密切，提示NF-КBp65 表達(dá)越高的鼻咽癌增殖速度越快，侵襲性越強(qiáng)，易發(fā)生轉(zhuǎn)移，臨床分期越晚，預(yù)后越差，NF-КBp65 可能參與鼻咽癌的發(fā)生和發(fā)展，NF-КBp65 過表達(dá)可能是判斷鼻咽癌患者預(yù)后的獨(dú)立因素。NF-КB 信號(hào)的異常激活導(dǎo)致調(diào)控凋亡、增殖、轉(zhuǎn)移和放射治療抗性的各種基因的異常表達(dá)[15]，是癌癥治療的靶點(diǎn)[16]，臨床試驗(yàn)已發(fā)現(xiàn)用于NF-КB通路靶向治療的不同分子抑制劑，通過抑制其活性，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞的耐藥、提高抗腫瘤藥物的敏感性、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡等作用，從而提高抗腫瘤治療的療效[17]。

綜上所述，NF-КBp65 與鼻咽癌的臨床病理特征有關(guān)，其過度表達(dá)與預(yù)后不良有密切關(guān)系，提示NF-КBp65 可能參與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展過程，NFКBp65 高表達(dá)在鼻咽癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用，本研究可能為研究鼻咽癌發(fā)生機(jī)制和治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。