林杏儀，田振烽，潘樂樂，蘇銘昕，陳茵婷

胰腺癌是一種惡性程度極高的消化道腫瘤，5 年生存率仍低于10%。由于缺乏典型的癥狀和體征，大多數(shù)胰腺癌初診時(shí)，已處于腫瘤晚期，甚至伴有淋巴結(jié)、肝臟等遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［1］。轉(zhuǎn)移是胰腺癌患者死亡的主要因素。胰腺癌特殊的腫瘤微環(huán)境可通過多種方式促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移，如上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)移前生態(tài)位形成（pre?metastatic niche forma?tion）。其中，轉(zhuǎn)移前生態(tài)位是指原發(fā)腫瘤可以在轉(zhuǎn)移部位形成支持性微環(huán)境。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（cir?culating tumor cells，CTCs）是指從原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤脫落進(jìn)入血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞群，常被認(rèn)為是腫瘤轉(zhuǎn)移的“種子”［2］。CTCs 可能優(yōu)先種植于轉(zhuǎn)移前生態(tài)位已形成的器官，因?yàn)檫@些部位能提供適合的“土壤”供“種子”生長［3，4］。CTCs 還可以與其他類型的細(xì)胞，如免疫細(xì)胞、血小板、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞形成特殊的相互作用。例如，在乳腺癌中，中性粒細(xì)胞可以通過這種相互作用，提高CTCs 的轉(zhuǎn)移潛力［5］。CTCs 可以單個(gè)細(xì)胞或細(xì)胞簇的形式存在，有研究報(bào)告，細(xì)胞簇比單個(gè)細(xì)胞更易于轉(zhuǎn)移［6］。

代謝重編程被認(rèn)為是腫瘤的標(biāo)志［7］，為了應(yīng)對腫瘤微環(huán)境中低氧、營養(yǎng)物質(zhì)有限等限制，腫瘤細(xì)胞通過代謝重編程來支持細(xì)胞的生長和增殖。胰腺癌細(xì)胞具有廣泛代謝重編程，例如糖代謝、谷氨酰胺代謝等改變。該重編程由癌基因介導(dǎo)的自主通路、獨(dú)特的腫瘤微環(huán)境以及腫瘤與周圍非癌細(xì)胞的相互作用共同驅(qū)動(dòng)［8］。然而胰腺癌CTCs 發(fā)生的代謝重編程、機(jī)制及其作用仍未明確。

本研究旨在通過對CTCs 的生物信息學(xué)分析，探索CTC 的代謝重編程可能的機(jī)制，并研究其中關(guān)鍵基因的臨床意義，為后續(xù)研究CTCs 與胰腺癌轉(zhuǎn)移的研究提供重要的分子基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)資料搜集

于 GEO 基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）檢索胰腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circu?lating tumor cells，CTCs）相關(guān)基因芯片信息。納入標(biāo)準(zhǔn)：①種屬為人類（Homo sapiens）；②同時(shí)具備原位腫瘤組織樣本和CTCs樣本信息；③未經(jīng)化療或其他藥物處理；④具有全基因組RNA表達(dá)譜。經(jīng)檢索后，符合的數(shù)據(jù)集有：GSE118556［9］和 GSE18670［10］。其中前者來源于胰腺癌細(xì)胞系PANC?1，后者來源于臨床胰腺癌患者的樣本，本研究中，后者為驗(yàn)證數(shù)據(jù)集。

1.2 數(shù)據(jù)集PCA 主成分分析、差異基因（differen?tially expressed gene，DEGs）篩選

在R（version 4.1.2）中利用R 包“GEOquery”進(jìn)行數(shù)據(jù)集下載、探針?基因名轉(zhuǎn)換以及總體表達(dá)譜的可視化。采用“FactoMineR”及“factoextra”包進(jìn)行PCA 主成分分析。利用“l(fā)imma”包進(jìn)行DEGs 分析，可獲得差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）、P值、校正P值等數(shù)據(jù)。兩數(shù)據(jù)集均以|FC|≥ 1.5 且校正P值<0.05 為閾值篩選DEGs?；蛟跀?shù)據(jù)集中的表達(dá)情況通過“pheatmap”包可視化。對GSE118556 基因集體內(nèi)組和體外組DEGs 的上調(diào)基因、下調(diào)基因分別取交集，獲得共同上調(diào)及共同下調(diào)基因，共同上、下調(diào)基因統(tǒng)稱為共同DEGs。共同上/下調(diào)基因的火山圖和韋恩圖可視化分別通過R 包“EnhancedVolcano”和“VennDiagram”實(shí)現(xiàn)。

1.3 GO 和 KEGG 通路富集

利用 DAVID 網(wǎng)站（https：//david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行GO 富集分析，并以“ggplot2”可視化。為研究DEGs 的代謝重編程情況，從KEGG 數(shù)據(jù)庫的615條通路中提取了92 條代謝通路，并從中提取了1703 個(gè)代謝相關(guān)基因。對代謝相關(guān)基因與共同DEGs取交集，獲取代謝相關(guān)DEGs。在R中，對代謝相關(guān) DEGs 利用“clusterProfiler”R 包［11］進(jìn)行 KEGG通路富集并可視化。

1.4 蛋白互作（protein?protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將代謝 相 關(guān) DEGs 導(dǎo) 入 STRING（https：//cn.string?db.org/）進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，隱藏?zé)o連接節(jié)點(diǎn)后，利用Cytoscape 軟件可視化并計(jì)算節(jié)點(diǎn)的連線（degree）。

1.5 TKT 生存分析和與臨床病理分期的關(guān)系

從 UCSC Xena（https：//xenabrowser.net/datapag?es/）中下載TCGA 胰腺癌臨床信息及基因表達(dá)矩陣，使用“survival”和“survminer”R 包，Kaplan?Meier方法來繪制OS 曲線。使用“ggpubr”和“ggplot2”對TKT 和臨床病理分期、腫瘤分級等進(jìn)行分析并繪制箱式圖，TKT 表達(dá)水平以中位數(shù)（四分位數(shù)）來表示。兩組間的比較采用t檢驗(yàn)。

1.6 TIMER 數(shù)據(jù)庫分析

使用TIMER（Tumor IMmune Estimation Resource）數(shù)據(jù)庫（https：//cistrome.shinyapps.io/timer/）對TKT、TKTL1、TKTL2 與腫瘤免疫細(xì)胞浸潤水平相關(guān)性進(jìn)行分析。研究的腫瘤免疫細(xì)胞包括：B 細(xì)胞（B cell）、CD8+T 細(xì) 胞（CD8+T cell）、CD4+T 細(xì) 胞（CD4+T cell）、巨噬細(xì)胞（macrophage）、中性粒細(xì)胞（neutrophil）和樹突狀細(xì)胞（dendritic cell）。P<0.05時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 篩選差異基因

GSE118556 數(shù)據(jù)集中，作者把親本胰腺癌細(xì)胞 PANC?1（即 PANC?1?P，in vitro）注射到 SCID 小鼠皮下。一月后，心臟穿刺獲取約1mL 小鼠血液，處理并鑒定后獲得循環(huán)腫瘤細(xì)胞PANC?1?CTC（in vitro）。再將上述兩種細(xì)胞分別注射至小鼠腹壁使其成瘤，分別獲得PANC?1?P（in vivo）與PANC?1?CTC（in vivo）樣本。數(shù)據(jù)集所有樣本的總體表達(dá)譜情況如圖1A 箱式圖所示，并對其進(jìn)行PCA 主成分分析（圖1B），可見P 組（親本組）與CTCs 組兩個(gè)分組有明顯的差異。進(jìn)一步對四組樣本的基因表達(dá)譜分析，分別分析體外組（in vitro）和體內(nèi)組（in vivo）：以各自的親本組（PANC?1?P）為對照組，CTCs 組為實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行差異分析，從而獲得兩組差異基因（differentially expressed genes，DEGs）。以差異倍數(shù)≥ 1.5，校正P值<0.05 作為篩選 DEGs 的閾值。詳見圖1C，其中體外組DEGs 共7215 個(gè)，體內(nèi)組DEGs共3337個(gè)。如圖1D的韋恩圖所示，體外組上調(diào)基因5245 個(gè)，下調(diào)基因1970 個(gè)；體內(nèi)組上調(diào)基因1594 個(gè)，下調(diào)基因1743 個(gè)。在兩組均上調(diào)的基因有536 個(gè)，298 個(gè)基因均下調(diào)。將共同上調(diào)和下調(diào)的基因合并，形成本數(shù)據(jù)集的共同DEGs，共834 個(gè)基因。

圖1 GSE118556 差異基因分析

2.2 基因本體（gene ontology，GO）分析

為進(jìn)一步了解共同DEGs 在細(xì)胞內(nèi)的生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular com?ponent，CC）、分子功能（molecular function，MF）情況，利用GO 數(shù)據(jù)庫富集DEGs，并對P值小于0.05的組分進(jìn)行分析。如圖2 所示，在生物過程（BP）方面，主要與RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的正性轉(zhuǎn)錄調(diào)控（positive regulation of transcription from RNA poly?meraseⅡpromoter）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（signal transduction）、和DNA 模板的轉(zhuǎn)錄負(fù)調(diào)控（negative regulation of transcription，DNA?templated）相關(guān)。在細(xì)胞組分（CC），DEGs 主要與胞質(zhì)（cytosol）、胞外外泌體（extracellular exosome）、和胞膜（membrane）相關(guān)。而DEGs 的分子功能（MF）主要集中在：蛋白結(jié)合（protein binding）、鈣離子結(jié)合（calcium ion bind?ing）、和序列特異的 DNA 結(jié)合（sequence?specific DNA binding）。

圖2 GSE118556的基因本體（GO）富集分析

2.3 CTCs 的代謝重編程

為了進(jìn)一步探索CTCs 中代謝重編程的情況，筆者進(jìn)一步分析了KEGG 通路數(shù)據(jù)庫和共同DEGs。從KEGG 數(shù)據(jù)庫的92 條代謝物富集途徑中，提取1703 個(gè)代謝相關(guān)基因。而同時(shí)出現(xiàn)在代謝相關(guān)基因和共同DEGs 的基因有66 個(gè)，所有代謝相關(guān)DEGs 在數(shù)據(jù)集中的表達(dá)情況如圖3A 所示，對代謝相關(guān)DEGs 進(jìn)行KEGG 通路富集分析，以校正P值＜0.05 為界限，通路富集情況見表1。其中，如圖3B 所示，基因富集前三位的代謝通路為半胱氨酸與蛋氨酸代謝（cysteine and methionine metabolism）、一碳代謝（carbon metabolism）和輔酶因子的生物合成（biosynthesis of cofactors）。說明這三條代謝通路可能在PANC?1 的CTCs 形成上起關(guān)鍵作用。為了解代謝相關(guān)DEGs 所編碼蛋白的相互作用，利用STRING 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，并以Cytoscape 軟件可視化。如圖3C 所示，其中GOT2（glutamic?oxaloacetic transaminase 2，谷草轉(zhuǎn)氨酶2）、TKT（transketolase，轉(zhuǎn)酮醇酶）與較多節(jié)點(diǎn)（基因）連接，說明兩基因處于該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的中心地位。

圖3 GSE118556 代謝相關(guān)DEGs

2.4 臨床數(shù)據(jù)集驗(yàn)證代謝重編程

由于數(shù)據(jù)集GSE118556 的樣本基于胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC?1，因此筆者利用來源于臨床樣本的GSE18670 數(shù)據(jù)集里面的部分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。提取數(shù)據(jù)集中的腫瘤樣本和CTCs 樣本數(shù)據(jù)，以腫瘤樣本為對照組，CTCs 樣本為實(shí)驗(yàn)組。提取的兩組樣本的PCA 主成分分析見圖4A，可見兩組樣本的差異較大，可進(jìn)行后續(xù)的差異分析。利用“l(fā)imma”包在R 中進(jìn)行差異分析，仍以差異倍數(shù)≥1.5，校正P值＜0.05 為閾值，篩選獲得 1119 個(gè) DEGs，其中539 個(gè)上調(diào)基因，580 個(gè)下調(diào)基因，詳見圖4B。與代謝相關(guān)基因比對，發(fā)現(xiàn)DEGs 中有106 個(gè)代謝相關(guān)基因，其在數(shù)據(jù)集的表達(dá)情況如圖4C。對這些基因進(jìn)行KEGG 通路富集，發(fā)現(xiàn)前三位的富集通路分別為一碳代謝（carbon metabolism）、嘌呤代謝（purine metabolism）、甘油磷脂代謝（glycerophos?pholipid metabolism），如圖4D。如表1 所示，一碳代謝通路同時(shí)在GSE118556 數(shù)據(jù)集的代謝通路富集中處于第二位，說明一碳代謝通路可能在CTCs形成和維持中可能起關(guān)鍵作用。在兩數(shù)據(jù)集的一碳代謝通路中，TKT 在兩者中均出現(xiàn)差異表達(dá)并上調(diào)，因此TKT 可能在一碳代謝通路中起關(guān)鍵的調(diào)控作用。

表1 GSE118556 及GSE18670 差異基因KEGG 代謝通路富集分析

圖4 GSE18670 臨床數(shù)據(jù)集驗(yàn)證

2.5 TKT 與預(yù)后和腫瘤分期的關(guān)系

經(jīng)上述生物信息學(xué)分析，TKT 可能發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用，因此利用TCGA 胰腺癌臨床數(shù)據(jù)庫，對TKT的臨床意義進(jìn)行分析。如圖5A所示，TKT高表達(dá)時(shí)患者的總體生存時(shí)間（overall survival，OS）顯著下降（P=0.00082）。在分期方面（圖5B），分別與I 期對比，IIA 期與IIB 期的患者的TKT 水平顯著升高（P=0.00091，P=0.0031）。在組織學(xué)分級中（圖5C），G2 和G3 期患者的TKT 表達(dá)均較G1 期明顯上調(diào)（P=0.02，P=0.0078）。而對于胰腺癌TNM 分期，描述原發(fā)腫瘤的T 分期中（圖5D），T1、T2、T3 期患者的TKT 水平呈逐漸上升的趨勢，但是只有T2 和T3期的TKT 水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.01385）。而N0和 N1 期，M0 和 M1 期的 TKT 水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，詳見圖5E、F。

圖5 TKT 表達(dá)與預(yù)后、腫瘤分期的關(guān)系

2.6 TKT 表達(dá)與免疫浸潤水平

采用TIMER 數(shù)據(jù)庫分析TKT 與免疫浸潤水平的相關(guān)性。如圖 6 所示，TKT 與 B 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞呈正相關(guān)的關(guān)系，但是沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。而同樣編碼TKT（轉(zhuǎn)酮醇酶）同工酶的基因TKTL1 和TKTL2［12］與免疫浸潤有顯著相關(guān)性：TKTL1 與 B 細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞水平均有顯著相關(guān)性（P<0.05），且均為正相關(guān)（r>0）；TKTL2 表達(dá)只與巨噬細(xì)胞水平顯著相關(guān)（r=-0.179，P=0.0191）。

圖6 胰腺癌中TKT、TKTL1、TKTL2 表達(dá)水平與免疫浸潤水平的相關(guān)性

3 討 論

本研究通過對數(shù)據(jù)集GSE118556 和GSE18670表達(dá)譜的差異分析和KEGG 代謝通路富集分析發(fā)現(xiàn)，一碳代謝為排名較前的富集通路，由此推測一碳代謝可能在胰腺癌CTCs 形成和維持中起關(guān)鍵作用。而一碳代謝相關(guān)基因TKT 在兩個(gè)數(shù)據(jù)集的DEGs 中重復(fù)出現(xiàn)，TKT 可能在整個(gè)調(diào)控過程中處于中心地位。生存分析發(fā)現(xiàn)，TKT 表達(dá)水平高的胰腺癌患者，總體生存期更短。此外，TKT 的表達(dá)水平與腫瘤分期、組織學(xué)分級、T 分期相關(guān)。而編碼 TKT 的同工酶基因 TKT、TKTL1、TKTL2 中，TKTL1、TKTL2 均不同程度上調(diào)，與免疫浸潤水平相關(guān)。

癌細(xì)胞通過重新調(diào)整自身的代謝來支持其增強(qiáng)的增殖水平。本研究發(fā)現(xiàn)，一碳代謝在PANC?1小鼠胰腺癌模型和胰腺癌患者CTCs 中，均位于富集的代謝通路前列。一碳代謝包括葉酸和蛋氨酸循環(huán)，通過此途徑，細(xì)胞產(chǎn)生一碳單元（也稱為甲基），并用于合成重要的代謝前體和甲基化反應(yīng)。首先，嘌呤和嘧啶核苷酸的生物合成都需要一碳單元。癌細(xì)胞的增殖能力普遍增強(qiáng)，因此對于核苷酸的需求增加，通過增強(qiáng)一碳代謝以應(yīng)對需求。其次，一碳代謝為癌細(xì)胞內(nèi)的甲基化反應(yīng)提供甲基供體。腫瘤細(xì)胞常出現(xiàn)DNA 甲基化模式的改變，一碳代謝產(chǎn)生的SAM（S?腺苷甲硫氨酸）可以為蛋白質(zhì)翻譯后修飾的甲基化、DNA 甲基化、調(diào)節(jié)RNA 甲基化的過程［13］提供甲基。此外，一碳單元還能影響NADH/NADPH 的產(chǎn)生，從而改變多種代謝和合成途徑［14］。本研究中發(fā)現(xiàn)，CTCs 內(nèi)一碳代謝通路相關(guān)基因表達(dá)升高，證明了CTCs 可能有著比一般癌細(xì)胞更強(qiáng)的增殖能力，并且部分蛋白質(zhì)、DNA 的甲基化水平可能出現(xiàn)改變。

此外，我們發(fā)現(xiàn)在兩個(gè)數(shù)據(jù)集的一碳代謝通路中，TKT 均顯著性升高。TKT 基因編碼的TKT（轉(zhuǎn)酮醇酶）催化磷酸戊糖途徑中幾個(gè)非氧化分支的關(guān)鍵反應(yīng)，這些反應(yīng)在利用葡萄糖合成核糖的過程中起關(guān)鍵作用。TKT 已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)與阿爾茲海默病、糖尿病等疾病相關(guān)［15，16］。某些腫瘤細(xì)胞甚至有超過85%的核糖是通過該途徑合成。TKT 的上調(diào)，使得腫瘤細(xì)胞能夠在非氧化的情況下利用葡萄糖合成核糖［17］，而胰腺癌周圍充滿間質(zhì)細(xì)胞而缺少血管，處于缺氧的微環(huán)境中，TKT 的上調(diào)大大增強(qiáng)癌細(xì)胞在缺氧情況下的生存能力。

此外，以往的研究發(fā)現(xiàn)CTCs 可以與免疫細(xì)胞相互作用。有研究報(bào)道，CTCs 與白細(xì)胞（WBC）相互作用形成的CTC?WBC 簇會(huì)加速乳腺癌小鼠的轉(zhuǎn)移發(fā)生［18］。而在轉(zhuǎn)移性乳腺癌研究中，發(fā)現(xiàn)CTCs 的數(shù)量和中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的比率（NLR）相關(guān)，且CTCs 和 NLR<3 的患者，疾病復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)高8 倍［19］。本研究中，編碼轉(zhuǎn)酮醇酶（TKT）的同工酶的三個(gè)基因（TKT、TKTL1、TKTL2）中，TKTL1、TKTL2 均與免疫浸潤相關(guān)，說明轉(zhuǎn)酮醇酶的上調(diào)可能與CTCs 轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)相關(guān)。

本研究創(chuàng)新地把胰腺癌CTCs 與代謝重編程聯(lián)系在一起，并發(fā)現(xiàn)CTCs 中一碳代謝通路上調(diào)、通路中的TKT 顯著上調(diào)且與預(yù)后相關(guān)。因此CTCs可能是由于胰腺癌細(xì)胞內(nèi)一碳代謝的改變，增殖能力增強(qiáng)，并造成腫瘤細(xì)胞脫落并進(jìn)入血液循環(huán)，從而使腫瘤轉(zhuǎn)移到其他部位。然而本研究僅對GEO 數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)集進(jìn)行生物信息學(xué)分析，仍需要進(jìn)一步的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證一碳代謝對CTCs 的影響。另外，一碳代謝影響CTCs 的具體機(jī)制和作用仍有待深入探索。

綜上所述，本研究為一碳代謝在CTCs 生成和維持的代謝重編程中的作用提出了新的觀點(diǎn)。一碳代謝和TKT 的靶向治療，可能會(huì)為減緩胰腺癌腫瘤轉(zhuǎn)移提供新的可能。