張洋璠，文金鋇，嚴(yán)穎哲，黃曉燕，譚梓聰，楊浩杰，紀(jì)風(fēng)濤

七氟烷是臨床上常用的吸入性麻醉藥，具有誘導(dǎo)迅速和蘇醒快的特點(diǎn)，被廣泛用于全身麻醉的誘導(dǎo)和維持［1］。然而部分研究表明，三歲以下兒童或者妊娠中晚期的婦女在手術(shù)中重復(fù)或長時間地接受七氟烷麻醉可能會影響兒童的大腦發(fā)育，引起不同程度的認(rèn)知功能損害［2］。不僅影響患者的生活質(zhì)量，而且給家庭、社會帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。

目前關(guān)于吸入性麻醉藥所引起的發(fā)育期的神經(jīng)毒性的作用機(jī)制主要包括神經(jīng)元的凋亡、突觸損傷和炎癥因子的釋放等［3］。部分研究表明，線粒體在維持神經(jīng)元穩(wěn)態(tài)上起了關(guān)鍵的作用并且通過提供能量參與了許多信號傳導(dǎo)的過程，多種神經(jīng)退行性疾病和衰老也被認(rèn)為具有線粒體功能障礙和神經(jīng)炎癥的特點(diǎn)［4］。ATP 是大腦能量代謝的主要供能物質(zhì)，而線粒體是ATP 產(chǎn)生的主要部位，也是細(xì)胞氧化損傷時過量ROS 生成的主要場所，線粒體DNA 易受到較高水平的ROS 誘導(dǎo)損傷，導(dǎo)致ATP 生成減少［5］。所以，我們想要研究吸入性麻醉藥七氟烷誘導(dǎo)引起的神經(jīng)凋亡與線粒體的氧化應(yīng)激和能量代謝水平變化的關(guān)系［6］。

基于七氟烷引起的神經(jīng)凋亡可能是通過誘導(dǎo)線粒體功能障礙的設(shè)想，本實(shí)驗(yàn)建立了七氟烷引起的原代神經(jīng)元凋亡模型。目前，七氟烷引起神經(jīng)元凋亡的模型常使用細(xì)胞系，如H4 膠質(zhì)瘤細(xì)胞、SH?SY5Y 類神經(jīng)樣細(xì)胞等，但這些細(xì)胞系仍然具有一定的異質(zhì)性和瘤性，不能很好地模擬神經(jīng)元細(xì)胞的特性。因此，我們使用原代神經(jīng)元替代細(xì)胞系進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑 麻醉呼吸機(jī)（Datex Ohmeda）、熒光顯微鏡（Olympus IX83），抗?MAP2抗體（ab5392，Abcam），抗?Caspase?3 抗體（9664S，CST），Neuro?basal?A 培養(yǎng)基（10888022，GIBCO）、B27（17504?011，GIBCO），胰酶，多聚賴氨酸（27964?99?4，Sig?ma?Aldrich），DCFH?DA 活性氧試劑盒（S0033S，碧云天），Annexin V?FITC/PI 凋亡檢測試劑盒（AP001?100，ESscience），ATP 試劑盒（S0026，碧云天）和防熒光淬滅劑（S2100，Solarbio）

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物 出生1 天以內(nèi)的SD 乳鼠購自中山大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心，許可證為SYXK（粵）2016?0112，在整個實(shí)驗(yàn)過程中對動物的處置均符合動物倫理要求。

1.2 方法

1.2.1 原代神經(jīng)元的培養(yǎng) 出生1 天以內(nèi)的SD 乳鼠，75%的酒精消毒后斷頸，在冰上迅速分離海馬組織，剪碎成大小約1 mm3的組織塊，用脫氧核糖核酸酶和0.125%的胰蛋白酶消化10~15 min 后置于 37 于、5%CO2培養(yǎng)箱中，1000 r/min 離心 10 min，計數(shù)并以每孔7×種入多聚賴氨酸提前包被過的小皿中，置于37 多、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)，待4 小時后神經(jīng)元貼壁后換神經(jīng)元完全培養(yǎng)基（Neu?robasal?A+2%B27+0.5 mM L?谷氨酰胺）培養(yǎng)，培養(yǎng)48~72 h 后可見周圍形成突起，7 天后可見樹突延長，相鄰多個神經(jīng)元軸突樹突相互交錯形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)［7］。

1.2.2 原代神經(jīng)元的鑒定 原代神經(jīng)元提取7 天后用4%多聚甲醛固定20 min，破膜后使用PBST溶液洗3 次，封閉1 h，加入一抗成熟神經(jīng)元特異性標(biāo)志物 MAP2 抗體孵育 12 h，PBST 洗 3 次，相應(yīng)二抗常溫孵育 1 h，PBST 洗 3 次后，滴加 DAPI 及滴加防熒光淬滅劑，全自動倒置熒光顯微鏡拍攝。

1.2.3 建立七氟烷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡模型 將培養(yǎng)好的原代神經(jīng)元放入連有進(jìn)氣孔和出氣孔的密閉容器內(nèi)，將進(jìn)氣孔與揮發(fā)罐相連，用監(jiān)護(hù)儀檢測容器的七氟烷、CO2和O2濃度，待密閉容器中七氟烷濃度達(dá)到4.1%，CO2和O2濃度分別為5%和95%時，密封該容器，并放置于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。處理結(jié)束時，再次檢測容器內(nèi)的七氟烷濃度［8］。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)分組成熟的神經(jīng)元被分成2 組 ①對照組（con）：神經(jīng)元在5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 小時；②七氟烷組（sevo）：神經(jīng)元在5% CO2、4.1%七氟烷的密閉容器內(nèi)培養(yǎng)6 小時［8］。

1.2.5 Western bolt 檢測 蛋白水平的表達(dá)細(xì)胞接受七氟烷處理6 h 后加入適量裂解液，刮取蛋白，離心30 min 后，收取上清液。使用BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量，30 μg 上樣量加入到上樣孔中，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后分別用Cleaved caspase?3、β?actin一抗4 ℃孵育12 h，TBST 洗膜3 次，相應(yīng)二抗室溫孵育2 h，ECL 化學(xué)發(fā)光法曝光。

1.2.6 Annexin V?FITC/PI 凋亡檢測 消化收集處理后的各組細(xì)胞，用PBS 洗滌2~3 次后用500 μL 1×Binding Buffer 重懸，加入 5 μL Annexin V?FITC和10 μL PI 輕輕混勻，室溫避光孵育10 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.2.7 ROS 檢測 收集細(xì)胞后重懸于稀釋好的DCFH?DA，37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，每隔5 min 搖晃混勻，再用 PBS 洗滌 2~3 次，流式細(xì)胞儀檢測DCF 熒光強(qiáng)度。

1.2.8 ATP 檢測 種于六孔板中的細(xì)胞吸去培養(yǎng)液，加入200 μL 裂解液，并收集裂解液，裂解后4 ℃12 000 g 離心5 分鐘，取上清用于后續(xù)測定并配置ATP 工作液，每個檢測孔中加入100 μL ATP檢測試劑，相應(yīng)檢測孔中加入20 μL 的樣品，酶標(biāo)儀測定Luminometer。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算ATP 的釋放量。

1.2.9 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

取新生大鼠的海馬組織進(jìn)行原代神經(jīng)元體外培養(yǎng)，培養(yǎng)至7 天左右，可見神經(jīng)元細(xì)胞周圍形成多個較長的突起，并相互連接交織成網(wǎng)（圖1A），用神經(jīng)元特異性標(biāo)志物微管相關(guān)蛋白（microtuble association protein?2，MAP2）對提取神經(jīng)元進(jìn)行免疫熒光染色鑒定（圖1B），結(jié)果顯示神經(jīng)元純度高達(dá)90%，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Western Blot 結(jié)果顯示，七氟烷組的Cleaved caspase?3 蛋白顯著上調(diào)（圖1D，P<0.01），提示神經(jīng)元的凋亡增加。4.1%七氟烷處理神經(jīng)元6 h 后，神經(jīng)元的凋亡率較對照組增加（圖1E，P<0.05）。細(xì)胞內(nèi)ROS 水平檢測結(jié)果顯示七氟烷組的綠色熒光強(qiáng)度顯著高于實(shí)驗(yàn)組（圖1F，P<0.05）。同時ATP 含量檢測結(jié)果表明，與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組在七氟烷誘導(dǎo)后，ATP 水平下調(diào)（圖1G，P<0.05）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示七氟烷可引起原代神經(jīng)元凋亡，同時伴有神經(jīng)元內(nèi)ROS 含量增加和ATP 的生成減少。

圖1 七氟烷誘導(dǎo)原代神經(jīng)元的凋亡、氧化應(yīng)激和降低ATP 的水平

3 討 論

關(guān)于麻醉藥對嬰幼兒發(fā)育期神經(jīng)系統(tǒng)的影響，是臨床麻醉的熱門議題之一［9］。目前，也有較多的研究表明麻醉藥具有一定的神經(jīng)毒性，但其潛在機(jī)制尚不明確［10］。七氟烷在細(xì)胞水平上可以引起多種反應(yīng)，包括炎性因子的釋放、Ca2+平衡失調(diào)、氧化應(yīng)激和凋亡反應(yīng)等，且這種神經(jīng)元的凋亡屬于不可逆性的壞死［11］。

本研究結(jié)果表明，在七氟醚的作用下，神經(jīng)元Cleaved caspase?3 表達(dá)增加，伴有 ATP 生成減少。根據(jù)經(jīng)典研究可知，ATP 主要通過細(xì)胞線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生［12］。線粒體損傷后，線粒體膜cyt?c釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)而激活Caspase?3 級聯(lián)反應(yīng)，使Cleaved caspase?3 表達(dá)增加。因此，七氟烷可能通過損傷線粒體，從而引起神經(jīng)元的凋亡。另外，神經(jīng)元作為神經(jīng)系統(tǒng)最基本的結(jié)構(gòu)，其主要生理過程如神經(jīng)的傳導(dǎo)、遞質(zhì)的釋放等，高度依賴ATP的作用。因此，七氟烷可能影響神經(jīng)系統(tǒng)的基本功能，其表現(xiàn)尚有待進(jìn)一步研究。

本研究同時也顯示，在七氟醚的作用下，神經(jīng)元凋亡的同時伴隨著ROS 增高。神經(jīng)元內(nèi)高濃度的ROS 可能會破壞細(xì)胞蛋白、脂質(zhì)和DNA 導(dǎo)致細(xì)胞的致命損傷，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［13］。一些研究認(rèn)為ROS 影響的靶標(biāo)包括細(xì)胞核和線粒體DNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、鈣穩(wěn)態(tài)、線粒體動力學(xué)和功能、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、受體運(yùn)輸、內(nèi)吞作用等［14］。線粒體功能喪失，金屬穩(wěn)態(tài)改變，不活躍的氧化防御機(jī)制等會直接影響神經(jīng)元的突觸活動和神經(jīng)傳遞，從而導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙［15］。線粒體不僅是ROS 的生成場所也是ROS 重要的攻擊靶點(diǎn)。因此，七氟烷可能通過ROS 水平增高，損傷線粒體，從而引起神經(jīng)元凋亡［16］。

綜上所述，七氟烷可能通過影響神經(jīng)元能量代謝和氧化應(yīng)激水平從而促進(jìn)神經(jīng)元的凋亡