林威威 ，林確然 ，何鉆玉 ，蘇逢錫 ，潘萍 ，陳凱 *，楊冬梓 *

根據(jù)世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）2020 年發(fā)布的數(shù)據(jù)，乳腺癌已經(jīng)超越肺癌，成為全球第一大癌癥。僅2020 年一年，全球乳腺癌新增人數(shù)達(dá)226 萬(wàn)，占女性所有新發(fā)病例的24.5%［1］。同時(shí)，從2010 年到2019 年的十年間，乳腺癌導(dǎo)致的傷殘調(diào)整壽命年（DALY）迅速增長(zhǎng)，2019 年導(dǎo)致2060 萬(wàn)DALY，位列所有癌癥的第四位，女性癌癥的第一位［2］。我國(guó) 2020 年乳腺癌新發(fā)病例 41.6 萬(wàn)例［3］。在育齡婦女惡性疾病中，乳腺癌患者占40%以上［4，5］。其中華南地區(qū)的乳腺癌發(fā)病率總體與全國(guó)的中位數(shù)相當(dāng)，具有較強(qiáng)的代表性［6］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，乳腺癌的發(fā)病情況具有年輕化趨勢(shì)［3］；此外，中國(guó)乳腺癌患者平均發(fā)病年齡較西方國(guó)家要早約10 年［7］。因此，在進(jìn)行乳腺癌綜合治療時(shí)，需要重點(diǎn)關(guān)注治療對(duì)生殖系統(tǒng)的副作用尤其是卵巢功能損害，例如誘發(fā)短暫或永久性閉經(jīng)、卵巢早衰與不孕癥等。盡管化療可以延長(zhǎng)生存時(shí)間，但其產(chǎn)生的對(duì)生殖系統(tǒng)的不良反應(yīng)可能會(huì)影響年輕乳腺癌患者的生存質(zhì)量，并有可能使患者及其家屬對(duì)治療方案的選擇以及減弱其治療的依從性進(jìn)而影響療效［8-11］。

本項(xiàng)目是首次在中國(guó)乳腺癌人群里探索促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑（gonadotropin?releasing hormone agonist，GnRHa）的應(yīng)用對(duì)于化療后月經(jīng)恢復(fù)和卵巢體積大小影響的一項(xiàng)單中心、隨機(jī)、對(duì)照、雙盲臨床試驗(yàn)，并通過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的隨訪獲得了長(zhǎng)期的腫瘤學(xué)生存的安全性數(shù)據(jù)。以期建立和完善早期乳腺癌化療過(guò)程中應(yīng)用GnRHa 類藥物保護(hù)生殖系統(tǒng)功能（生育功能和內(nèi)分泌功能）的方法。

1 材料與方法

1.1 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

本試驗(yàn)經(jīng)中山大學(xué)中山紀(jì)念醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，中國(guó)臨床試驗(yàn)注冊(cè)中心（ChiCTR?TRC?10000980）。獲得每個(gè)受試者的書面知情同意。試驗(yàn)方案和統(tǒng)計(jì)分析方案見附錄。試驗(yàn)遵循了CONSORT 報(bào)告指南和中國(guó)《藥品臨床試驗(yàn)管理規(guī)范》以及國(guó)家相關(guān)法規(guī)進(jìn)行。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn)

所有受試者必須符合下列標(biāo)準(zhǔn)：①年齡14~45 歲女性；②臨床診斷為早、中期乳腺癌患者；③預(yù)備接受化學(xué)治療，且預(yù)期生存超過(guò)12 個(gè)月；④簽署知情同意書并能按時(shí)隨訪；⑤妊娠試驗(yàn)陰性并同意在研究開始后的1 個(gè)月內(nèi)采取有效的非激素避孕法。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

如果具備以下任何一項(xiàng)，不可進(jìn)入研究：①生殖器官腫瘤，或懷疑腫瘤已有生殖器官轉(zhuǎn)移；②合并嚴(yán)重心腦、呼吸和肝腎系統(tǒng)疾病；③合并精神疾病、嚴(yán)重神經(jīng)官能癥或認(rèn)知障礙；④妊娠或哺乳；⑤已知對(duì)GnRH 激動(dòng)劑過(guò)敏；⑥已經(jīng)有卵巢功能衰竭癥狀；⑦既往已接受過(guò)化療藥物；⑧已接受或預(yù)備接受局部或大范圍放射治療。

在額外排除6 名在完成化療前就退出研究的志愿者，我們?cè)诋?dāng)前的研究中納入了141名受試者。

1.4 研究設(shè)計(jì)及處理

該試驗(yàn)是一項(xiàng)由研究人員發(fā)起的、單中心、隨機(jī)、雙盲臨床對(duì)照試驗(yàn)，于2008 年8 月至2021 年12 月在中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院進(jìn)行，完成用藥后患者隨訪時(shí)間從8年~13年不等。干預(yù)組患者于化療前0~14 天肌注GnRHa（達(dá)菲林，注射用醋酸曲普瑞林）3.75 mg，每28 天重復(fù)用藥，伴隨化療，用藥不超過(guò)6 個(gè)月。隨機(jī)分至安慰組的受試者在上述同時(shí)間接受安慰劑（生理鹽水）肌肉注射。根據(jù)患者的診斷分配化療方案，化療方案以蒽環(huán)和/或紫杉類藥物為主，并參考NCCN 指南制定［12］。記錄治療期間發(fā)生的不良事件，當(dāng)發(fā)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)時(shí)會(huì)采取相應(yīng)保護(hù)措施或停止治療。每例患者在治療前記錄月經(jīng)情況、激素水平、婦科B 超檢查結(jié)果。所有患者在治療結(jié)束后首先隨訪2 年以記錄療效和安全性，再繼續(xù)隨訪以觀察遠(yuǎn)期療效。

1.5 隨機(jī)化分組

本試驗(yàn)采用分層隨機(jī)化區(qū)組分配方案將全部入選病例分到GnRHa 激動(dòng)劑試驗(yàn)組和對(duì)照組。分層隨機(jī)化區(qū)組分配方案使用SPSS 10.0 for Win?dows 統(tǒng)計(jì)軟件完成，利用計(jì)算機(jī)隨機(jī)數(shù)生成器產(chǎn)生隨機(jī)碼來(lái)分配區(qū)組，區(qū)組的長(zhǎng)度隨機(jī)變化。具體的隨機(jī)化方法由中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院統(tǒng)計(jì)學(xué)教研室選派統(tǒng)計(jì)學(xué)家負(fù)責(zé)實(shí)施（該統(tǒng)計(jì)學(xué)家不參加臨床用藥、隨訪、數(shù)據(jù)采集以及最終的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析和匯總），完成的隨機(jī)方案用一組不透明信封隱藏，為每一個(gè)受試者設(shè)置一個(gè)應(yīng)急信件（Emer?gency letter），信件內(nèi)容為該編號(hào)的受試者所分入的組別。應(yīng)急信件密封后隨相應(yīng)編號(hào)的試驗(yàn)藥物發(fā)往各試驗(yàn)中心，由中心負(fù)責(zé)人保存，在發(fā)生緊急情況（如遇嚴(yán)重不良事件必須知道病人接受的是何種處理）時(shí)方可由中心負(fù)責(zé)人拆閱，一旦被拆閱，該編號(hào)病例就作為脫落病例處理，所有應(yīng)急信件在試驗(yàn)結(jié)束后隨病例報(bào)告表一起收回。

1.6 主要研究終點(diǎn)

對(duì)比干預(yù)組和對(duì)照組化療結(jié)束后6、12 個(gè)月的月經(jīng)恢復(fù)率來(lái)分析月經(jīng)恢復(fù)情況。

1.7 次要研究終點(diǎn)

①GnRHa 的使用與丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）與左右卵巢容積（長(zhǎng)徑×左右徑×前后徑×0.523）及竇卵泡計(jì)數(shù)（AFC）之間的關(guān)系。

②化療6 個(gè)月后月經(jīng)恢復(fù)和月經(jīng)未恢復(fù)的患者的死亡（Death），轉(zhuǎn)移（Metastasis）和復(fù)發(fā)（Re?lapse）：（包括死亡和轉(zhuǎn)移事件）。

1.8 數(shù)據(jù)分析

本研究采用卡方檢驗(yàn)來(lái)評(píng)估干預(yù)組與對(duì)照組月經(jīng)恢復(fù)率差異的意義。采用Logistic 回歸分析評(píng)價(jià)化療結(jié)束及化療后6 個(gè)月干預(yù)與月經(jīng)恢復(fù)之間的關(guān)系。采用線性回歸建立干預(yù)組與丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、竇卵泡數(shù)、左右卵巢容積的相關(guān)性模型。使用Cox 風(fēng)險(xiǎn)回歸來(lái)評(píng)估化療6 個(gè)月后月經(jīng)狀況、左右卵巢容積與全因死亡、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)之間的關(guān)系。協(xié)變量調(diào)整使用了分層因素包括年齡，腫瘤分期，和化療方案。使用Kaplan?Meier（K?M）曲線和Log?rank test 來(lái)探討兩組患者間無(wú)轉(zhuǎn)移生存期（metastasis?free survival，MFS）和無(wú)復(fù)發(fā)生存期（relapse?free survival，RFS）的差異。本研究采用STATA 15IC 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 兩組人群基線特征比較

GnRHa 干預(yù)組的患者入組時(shí)的平均年齡為34.5±4.5，有34（50.7%）位患者≤35 歲。月經(jīng)初潮的平均年齡為13.6±1.2 歲，入組前六個(gè)月100%沒有閉經(jīng)。干預(yù)組患者的左，右兩側(cè)卵巢平均容積分別為4.8±2.3 cm 和7.1±14.8 cm。平均丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶為14.1±8 U/L，竇卵泡計(jì)數(shù)平均為14±7.4 個(gè)。在對(duì)照組的患者里面，他們的平均年齡為34.5±5.5歲；≤35 歲的有34（49.3%）人；月經(jīng)初潮平均年齡為13.7±1.2 歲；入組前六個(gè)月100%有過(guò)至少一次月經(jīng)；左右側(cè)卵巢平均容積分別為6.1±5.0 cm 和5.6±3.1 cm；平均丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶為15±10.5 U/L，竇卵泡計(jì)數(shù)平均為15±9.4 個(gè)。對(duì)比干預(yù)組和對(duì)照組的各項(xiàng)基線變量后，所有均P值>0.05，顯示兩組患者入組時(shí)的各項(xiàng)特征無(wú)顯著性差異。因此，兩組患者用藥后情況具有可比性（表格1）。

2.2 GnRHa 的應(yīng)用對(duì)乳腺癌患者化療后月經(jīng)恢復(fù)率的影響

化療前GnRHa 干預(yù)組和對(duì)照組的患者入組前半年內(nèi)有月經(jīng)的比例均為100%。在六個(gè)月化療結(jié)束時(shí)，干預(yù)組的患者有過(guò)月經(jīng)的人數(shù)為3人（占4.6%）。對(duì)照組的月經(jīng)恢復(fù)人數(shù)為14人（占20.0%），兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.006）。兩組的月經(jīng)恢復(fù)情況在化療結(jié)束后6 個(gè)月比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。干預(yù)組有69.2%的患者恢復(fù)了月經(jīng)，對(duì)照組的患者有75.9%恢復(fù)了月經(jīng)（P=0.436）（表2）。在多因素分析過(guò)程中對(duì)年齡、疾病分期、化療方案進(jìn)行進(jìn)一步矯正后，我們觀察到在化療結(jié)束時(shí)，干預(yù)組對(duì)比對(duì)照組的月經(jīng)恢復(fù)率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（OR=0.19，95%CI：0.03~1.14）；在化療結(jié)束六個(gè)月時(shí)，是否使用GnRHa 對(duì)于月經(jīng)恢復(fù)無(wú)顯著相關(guān)性（P>0.05）（圖1）。

表2 兩組患者化療不同階段月經(jīng)恢復(fù)情況對(duì)比

表1 兩組患者基線特征對(duì)比

2.3 GnRHa 的應(yīng)用對(duì)乳腺癌患者化療后的肝功能、卵巢體積的影響

在多因素分析過(guò)程中對(duì)年齡、疾病分期、化療方案進(jìn)行進(jìn)一步矯正后，在化療結(jié)束時(shí)，我們觀察到干預(yù)組患者的左右卵巢容積均與對(duì)照組無(wú)顯著差異（差值：-1.63，-3.95，P=0.073，P=0.108）；干預(yù)組患者中的平均轉(zhuǎn)氨酶比對(duì)照組患者更低，但是差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（差值：-1.94，P=0.675）；平均竇卵泡計(jì)數(shù)（AFC）在干預(yù)組中的數(shù)值相比對(duì)照組更少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（差值：-2.2，P=0.028）。在化療結(jié)束六個(gè)月時(shí)，是否使用GnRHa 對(duì)于左右卵巢容積和竇卵泡計(jì)數(shù)均無(wú)顯著相關(guān)性（P>0.05）（圖1）

圖1 GnRHa 的應(yīng)用對(duì)乳腺癌患者化療后的肝功能、卵巢容積、月經(jīng)恢復(fù)的影響LOV 代表左側(cè)卵巢容積，ROV 代表右側(cè)卵巢容積，ALT 為轉(zhuǎn)氨酶，AFC 為竇卵泡計(jì)數(shù)；V7 代表化療結(jié)束時(shí)的情況，V8 代表化療結(jié)束6 個(gè)月的時(shí)候的情況

2.4 化療結(jié)束后月經(jīng)恢復(fù)情況和預(yù)后的相關(guān)性

在化療結(jié)束后六個(gè)月時(shí)，月經(jīng)恢復(fù)的78 人里面有6 人在隨訪的最后發(fā)生死亡，11 人發(fā)生了腫瘤轉(zhuǎn)移和13 人發(fā)生了復(fù)發(fā)的情況；在月經(jīng)沒有恢復(fù)的27 個(gè)人里面，有1（3.7%）人發(fā)生了死亡事，6（22.2%）發(fā)生了腫瘤轉(zhuǎn)移，9（33.3%）發(fā)生了復(fù)發(fā)；χ2檢驗(yàn)顯示兩組的預(yù)后情況無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表格3）。在多因素分析過(guò)程中對(duì)年齡、疾病分期、化療方案進(jìn)行進(jìn)一步矯正后，化療結(jié)束六個(gè)月的月經(jīng)恢復(fù)情況與死亡事件、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)沒有顯著的相關(guān)性（P>0.05）（圖2）?；熃Y(jié)束后左側(cè)卵巢容積與死亡事件，轉(zhuǎn)移，和復(fù)發(fā)不顯著相關(guān)（P>0.05）。但是同一時(shí)間右側(cè)卵巢容積與轉(zhuǎn)移事件呈負(fù)相關(guān)（HR=0.76，P=0.046），與死亡和復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著相關(guān)性（P>0.05）（圖2）。干預(yù)組和對(duì)照組患者以轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)為結(jié)局的Kaplan?Meier（K?M）曲線如圖 3 所示，根據(jù) Log?rank test 結(jié)果，兩組患者間轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)時(shí)間的無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.3352，P=0.0999）。

圖3 干預(yù)對(duì)照兩組患者的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的K?M曲線和log?rank test的P值

表3 化療結(jié)束后六個(gè)月兩組月經(jīng)恢復(fù)情況患者中預(yù)后的對(duì)比 ［n（%）］

圖2 化療結(jié)束后月經(jīng)恢復(fù)情況和預(yù)后的相關(guān)性

3 討論

本研究是一項(xiàng)單中心、雙盲、隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)，所有的患者都接受了4 至6 個(gè)周期的化療，隨訪時(shí)間長(zhǎng)達(dá)13 年，在受試人群中評(píng)估了GnRHa 對(duì)乳腺癌化療后月經(jīng)恢復(fù)及卵巢大小的效果和安全性，以期建立和完善乳腺癌化療期間使用GnRHa類藥物保護(hù)卵巢的方法，結(jié)果顯示使用GnRHa 與患者化療結(jié)束后的月經(jīng)恢復(fù)情況和卵巢大小無(wú)明顯關(guān)系，而右側(cè)卵巢容積的恢復(fù)對(duì)乳腺癌轉(zhuǎn)移有保護(hù)作用。目前已有研究表明，在化療期間使用GnRHa 可顯著降低閉經(jīng)率［13-16］。然而我們的結(jié)果表明，年齡14~45 歲的女性且臨床診斷為早、中期乳腺癌的患者，化療期間使用GnRHa 治療時(shí)，對(duì)照組和干預(yù)組之間的月經(jīng)恢復(fù)率、左右卵巢容積及轉(zhuǎn)氨酶沒有明顯差異，且化療后的月經(jīng)恢復(fù)情況，左卵巢容積對(duì)全因死亡，乳腺癌轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)無(wú)顯著影響，右側(cè)卵巢容積與腫瘤轉(zhuǎn)移則顯著負(fù)相關(guān)。對(duì)入組的141 名患者進(jìn)行分析的結(jié)果顯示，在化療結(jié)束后的6 個(gè)月，對(duì)照組月經(jīng)恢復(fù)了75.9%，治療組為69.2%。因此，本研究的療效指標(biāo)評(píng)估顯示GnRHa 和月經(jīng)恢復(fù)無(wú)明顯關(guān)系。

在一項(xiàng)GnRHa 在乳腺癌輔助化療中維持卵巢功能的隨機(jī)試驗(yàn)中也顯示，按年齡、雌激素受體狀態(tài)和治療方案分層時(shí)，治療組的閉經(jīng)率與對(duì)照組相當(dāng)，并且為了限制觀察的偏差，使用了比例風(fēng)險(xiǎn)模型來(lái)評(píng)估治療藥物是否會(huì)對(duì)月經(jīng)時(shí)間有影響，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，未觀察到影響［17］，本項(xiàng)目所觀察的結(jié)論與之一致。我們研究得到陰性結(jié)果的另一個(gè)潛在原因也可能是由于參與者平均年齡為34.5 歲，普遍比較年輕，因此不論使用GnRHa與否的月經(jīng)恢復(fù)率都比較高。在另一項(xiàng)使用促黃體生成素釋放激素激動(dòng)劑（luteinizing hormone?releasing hormone agonists，LHRHa）的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)中顯示，絕經(jīng)前乳腺癌患者同時(shí)接受輔助化療，化療結(jié)束后6 個(gè)月與單獨(dú)接受化療的患者相比，閉經(jīng)減少無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［18］。在其他幾項(xiàng)研究中則顯示化療期間使用GnRHa 可顯著降低閉經(jīng)率［13-16］，至隨訪結(jié)束，治療組閉經(jīng)發(fā)生率為22.8%~15.8%，平均年齡為40.6歲，中位隨訪時(shí)間為49~60.5個(gè)月，ER 陽(yáng)性率為10.3%~13.0%。而在我們的研究中，平均年齡為34.5 歲，雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽(yáng)性率分別為71.8%（治療組）和70.3%（對(duì)照組）。在這些研究中，化療方案包括TEC（多西紫杉醇+阿霉素+環(huán)磷酰胺），EC?T（H）（阿霉素+環(huán)磷酰胺4 個(gè)周期，隨后再加4 個(gè)周期的多西他賽±曲妥珠單抗），TC（H）（多西紫杉醇+環(huán)磷酰胺±曲妥珠單抗）和FEC（5?氟尿嘧啶+阿霉素+環(huán)磷酰胺），這與我們主要的研究方案較一致。在本研究中，右側(cè)卵巢容積與腫瘤轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)則顯著負(fù)相關(guān)，且每增加一個(gè)單位，轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)就減少24%，此項(xiàng)結(jié)論目前尚未在文獻(xiàn)中有見報(bào)道。最后，干預(yù)組患者中的平均AFC 在用藥結(jié)束時(shí)相比對(duì)照組更低。這個(gè)情況是由于GnRHa 的降調(diào)作用導(dǎo)致的，在停藥6 個(gè)月后兩組患者的平均AFC 值變?yōu)闊o(wú)顯著差異，提示GnRHa 對(duì)治療結(jié)束后患者的AFC 值無(wú)顯著影響。

總之，本研究中在治療結(jié)束后，GnRHa 治療組的月經(jīng)恢復(fù)率為69.2%，對(duì)照組為75.9%，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這些結(jié)果表明，與未接受GnRHa 治療的患者相比，接受GnRHa 治療對(duì)月經(jīng)恢復(fù)和卵巢大小無(wú)明顯益處，關(guān)于兩組患者的卵巢功能影響以及生育率的影響差異的數(shù)據(jù)觀察目前本研究仍然在進(jìn)行。本文主要結(jié)果顯示GnRHa 對(duì)肝臟無(wú)明顯毒性也不會(huì)影響化療結(jié)束后竇卵泡計(jì)數(shù)，并且也不影響患者的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。因此使用GnRHa 用于化療病人的卵巢保護(hù)總體而言是安全的。另外，乳腺癌患者早期化療過(guò)程中可用于保留卵巢功能/保留生育能力的方法也有許多其他方式可供選擇。如在接受化療前進(jìn)行卵母細(xì)胞或胚胎冷凍低溫保存［19］是一種常用的保留生育能力方法。據(jù)我們所知，本研究是第一個(gè)針對(duì)中國(guó)人群開展的GnRHa 用于乳腺癌化療過(guò)程的一項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)，基線數(shù)據(jù)匹配，可分析數(shù)據(jù)完整，結(jié)果較可靠。此外，本研究也存在一些缺陷，本研究樣本量較小，未將治療結(jié)束后的生育情況作為研究的結(jié)局，并且最終參與研究的人數(shù)并未達(dá)到預(yù)期的要求，還需要更大規(guī)模的研究來(lái)闡明GnRHa 在保護(hù)年輕的乳腺癌患者卵巢功能方面的作用。