何沖，周姝睿，李雅晴，陳少杰，練國(guó)達(dá)，陳尚祥，黃開(kāi)紅

胰腺癌是消化道常見(jiàn)惡性腫瘤，侵襲性強(qiáng)、惡性程度高，患者5 年生存期低于8%［1］。胰腺癌早期臨床癥狀隱匿，病情進(jìn)展迅速，多數(shù)患者確診時(shí)已發(fā)生局部進(jìn)展或遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，失去手術(shù)機(jī)會(huì)，即使患者早期接受手術(shù)切除，90%以上患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)［2］。探索新的預(yù)后預(yù)測(cè)指標(biāo)，建立便捷、有效的預(yù)測(cè)系統(tǒng)，積極開(kāi)展科學(xué)的臨床干預(yù)，是提高胰腺癌臨床預(yù)后的關(guān)鍵。

鐵死亡是一種鐵依賴(lài)性的細(xì)胞程序性死亡，主要是由線粒體內(nèi)的脂質(zhì)過(guò)氧化物損傷積累驅(qū)動(dòng)細(xì)胞死亡［3］。據(jù)研究報(bào)道，鐵死亡在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，例如天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（GOT1）驅(qū)動(dòng)的代謝途徑在胰腺癌用于維持氧化還原平衡可負(fù)性調(diào)控鐵死亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、腫瘤生長(zhǎng)［4］。近年來(lái)的研究還發(fā)現(xiàn)，鐵死亡與MAPK 通路密切相關(guān)。在胰腺癌細(xì)胞中，鐵死亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)stat3 的激活需要MAPK/ERK 通路的激活［5］。研究還發(fā)現(xiàn)ASK1?p38 MAPK 通路是脂質(zhì)過(guò)氧化物下游的調(diào)節(jié)因子之一［6］。但鐵死亡相關(guān)基因與胰腺癌患者的預(yù)后是否相關(guān)仍未明確。為探討鐵死亡相關(guān)基因?qū)σ认侔┗颊哳A(yù)后預(yù)測(cè)的價(jià)值，并進(jìn)一步探索其分子機(jī)制，本研究通過(guò)分析公共數(shù)據(jù)庫(kù)中胰腺癌患者的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜和臨床資料，篩選差異表達(dá)的鐵死亡相關(guān)基因，驗(yàn)證其在胰腺癌患者預(yù)后預(yù)測(cè)中的準(zhǔn)確性，以便為胰腺癌患者預(yù)后評(píng)估及治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集

從 GTEx（Genotype?Tissue Expression Project）（https：//www.gtexportal.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中下載正常胰腺組織轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜數(shù)據(jù)，從TCGA（The Cancer Genome Atlas）（https：//portal.gdc.cancer.gov/）數(shù) 據(jù)庫(kù)及ICGC（International Cancer Genome Consortium）（https：//dcc.icgc.org）數(shù)據(jù)庫(kù)中下載胰腺癌患者的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜及相應(yīng)的臨床病理數(shù)據(jù)，排除TCGA和ICGC 中無(wú)生存狀態(tài)和生存時(shí)間的樣本，保留同時(shí)具有轉(zhuǎn)錄組和臨床數(shù)據(jù)的樣本，最終在GTEx 數(shù)據(jù)庫(kù)中納入328 例正常胰腺組織轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜數(shù)據(jù)，在TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中納入了176 名胰腺癌患者作為訓(xùn)練隊(duì)列，在ICGC 數(shù)據(jù)庫(kù)中納入了81 名胰腺癌患者作為獨(dú)立外部驗(yàn)證隊(duì)列。

從鐵死亡數(shù)據(jù)庫(kù)（FerrDb）（http：//www.zhounan.org/ferrdb/legacy/index.html）中下載鐵死亡相關(guān)基因，包括123 個(gè)鐵死亡標(biāo)記基因、150 個(gè)鐵死亡驅(qū)動(dòng)基因和109 個(gè)鐵死亡抑制基因，并與TCGA 和ICGC 數(shù)據(jù)庫(kù)中的基因表達(dá)譜取交集，最終納入了382 個(gè)鐵死亡相關(guān)基因進(jìn)行研究。

1.2 方法

1.2.1 鐵死亡相關(guān)差異表達(dá)基因的鑒定和功能分析 使用 R 軟件（Version 4.0.2）“l(fā)imma”包研究mRNA 的差異表達(dá)。在TCGA 或GTEx 中分析了調(diào)整后的P值以糾正假陽(yáng)性結(jié)果。使用Fold change和校正后P值繪制火山圖。篩選條件為“|log2（Fold change）|≥2 且AdjustedP<0.05”，檢測(cè)腫瘤與癌旁正常組織之間的差異表達(dá)基因。使用R 軟件“pheatmap”包可視化腫瘤與癌旁正常組織之間與癌旁正常組織之間的差異程度范圍。然后，將鐵死亡相關(guān)基因與差異表達(dá)基因進(jìn)行交集，得到鐵死亡相關(guān)差異表達(dá)基因。

使用 Metascape Online（https：//metascape.org/gp/index.html#/main/step1）進(jìn)行功能分析［7］。將鐵死亡相關(guān)基因上傳到Metascape 進(jìn)行功能分析，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。我們使用MCODE 插件（篩選條件為P<0.05）進(jìn)行模塊化分析。

1.2.2 鐵死亡相關(guān)差異表達(dá)基因預(yù)后模型的構(gòu)建與驗(yàn)證 TCGA 數(shù)據(jù)集作為訓(xùn)練隊(duì)列，用于建立鐵死亡相關(guān)差異表達(dá)基因預(yù)后模型，ICGC 數(shù)據(jù)集作為驗(yàn)證隊(duì)列驗(yàn)證預(yù)后模型的預(yù)測(cè)效果。首先對(duì)總生存期（overall survival，OS）進(jìn)行單變量COX 回歸分析以確定有與預(yù)后相關(guān)的鐵死亡相關(guān)差異表達(dá)基因（以P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。我們進(jìn)一步使用 R 軟件（Version 4.0.2）“glmnet”包，整合生存時(shí)間、生存狀態(tài)和與預(yù)后相關(guān)的鐵死亡相關(guān)差異基因表達(dá)數(shù)據(jù)，利用LASSO COX 方法進(jìn)行回歸分析，構(gòu)建了一個(gè)基于鐵死亡相關(guān)基因的預(yù)后模型。該模型根據(jù)各基因的FPKM 標(biāo)準(zhǔn)化表達(dá)水平及其相應(yīng)的回歸系數(shù)計(jì)算患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分。根據(jù)中位值將隊(duì)列中所有患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組與低風(fēng)險(xiǎn)組，分析患者風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與患者的總生存期、生存狀態(tài)及各個(gè)基因的表達(dá)變化的關(guān)系。輸入患者的總生存期、生存狀態(tài)及鐵死亡相關(guān)差異表達(dá)基因預(yù)后模型風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，使用R 軟件（Version 4.0.2）“pROC”包進(jìn)行了ROC（receiver operating character?istic curve，受試者工作特征曲線）分析以評(píng)估預(yù)測(cè)模型準(zhǔn)確性。并根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分分組，使用R 軟件“survival ROC”包繪制生存曲線，進(jìn)行生存分析。

1.2.3 訓(xùn)練隊(duì)列和驗(yàn)證隊(duì)列高低風(fēng)險(xiǎn)組差異基因功能富集分析 根據(jù)預(yù)后預(yù)測(cè)模型計(jì)算TCGA 訓(xùn)練隊(duì)列和ICGC 驗(yàn)證隊(duì)列各患者風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，以每個(gè)隊(duì)列風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分中位數(shù)劃分高低風(fēng)險(xiǎn)組，分別對(duì)TCGA 訓(xùn)練隊(duì)列和ICGC 驗(yàn)證隊(duì)列數(shù)據(jù)進(jìn)行差異基因重分析。采用 R 軟件（Version 4.0.2）“l(fā)imma”包進(jìn)行分析，篩選條件為“0.25

1.2.4 訓(xùn)練隊(duì)列腫瘤微環(huán)境免疫浸潤(rùn)分析 根據(jù)TCGA 訓(xùn)練隊(duì)列所有腫瘤組織的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)譜數(shù)據(jù)，我們采用R 軟件（Version 4.0.2）“CiberSort”包計(jì)算TCGA 訓(xùn)練隊(duì)列所有腫瘤組織中浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞，并對(duì)同一類(lèi)免疫細(xì)胞在高低風(fēng)險(xiǎn)組腫瘤組織中的浸潤(rùn)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有統(tǒng)計(jì)分析均采用R（Ver?sion 4.0.2）或 SPSS（Version 25.0）進(jìn)行。如果未特別注明，以P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 胰腺癌中差異表達(dá)的鐵死亡基因

從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)和GTEx 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載胰腺癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，共獲得510 個(gè)樣本（腫瘤樣本178 個(gè)，正常組織樣本332 個(gè)）。使用“l(fā)imma”程輯包研究mRNA 的差異表達(dá)，共篩選出4149 個(gè)差異基因（上調(diào)基因有4011 個(gè)，下調(diào)基因有138 個(gè)）（圖1A?B），與鐵死亡數(shù)據(jù)庫(kù)（FerrDb）中鐵死亡相關(guān)基因取交集，維恩圖顯示最終獲得103 個(gè)差異基因（圖1C）。為了探索胰腺癌鐵死亡的潛在機(jī)制，我們使用Metascape Online 進(jìn)行基因功能富集分析。如圖1D?F 所示，GO（Gene Ontology，基因本體論）分析結(jié)果表明，這些差異表達(dá)的鐵死亡相關(guān)基因主要在活性氧應(yīng)激、核受體通路及細(xì)胞應(yīng)激等通路富集。如圖1F 所示，基于Metascape Online 的PPI（protein?protein interaction，蛋白質(zhì)?蛋白質(zhì)相互作用）網(wǎng)絡(luò)和MCODE 插件確定了這些鐵死亡基因中的5 個(gè)重要模塊。因此，鐵死亡相關(guān)差異基因可能通過(guò)這些機(jī)制影響胰腺癌患者預(yù)后。

圖1 TCGA 及GTEx 中胰腺癌內(nèi)差異表達(dá)的鐵死亡相關(guān)基因分析

2.2 在TCGA 隊(duì)列中構(gòu)建預(yù)后模型

首先下載 TCGA?PAAD 歸一化的 mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)和相應(yīng)的患者信息，提取103 個(gè)鐵死亡相關(guān)差異表達(dá)基因的表達(dá)數(shù)據(jù)，對(duì)總生存期（overall survival，OS）進(jìn)行單因素COX 回歸分析。如圖2A顯示了單變量Cox 回歸分析結(jié)果的森林圖，37 個(gè)鐵死亡相關(guān)基因被鑒定為預(yù)后相關(guān)基因。將得到的37 個(gè)預(yù)后相關(guān)的鐵死亡相關(guān)基因進(jìn)行LASSO COX 回歸分析以構(gòu)建預(yù)后模型，根據(jù)最優(yōu)的λ 值（λ=0.07）確定了一個(gè)15基因的預(yù)后模型（圖2B?C）。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位數(shù)將TCGA?PAAD隊(duì)列分為高風(fēng)險(xiǎn)組（n=86）和低風(fēng)險(xiǎn)組（n=86）。Kaplan?Meier生存曲線顯示，高風(fēng)險(xiǎn)組胰腺癌患者的總生存期明顯低于低風(fēng)險(xiǎn)組患者（P<0.05）（圖2E）。隨后，我們進(jìn)行了ROC 分析來(lái)評(píng)估模型的預(yù)后預(yù)測(cè)效率，發(fā)現(xiàn)AUC（area under curve，曲線下面積）分別為 0.74（1 年）、0.82（3 年）和 0.88（5 年），表明預(yù)后預(yù)測(cè)模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性良好（圖2F）。

圖2 構(gòu)建鐵死亡相關(guān)差異表達(dá)基因預(yù)后模型

2.3 在ICGC 隊(duì)列中驗(yàn)證模型

此外，為了評(píng)估預(yù)測(cè)模型的可靠性和準(zhǔn)確性，我們?cè)贗CGC?PAAD 隊(duì)列中驗(yàn)證了預(yù)測(cè)模型的功能。我們使用相同計(jì)算公式計(jì)算出了ICGC?PAAD隊(duì)列中所有胰腺癌患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分，根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分的中位數(shù)將TCGA?PAAD 隊(duì)列分為高風(fēng)險(xiǎn)組（n=41）和低風(fēng)險(xiǎn)組（n=40）。Kaplan?Meier 生存曲線顯示，高風(fēng)險(xiǎn)組胰腺癌患者的總生存期明顯低于低風(fēng)險(xiǎn)組患者（P<0.05）（圖3B）。我們進(jìn)一步建立了受試者操作特征曲線（ROC）來(lái)評(píng)估模型的預(yù)后預(yù)測(cè)效率，發(fā)現(xiàn)AUC（area under curve，曲線下面積）分別為0.61（1 年）、0.69（3 年）和 0.77（5 年），表明在ICGC 隊(duì)列中預(yù)后預(yù)測(cè)模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性良好（圖2F）。

圖3 驗(yàn)證鐵死亡相關(guān)差異表達(dá)基因預(yù)后模型

2.4 在TCGA 隊(duì)列和ICGC 隊(duì)列中進(jìn)行差異表達(dá)基因功能再分析

為了研究高低風(fēng)險(xiǎn)組之間的分子異質(zhì)性和潛在的生物學(xué)過(guò)程與途徑，我們使用R 軟件的“l(fā)imma”軟件包研究 TCGA?PAAD 隊(duì)列及 ICGC?PAAD 隊(duì)列高低風(fēng)險(xiǎn)組的差異表達(dá)基因，TCGA?PAAD 列中發(fā)現(xiàn)了6189 個(gè)差異表達(dá)基因（|log2（Fold change）|≥2且AdjustedP<0.05），ICGC?PAAD隊(duì)列發(fā)現(xiàn)了1804個(gè)差異表達(dá)基因（|log2（Fold change）|≥2 且AdjustedP<0.05），并分別對(duì)兩組隊(duì)列的差異基因進(jìn)行了GO和KEGG分析。TCGA?PAAD隊(duì)列的GO和KEGG分析顯示，這些差異表達(dá)基因主要富集在以下幾個(gè)方面：適應(yīng)性免疫反應(yīng)、細(xì)胞間信號(hào)傳遞、細(xì)胞間黏附及配體-受體反應(yīng)等（圖5A?B）。ICGC?PAAD隊(duì)列的GO 和KEGG 分析顯示，這些差異表達(dá)基因主要富集在以下幾個(gè)方面：組織生長(zhǎng)、細(xì)胞外基質(zhì)形成、免疫系統(tǒng)反應(yīng)及細(xì)胞黏附等（圖5C?D）。免疫相關(guān)通路同時(shí)出現(xiàn)在TCGA 和ICGC 隊(duì)列的通路富集結(jié)果中，提示我們應(yīng)繼續(xù)研究鐵死亡基因集與腫瘤免疫微環(huán)境之間的關(guān)系。

2.5 免疫微環(huán)境分析

圖4 TCGA 和ICGC 隊(duì)列高低風(fēng)險(xiǎn)組差異表達(dá)基因的通路富集分析

為了進(jìn)一步探討風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與免疫之間的關(guān)系，我們基于TCGA?PAAD 隊(duì)列基因表達(dá)數(shù)據(jù)，應(yīng)用“CiberSort”算法探索了TCGA?PAAD 隊(duì)列中免疫細(xì)胞的比例。如圖5A 所示，CD4+靜息T 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞（包括M0、M1 和M2 亞群），在TCGA?PAAD中占浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞的很大比例。此外，我們采用箱式圖來(lái)可視化低風(fēng)險(xiǎn)和高風(fēng)險(xiǎn)得分組之間的免疫細(xì)胞亞群分布（圖5B）。我們發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險(xiǎn)組中幼稚B 細(xì)胞、漿細(xì)胞、CD8+T 細(xì)胞浸潤(rùn)程度較低風(fēng)險(xiǎn)組低，但M0 和M1 巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)程度高（P<0.05）。此外，我們還研究了PD?1 和CTLA4在TCGA?PAAD 隊(duì)列低風(fēng)險(xiǎn)組和高風(fēng)險(xiǎn)組中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在TCGA?PAAD 隊(duì)列低風(fēng)險(xiǎn)組患者中PD?1和CTLA4 的表達(dá)較高風(fēng)險(xiǎn)組患者更高（圖5C?D）。

圖5 TCGA 訓(xùn)練隊(duì)列中高低風(fēng)險(xiǎn)組免疫細(xì)胞分布

3 討 論

鐵死亡是一種鐵離子依賴(lài)的細(xì)胞程序性死亡［3］。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞鐵死亡，可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞化療效果［8，9］，但在胰腺癌中相關(guān)機(jī)制尚不明確。在胰腺癌中，胰腺癌具有半胱氨酸依賴(lài)的特性，通過(guò)半胱氨酸合成谷胱甘肽降低自身鐵死亡水平［10］。研究胰腺癌鐵死亡相關(guān)基因表達(dá)和預(yù)后的關(guān)系，尋找胰腺癌鐵死亡治療靶點(diǎn)，對(duì)于增強(qiáng)胰腺癌患者腫瘤治療療效、改善患者預(yù)后，具有重要臨床意義。本研究構(gòu)建了胰腺癌鐵死亡相關(guān)基因預(yù)后預(yù)測(cè)模型，并發(fā)現(xiàn)TCGA 隊(duì)列中高低風(fēng)險(xiǎn)組的免疫微環(huán)境存在差異。本研究提示，胰腺癌患者的腫瘤微環(huán)境、臨床預(yù)后與鐵死亡相關(guān)基因表達(dá)存在一定聯(lián)系，可為評(píng)估患者預(yù)后、制定化療方案提供線索。研究表明，鐵死亡核心機(jī)制如下：Fe2+依賴(lài)（為氧化過(guò)程提供電子）、GPX4 失活（抗氧化劑失衡）和ROS 產(chǎn)物（主要來(lái)源于芬頓反應(yīng)）［11］。鐵死亡是多種酶參與的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，鐵死亡相關(guān)基因在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮重要作用［12，13］。本研究篩選出胰腺癌中腫瘤組織和正常癌旁組織的差異表達(dá)基因，有103個(gè)是鐵死亡相關(guān)基因。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，其中31 個(gè)差異表達(dá)的鐵死亡相關(guān)基因與胰腺癌患者的預(yù)后相關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)提示鐵死亡相關(guān)基因會(huì)影響胰腺癌患者的預(yù)后。

通過(guò)LASSO 回歸分析，我們構(gòu)建了一個(gè)基于15 個(gè)鐵死亡相關(guān)基因（ANO6、AURKA、CAV1、CD?KN1A、CISD1、ENPP2、HSPB1、MAP1LC3A、NRAS、PML、PROM2、PTGS2、RRM2、SLC2A6 和SP1）的預(yù)后預(yù)測(cè)模型。ANO6 作為Ca2+活化的氯離子通道，可以破壞質(zhì)膜的磷脂雙分子層，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞鐵死亡［14］。AURKA 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，AURKA 受抑制會(huì)減少GPX4 的表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞鐵死亡［15］。CAV1 可正向調(diào)節(jié)胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移侵襲和耐藥性［16］。CDKN1A 可通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡來(lái)應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激，研究表明，p53 介導(dǎo)的CDKN1A 表達(dá)延緩了腫瘤細(xì)胞中半胱氨酸剝奪之后的鐵死亡［17］。CISD1是一種含鐵的線粒體膜外膜蛋白，負(fù)向調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞鐵死亡，促進(jìn)腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移［18，19］。ENPP2 作為脂質(zhì)激酶參與脂質(zhì)代謝，對(duì)Erastin 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞鐵死亡有保護(hù)作用［20］。熱休克蛋白（HSPs）在真核生物中高度保守，作為分子伴侶參與蛋白質(zhì)的組裝、折疊、輸出和翻轉(zhuǎn)的調(diào)節(jié)［21］，其中HSPB1 是鐵死亡的負(fù)性調(diào)節(jié)因子［22］。MAP1LC3A 通過(guò) ATG5?ATG7?NCOA4 途徑激活細(xì)胞自噬，導(dǎo)致鐵蛋白降解，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)游離態(tài)鐵積聚，最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞鐵死亡［23］。NRAS 已被證實(shí)與肝細(xì)胞癌中的erastin耐藥有關(guān)［24］。PML可通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體代謝增強(qiáng)人卵巢癌化療敏感性［25］。PROM2 在乳腺癌中能通過(guò)促進(jìn)胞內(nèi)鐵向胞外轉(zhuǎn)運(yùn)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)鐵死亡耐受性［26］。PTGS2 參與鐵死亡過(guò)程當(dāng)中的脂質(zhì)代謝，可正向調(diào)節(jié)細(xì)胞鐵死亡［27］。RRM2 在肝細(xì)胞癌的谷胱甘肽合成中發(fā)揮作用，下調(diào)肝癌細(xì)胞鐵死亡水平［28］。SLC2A6在NRF2 通路中發(fā)揮作用，抑制胰腺癌細(xì)胞鐵死亡［29］。SP1是調(diào)節(jié)ACSL4表達(dá)的一個(gè)關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)與ACSL4啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合來(lái)增加ACSL4 的轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)節(jié)鐵死亡過(guò)程中的脂質(zhì)代謝［30］。這些基因都可以通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤鐵死亡影響腫瘤發(fā)展。這一預(yù)測(cè)模型的預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值在ICGC 隊(duì)列中得到了驗(yàn)證，在胰腺癌的臨床診療中具有應(yīng)用價(jià)值。

為了探索這一預(yù)測(cè)模型內(nèi)在分子機(jī)制，本研究分析了TCGA 隊(duì)列中高低風(fēng)險(xiǎn)組的差異表達(dá)基因并進(jìn)行了功能富集分析，結(jié)果提示差異基因的功能通路富集在適應(yīng)性免疫反應(yīng)上，并且高低風(fēng)險(xiǎn)組的免疫微環(huán)境存在差異。通過(guò)分析TCGA 隊(duì)列中高低風(fēng)險(xiǎn)組的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)情況，我們發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險(xiǎn)組患者的CD8+T 細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯低于低風(fēng)險(xiǎn)組。研究表明，CD8+T 細(xì)胞可以調(diào)節(jié)癌細(xì)胞鐵死亡，進(jìn)而可以影響癌癥免疫治療的療效［31］。免疫檢查點(diǎn)抑制劑已被用于治療膀胱癌和非小細(xì)胞肺癌，具有顯著的療效，但只有一小部分胰腺癌患者可以從免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療中受益［32］。分析 TCGA 隊(duì)列中高低風(fēng)險(xiǎn)組 PD?1 和 CTLA4 表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，高風(fēng)險(xiǎn)組PD?1 和CTLA4 表達(dá)明顯低于低風(fēng)險(xiǎn)組。這一結(jié)果提示高風(fēng)險(xiǎn)組患者或許不能從免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療中受益，我們需要為高風(fēng)險(xiǎn)組胰腺癌患者尋找新的治療靶點(diǎn)。

然而，本研究依舊存在一些局限性。首先，本研究通過(guò)TCGA 數(shù)據(jù)集構(gòu)建模型，通過(guò)ICGC 數(shù)據(jù)集驗(yàn)證該模型，但這一模型并沒(méi)有在臨床隊(duì)列中得到驗(yàn)證；其次，本模型中納入的鐵死亡相關(guān)基因，沒(méi)有通過(guò)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證它們?cè)谝认侔┲械纳飳W(xué)功能；第三，本研究只是初步證明胰腺癌中鐵死亡相關(guān)基因表達(dá)和患者預(yù)后及患者腫瘤免疫微環(huán)境存在一定聯(lián)系，但內(nèi)在分子機(jī)制仍需要更多的基礎(chǔ)研究來(lái)證明。