高 超，郭曉桐，郝斌威，曹 霞，范玉春，陳 娟

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，銀川 750004；2.寧夏回族自治區(qū)銀川監(jiān)獄醫(yī)院，銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，銀川 750004；4.山西白求恩醫(yī)院山西醫(yī)學(xué)科學(xué)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，太原 030000）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種慢性進(jìn)行性氣道和肺實(shí)質(zhì)炎癥性疾病，逐漸進(jìn)展形成氣流受限和肺泡毛細(xì)血管網(wǎng)破壞，肺泡缺氧及肺血管重塑會(huì)促進(jìn)肺血管阻力和肺動(dòng)脈高壓（pulmonary artery hypertension，PAH）升高。遠(yuǎn)端肺小動(dòng)脈重塑是肺血管阻力升高及血管擴(kuò)張性降低的主要因素[1-2]。而肺血管平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移和細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）組分的沉積又是COPD肺動(dòng)脈重塑的重要過(guò)程[3]。過(guò)多的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）激活氧化還原敏感信號(hào)通路，導(dǎo)致血管收縮增強(qiáng)和PAH肺血管重塑[4]。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（nucleotide phosphate oxidase，NOX）是細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的重要來(lái)源。NOX4是其7個(gè)家族成員之一，通過(guò)介導(dǎo)血管平滑肌及血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、分化、凋亡等參與血管舒縮性控制及血管生成。低氧通過(guò)上調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）誘導(dǎo)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞高表達(dá)NOX4，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，誘導(dǎo)肺血管平滑肌細(xì)胞增生，從而參與肺動(dòng)脈重塑[5]。目前針對(duì)輕中度以及未發(fā)生PAH的COPD患者的肺小動(dòng)脈重塑機(jī)制研究甚少，本研究旨在觀察輕中度COPD（未合并PAH）患者遠(yuǎn)端肺小動(dòng)脈重塑情況，并探索TGF-β1介導(dǎo)的NOX4高表達(dá)及ECM異常沉積在肺小動(dòng)脈重塑中的作用及機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

根據(jù)《GOLD指南2018》[6]，選取2018年9月至2020年3月寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院收治的需行手術(shù)治療的肺部腫瘤合并COPD（穩(wěn)定期）患者24例（COPD組），其中輕度15例，中度9例，年齡40～65歲。選取同期需行手術(shù)治療的肺部腫瘤而肺功能正?；颊?0例（對(duì)照組），年齡40～65歲。納入患者均簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①COPD合并肺動(dòng)脈高壓患者；②引起COPD類似癥狀和肺功能改變的其他疾病患者；③肺靜脈閉塞及繼發(fā)性肺動(dòng)脈高壓的其他肺血管疾病患者。

1.2 研究方法

1.2.1 主要試劑 山羊來(lái)源а-SMA抗體、兔多克隆抗體DAPDH（美國(guó)Abcam公司），兔來(lái)源NOX4抗體（美國(guó)Novus公司），鼠抗人Ⅳ型膠原單克隆抗體、兔抗人Ⅰ型膠原單克隆抗體、兔抗人纖維連接蛋白多克隆抗體、鼠抗人層粘連蛋白單克隆抗體、封閉用10%兔血清、封閉用山羊血清、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗、DAB試劑盒（北京中杉金橋公司），重組人TGF-β1蛋白（美國(guó)R＆D公司），封閉用驢血清、RIPA裂解液（北京索萊寶公司），人原代肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（human primary pulmonary artery smooth muscle cells，HPASMC）、平滑肌細(xì)胞完全培養(yǎng)（美國(guó)Sciencell公司），BCA蛋白提取試劑盒（凱基生物公司），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記熒光二抗、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）/HRP抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記驢抗山羊IgG（H+L）/HRP抗體（美國(guó)Proteintech公司）。

1.2.2 人體組織收集及處理 收集受試者腫瘤病灶遠(yuǎn)端（＞5 cm）、正常、新鮮的肺組織，約0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm大小。石蠟包埋組織制成3 μm厚切片；新鮮組織用于檢測(cè)目的蛋白表達(dá)，HE染色觀察肺組織病理改變。使用а-平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體（а-smooth muscle actin，а-SMA）標(biāo)記肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞，在此基礎(chǔ)上每張切片高倍視野（×400）隨機(jī)選取3～5個(gè)結(jié)構(gòu)完整的肺小動(dòng)脈（血管橫斷面外徑為100～500 μm）為觀察對(duì)象[7]，采用Image-Pro Plus software 6.0（IPP）圖像分析軟件測(cè)量血管平滑肌層厚度（wall thickness，WT）、血管外徑（external diameter，ED）、血管平滑肌層面積（vascular wall area，WA）、血管總面積，計(jì)算平滑肌層厚度占血管外徑的百分比（WT%）[8]和平滑肌層面積占血管總面積的百分比（WA%）[9]。

1.2.3 免疫組織化學(xué)法測(cè)定肺組織遠(yuǎn)端肺小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞а-SMA、Ⅳ型膠原蛋白（CollagenⅣ）、Ⅰ型膠原蛋白（CollagenⅠ）、纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）、粘連蛋白（laminin，LN）及NOX4蛋白表達(dá)情況 術(shù)中獲取受試者肺組織后常規(guī)固定、石蠟包埋，制成3 μm厚石蠟切片。常規(guī)烤片、脫蠟、檸檬酸鹽高壓修復(fù)，3%H2O2消除內(nèi)源性過(guò)氧化物，血清（10%兔血清，進(jìn)口山羊血清）封閉，一抗孵育（兔來(lái)源NOX4抗體，1∶200稀釋；山羊來(lái)源а-SMA抗體，1∶200稀釋；鼠抗人CollagenⅣ抗體、兔抗人Collagen I抗體、兔抗人FN抗體、鼠抗人LN抗體，1∶200稀釋）4℃過(guò)夜。滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗37℃孵育30 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水、封片。以PBS代替一抗做陰性對(duì)照。結(jié)果判讀：平滑肌細(xì)胞胞漿內(nèi)見棕黃色顆粒視為陽(yáng)性，未見表達(dá)為陰性。采用IPP圖像分析軟件分析目的蛋白陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度（average optical density，AOD）[10]，AOD=積分光密度/染色區(qū)域分布面積。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 將HPASMC置于平滑肌細(xì)胞完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)（37℃、5% CO2加濕空氣）。通過(guò)а-SMA免疫細(xì)胞化學(xué)及免疫細(xì)胞熒光化學(xué)法檢測(cè)鑒定HPASMC，第2～8代HPASMC用于實(shí)驗(yàn)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HPASMC制成細(xì)胞懸液，接種于24孔板中，分為TGF-β1刺激與未刺激組，每組4個(gè)副孔。TGF-β1組使用加新鮮培養(yǎng)基配制的TGF-β1蛋白（2 ng·mL-1）刺激HPASMC 24 h后收集細(xì)胞，TGF-β1蛋白使用濃度以及作用時(shí)間參考本課題組前期研究[11]；對(duì)照組在相同的培養(yǎng)條件下加入PBS液培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞。

1.2.5 免疫細(xì)胞化學(xué)法（ICC-P）與免疫細(xì)胞熒光法（IFC-P）測(cè)定HPASMC的а-SMA、NOX4及CollagenⅠ蛋白表達(dá)情況4%多聚甲醛固定HPASMC，0.5%Triton X-100通透，5%驢血清封閉，目的一抗（а-SMA抗體1∶100、NOX4抗體1∶200、CollagenⅠ抗體1∶200）4℃過(guò)夜孵育。次日加入一抗相應(yīng)二抗或熒光二抗孵育，免疫細(xì)胞化學(xué)加入DAB工作液顯色，免疫細(xì)胞熒光化學(xué)加入DAPI染核，倒置顯微鏡及倒置熒光顯微鏡下觀察上述目的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果判讀：免疫細(xì)胞化學(xué)陽(yáng)性信號(hào)為細(xì)胞胞漿內(nèi)見棕黃色顆粒視為陽(yáng)性，未見表達(dá)為陰性。免疫細(xì)胞熒光化學(xué)：а-SMA以細(xì)胞漿內(nèi)呈現(xiàn)紅色熒光為陽(yáng)性反應(yīng)，NOX4以細(xì)胞漿內(nèi)呈現(xiàn)綠色熒光為陽(yáng)性反應(yīng)，DAPI為細(xì)胞核呈現(xiàn)藍(lán)色熒光。采用IPP圖像分析軟件分析目的蛋白陽(yáng)性細(xì)胞的AOD值。

1.2.6 蛋白免疫印跡法（Western blot）測(cè)定受試者肺組織以及HPASMC的а-SMA、NOX4、Collagen I蛋白表達(dá)情況 對(duì)于肺組織，術(shù)中獲取受試者新鮮肺組織后迅速置入液氮中快速冷凍，將1.0 mL冰凍的RIPA裂解液加入大約300 μg的肺組織中進(jìn)行勻漿；對(duì)于HPASMC，第2～8代HPASMC在冰上收獲，用RIPA裂解液提取蛋白質(zhì)。根據(jù)蛋白提取試劑盒及BCA法提取并測(cè)定肺組織及HPASMC的蛋白濃度。10% SDS-PAGE轉(zhuǎn)移電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉，目的一抗（山羊抗人а-SMA抗體1∶2 000；NOX4抗體1∶1 000；兔抗人Collagen I抗體1∶500；兔抗人GAPDH抗體1∶2 000）4℃孵育過(guò)夜。使用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗［山羊抗兔IgG（H+L）/HRP抗體，稀釋1∶5 000；驢抗山羊IgG（H+L）/HRP抗體，稀釋1∶5 000］室溫孵育1 h。GAPDH作為內(nèi)參。ChemiDoc MPTMImaging System分析系統(tǒng)曝光、掃描。應(yīng)用IPP軟件通過(guò)光密度測(cè)定法量化目的蛋白表達(dá)AOD值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩樣本間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料（性別）比較采用卡方檢驗(yàn)；各指標(biāo)的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者一般臨床資料比較

兩組患者在性別、年齡、吸煙指數(shù)（吸煙指數(shù)=每日吸煙包數(shù)×吸煙年數(shù)）方面差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。COPD組患者第一秒用力呼氣容積/用力肺活量（forced expiratory volume in one second/forced vital capacity，F(xiàn)EV1/FVC）、第一秒用力呼氣容積占預(yù)計(jì)值百分比（forced expiratory volume in one second total predicted value，F(xiàn)EV1%pred）及動(dòng)脈血氧分壓（arterial partial pressure of oxygen，PO2）均低于對(duì)照組（P均＜0.05）。COPD組動(dòng)脈血二氧化碳分壓（partial pressure of carbon dioxide，PCO2）高于對(duì)照組（P＜0.05），見表1。

表1 兩組患者一般臨床資料比較

2.2 兩組患者肺組織形態(tài)改變

HE染色結(jié)果顯示：COPD組患者肺泡形態(tài)不規(guī)則，肺泡部分融合呈氣腫樣改變，肺泡間隔及小氣道壁增厚并可見不同程度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。COPD組患者遠(yuǎn)端肺小動(dòng)脈平滑肌層增厚，血管腔變形且管腔縮小，血管管壁及周圍不同程度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，圖1。

圖1 兩組患者肺組織形態(tài)改變（HE×200）

使用а-SMA標(biāo)記肺小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞結(jié)果顯示，肺小動(dòng)脈ED在COPD組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.320），COPD組患者肺小動(dòng)脈WT、WT%、WA%均較對(duì)照組增高（P均＜0.05），見圖2、表2。

表2 兩組患者肺小動(dòng)脈重塑指標(biāo)比較（±s）

表2 兩組患者肺小動(dòng)脈重塑指標(biāo)比較（±s）

?

圖2 兩組患者肺小動(dòng)脈平滑肌а-SMA表達(dá)情況（IHC×400）

2.3 兩組患者遠(yuǎn)端肺小動(dòng)脈ECM蛋白表達(dá)情況

免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，ECM蛋白（CollagenⅠ、CollagenⅣ、LN、FN）在肺小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞胞質(zhì)中均有表達(dá)；COPD組肺小動(dòng)脈平滑肌CollagenⅠ、CollagenⅣ、LN、FN AOD值均較對(duì)照組增強(qiáng)（P均＜0.05），見圖3、表3。

表3 兩組患者遠(yuǎn)端肺小動(dòng)脈ECM蛋白表達(dá)水平（AOD值）比較（±s）

表3 兩組患者遠(yuǎn)端肺小動(dòng)脈ECM蛋白表達(dá)水平（AOD值）比較（±s）

?

圖3 兩組患者肺小動(dòng)脈ECM蛋白表達(dá)情況（IHC×400）

2.4 兩組患者遠(yuǎn)端肺小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞а-SMA、NOX4蛋白表達(dá)情況

免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)，а-SMA、NOX4在肺小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞胞質(zhì)中均有表達(dá)；COPD組肺小動(dòng)脈平滑肌а-SMA、NOX4表達(dá)AOD值［（1.23±0.80）、（0.94±0.54）］均較對(duì)照組［（0.09±0.06）、（0.02±0.01）］增強(qiáng)（P均＜0.05）。Western blot結(jié)果顯示，COPD組肺組織а-SMA、NOX4蛋白表達(dá)灰度值［（1.46±1.12）、（1.65±1.20）］較對(duì)照組［（0.85±0.58）、（0.62±0.28）］增強(qiáng)（P均＜0.05），見圖4、圖5。

圖4 兩組患者肺小動(dòng)脈NOX4蛋白表達(dá)情況（IHC×400）

圖5 Western blot檢測(cè)兩組患者肺組織а-SMA、NOX4蛋白表達(dá)的電泳圖

2.5 TGF-β1作用于HPASMC 24 h后NOX4、а-SMA、CollagenⅠ蛋白表達(dá)情況

ICC-P及IFC-P檢測(cè)TGF-β1（2 ng·mL-1）作用于HPASMC 24 h后，NOX4、а-SMA、CollagenⅠ蛋白表達(dá)AOD值均較TGF-β1未作用前增高（P均＜0.05），見圖6、圖7、表4。

表4 TGF-β1作用于HPASMC前和24 h后NOX4、а-SMA、CollagenⅠ蛋白表達(dá)水平比較

圖6 TGF-β1（2 ng·mL-1）作用于HPASMC 24 h后NOX4、а-SMA、CollagenⅠ蛋白表達(dá)情況（ICC-P×400）

圖7 TGF-β1（2 ng·mL-1）作用于HPASMC 24 h后NOX4、а-SMA、CollagenⅠ蛋白表達(dá)情況（IFC-P×400）

2.6 各指標(biāo)的相關(guān)性分析

肺動(dòng)脈重塑指標(biāo)WA%、WT%與FEV1/FVC、FEV1%pred均呈負(fù)相關(guān)（P均＜0.05）。肺小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞CollagenⅠ、CollagenⅣ、LN、FN蛋白AOD值與FEV1/FVC、FEV1%pred均呈負(fù)相關(guān)（P均＜0.05），見表5。

表5 各參數(shù)間的相關(guān)性分析結(jié)果

3 討論

COPD不僅是一種氣道疾病，而且同多數(shù)慢性彌漫性肺部疾病一樣，肺微血管和毛細(xì)血管前小動(dòng)脈也會(huì)受到影響[12]。肺動(dòng)脈重塑導(dǎo)致PAH是COPD的特征性表現(xiàn)，ECM沉積、血管平滑肌細(xì)胞增殖和肥大均參與其中，導(dǎo)致毛細(xì)血管前肺動(dòng)脈閉塞和PAH持續(xù)升高[13-14]。然而，肺動(dòng)脈重塑并非只存在于晚期COPD，在沒(méi)有動(dòng)脈低氧血癥的輕中度COPD患者中也發(fā)現(xiàn)了肺動(dòng)脈重塑現(xiàn)象[15]，主要表現(xiàn)為內(nèi)膜增厚、血管壁面積增加以及中層血管壁增厚[16]。氧療常常不能逆轉(zhuǎn)COPD患者的PAH，且輕度COPD患者通常不存在低氧，這表明此類COPD患者的肺血管重塑包括不能用低氧性血管收縮來(lái)解釋的其他因素。目前針對(duì)未發(fā)生PAH的COPD患者肺血管重塑機(jī)制研究甚少，本研究選取未發(fā)生PAH的輕至中度COPD患者為研究對(duì)象，使用平滑肌標(biāo)記性抗體а-SMA標(biāo)記遠(yuǎn)端肺小動(dòng)脈（血管橫斷面外徑100～500 μm），發(fā)現(xiàn)未發(fā)生PAH的COPD組患者的肺小動(dòng)脈WT、WT%、WA%均較對(duì)照組增高，且肺小動(dòng)脈а-SMA表達(dá)較對(duì)照組增高，提示未發(fā)生PAH的COPD患者存在以平滑肌層增厚、面積增大為表現(xiàn)的遠(yuǎn)端肺小動(dòng)脈重塑。相關(guān)性分析也顯示，肺動(dòng)脈重塑指標(biāo)WA%、WT%與FEV1/FVC、FEV1%pred均呈負(fù)相關(guān)，提示肺小動(dòng)脈重塑與氣流阻塞程度相關(guān)。

ECM是由高度交聯(lián)的分泌蛋白組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，其主要結(jié)構(gòu)成分被稱為“核心基質(zhì)”。ECM的重構(gòu)對(duì)傷口愈合和組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，這一過(guò)程失調(diào)會(huì)導(dǎo)致多種病理狀態(tài)，包括COPD發(fā)生[17]。ECM沉積、肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖和肥大，促進(jìn)肺動(dòng)脈中膜肥大和肌化，導(dǎo)致毛細(xì)血管前肺動(dòng)脈閉塞和PAH持續(xù)升高[13，18]。本研究采用免疫組織化學(xué)檢測(cè)法觀察人遠(yuǎn)端肺小動(dòng)脈ECM沉積情況，結(jié)果顯示COPD組患者肺小動(dòng)脈ECM蛋白（CollagenⅠ、CollagenⅣ、LN、FN）表達(dá)較對(duì)照組增強(qiáng)，提示ECM沉積參與COPD遠(yuǎn)端肺小動(dòng)脈重塑。相關(guān)性分析顯示遠(yuǎn)端肺小動(dòng)脈ECM蛋白表達(dá)與FEV1/FVC、FEV1% pred均呈負(fù)相關(guān)，提示肺小動(dòng)脈ECM沉積也與氣流阻塞程度相關(guān)。

ROS是公認(rèn)的引起血管壁細(xì)胞增殖和血管收縮的刺激因素。在COPD中，ROS從活化的炎性細(xì)胞或結(jié)構(gòu)細(xì)胞如上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中釋放出來(lái)，直接損害細(xì)胞成分。研究[19-20]顯示，ROS參與肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖和EMC的沉積。NOX是脈管系統(tǒng)中產(chǎn)生ROS的重要來(lái)源，低氧誘導(dǎo)的NOX的激活在PAH中起重要作用，NOX促進(jìn)肺血管收縮和血管重塑[21-22]。NOX4是NOX家族成員之一，作為PASMCs中主要的NOX亞型，NOX4通過(guò)介導(dǎo)肺動(dòng)脈平滑肌增生、內(nèi)皮細(xì)胞遷移增殖、分化及凋亡等，參與血管舒縮、血管生成以及PAH的發(fā)生[23]。TGF-β1是一種非活性的潛伏前體，從細(xì)胞分泌出來(lái)后與潛伏期TGF-β1結(jié)合蛋白（latent TGF-β1 binding protein，LTBP）結(jié)合，LTBP引導(dǎo)潛伏期復(fù)合物定位于ECM[24]。PAH患者的肺小動(dòng)脈PASMC顯示出較高水平的TGF-β1細(xì)胞內(nèi)活性，PAH內(nèi)分泌TGF-β1途徑通過(guò)介導(dǎo)表皮生長(zhǎng)因子和血小板源性生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)ECM沉積和PASMC細(xì)胞增殖[25]。

本課題組前期研究[11]顯示：COPD組患者肺組織遠(yuǎn)端肺小動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞TGF-β1蛋白表達(dá)較對(duì)照組增高，提示TGF-β1參與COPD遠(yuǎn)端肺小動(dòng)脈重塑。本研究發(fā)現(xiàn)COPD組患者肺小動(dòng)脈平滑肌及肺組織NOX4表達(dá)均高于對(duì)照組，且采用TGF-β1能夠刺激誘導(dǎo)HPASMC分化并上調(diào)HPASMC細(xì)胞NOX4、а-SMA及CollagenⅠ表達(dá)增強(qiáng)。因此，推測(cè)TGF-β1可能通過(guò)上調(diào)NOX4導(dǎo)致ROS產(chǎn)生增多，并通過(guò)此機(jī)制促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及ECM蛋白的分泌，NOX4/TGF-β1相關(guān)氧化應(yīng)激信號(hào)通路可能參與了ECM介導(dǎo)的COPD肺小動(dòng)脈重塑。

綜上，COPD患者存在以平滑肌層增厚以及細(xì)胞外基質(zhì)沉積為主的肺小動(dòng)脈重塑，TGF-β1介導(dǎo)的NOX4相關(guān)氧化應(yīng)激信號(hào)通路可能參與了COPD肺小動(dòng)脈重塑的發(fā)生。