曾博潔，許劍利，董 珊

（自貢市第一人民醫(yī)院婦科，自貢 643000）

不受控制的增殖是癌細(xì)胞最重要的標(biāo)志，并且在惡性腫瘤的癌變和進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用。在婦科癌癥中，卵巢癌是女性癌癥相關(guān)病死率的主要驅(qū)動(dòng)因素[1]。盡管在過(guò)去的35年中，卵巢癌的發(fā)病率保持相對(duì)平穩(wěn)，但其存活率仍然較低，部分是由于其對(duì)現(xiàn)有療法的抵抗力[2]。約75%的卵巢癌患者對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的化療治療反應(yīng)良好，但卵巢癌通常很快會(huì)復(fù)發(fā)，并對(duì)先前的化療藥物產(chǎn)生耐藥性。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)新的抗卵巢癌藥物以改善臨床結(jié)果。傳統(tǒng)草藥已成為臨床治療的重要組成部分，它們可用于治療100多種疾病。近年來(lái)，傳統(tǒng)草藥因在預(yù)防和治療各種類型癌癥中的重要作用而廣受歡迎，其具有預(yù)防腫瘤發(fā)生、增強(qiáng)治療效果以及減輕毒性的優(yōu)點(diǎn)[3]。有研究[4]顯示，幾種傳統(tǒng)草藥具有前瞻性的抗癌特性，并且傳統(tǒng)草藥中的一些生物活性成分（如康萊特、青蒿素、鬼臼毒素和紫杉醇）已用于臨床治療多種類型的疾病。因此，傳統(tǒng)草藥具有很大的潛力，可以發(fā)展成為新型的抗卵巢癌藥物。

隨著對(duì)中藥抗癌療法的深入研究，天然來(lái)源的抗癌化合物越來(lái)越受到關(guān)注。中藥虎杖（Polygonum cuspidatumSieb.et Zucc），系蓼科植物，具有利濕退黃、清熱解毒、散瘀止痛、止咳化痰等功效。其核心成分是虎杖苷，在腫瘤治療方面具有較高的藥用價(jià)值[5]。藥理研究[6]表明，虎杖水提液能顯著抑制α-葡萄糖苷酶活性。水提液中成分復(fù)雜，多糖是水提液中化學(xué)成分的一部分，目前對(duì)于虎杖多糖的研究尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究旨在探索虎杖多糖能否抑制腫瘤的生長(zhǎng)，并成為新型的抗卵巢癌藥物。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

熒光定量PCR儀購(gòu)自Bio-Rad；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司；酶標(biāo)儀和Image Xpress高內(nèi)涵成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Molecular Devices公司；qTOWER 3.0系統(tǒng)購(gòu)自德國(guó)Analytik Jena公司。

1.2 主要試劑

虎杖多糖（批號(hào)D1713186，純度≥98%）購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；TRIzol試劑、Lipofectamine 3000均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自中國(guó)Takara公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)HyClone公司；結(jié)晶紫染色溶液購(gòu)自中國(guó)Beyotime公司；磷酸鹽緩沖液（Rockville，MD）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；CCK-8試劑（10 μL/孔）購(gòu)自中國(guó)Beyotime公司；RIPA緩沖液購(gòu)自中國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（M0251S）購(gòu)自美國(guó)New England Biolabs公司；SYBR ? Premix Ex TaqTM試劑盒購(gòu)自中國(guó)Takara公司；OVSAHO細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)語(yǔ)純生物公司；Annexin V-FITC染色細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；ECL化學(xué)發(fā)光液購(gòu)自中國(guó)Thermo Scientific公司；引物由Sangon Biotech（中國(guó)上海）合成。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將SKOV3細(xì)胞以適量濃度接種于培養(yǎng)瓶中，分別加入含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2及95%相對(duì)濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞呈貼壁狀態(tài)生長(zhǎng)，每周傳代2~3次，用0.25%胰酶消化2 min傳代。

1.3.2 多糖的制備和碳水化合物含量的測(cè)定 首先將干燥的整株虎杖植物（300 g）切成小塊，然后在95℃下使用2.0 L蒸餾水提取2.5 h共3次，最后通過(guò)多層紗布過(guò)濾。1 500×g離心10 min后，保存上清液并濃縮至1.5 L，并在4℃下用95%乙醇（2.5體積）沉淀過(guò)夜。離心分離沉淀，然后將其溶于蒸餾水中，并用Sevag試劑（氯仿∶丁醇為4∶1）處理除去蛋白質(zhì)。將脫蛋白的溶液凍干，獲得淺棕色多糖提取物（26.5 g）。用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖提取物的總碳水化合物含量為54.0%（g/g）。

1.3.3 MTT法檢測(cè) 將SKOV3細(xì)胞重懸到96孔板中（每孔2 000個(gè)）。24 h后，將虎杖多糖用含5% FBS的培養(yǎng)基稀釋至不同濃度，然后添加至96孔板中。孵育24、48和72 h后，分別添加1 mg·mL-1MTT溶液，孵育4 h后，檢測(cè)細(xì)胞活力。最后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm處的吸光度。

1.3.4 結(jié)晶紫染色法 將SKOV3細(xì)胞以2×104細(xì)胞/孔的濃度重懸在12孔培養(yǎng)板中，并加入5%胎牛血清和1%抗生素的DMEM培養(yǎng)基，放入37℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。加入含有不同濃度的BPP的培養(yǎng)基72 h。加入結(jié)晶紫溶液以覆蓋細(xì)胞表面，并孵育20～30 min。用去離子水洗去殘留的結(jié)晶紫。將培養(yǎng)板風(fēng)干并用掃描儀拍照。用1% SDS試劑溶解結(jié)晶紫，并通過(guò)在檢測(cè)570 nm下的光密度值來(lái)確定濃度。

1.3.5 qRT-PCR檢測(cè) 采用定量PCR（qPCR）分析OC細(xì)胞樣品中P65 mRNA表達(dá)水平。使用TRIzol從SKOV3細(xì)胞中提取總RNA樣品。通過(guò)M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄來(lái)自O(shè)VSAHO細(xì)胞的RNA樣品。使用qTOWER 3.0系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)增和溶解曲線分析。使用SYBRRPremix Ex TaqTM試劑盒進(jìn)行反應(yīng)，總反應(yīng)體積為10 μL。使用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.6 免疫印跡 收集細(xì)胞制備蛋白質(zhì)樣品，通過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）進(jìn)行分離，然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用BSA固定PVDF膜4 h后，將膜在TBST中洗滌3次（5 min/次），然后將膜放入一抗（1 000倍稀釋）在4℃下孵育過(guò)夜。將膜放入TBST中洗滌3次（5 min/次），以除去殘留的一抗，并與相應(yīng)的二抗在37℃溫育45 min。根據(jù)ECL化學(xué)發(fā)光液說(shuō)明書(shū)操作，在膜上滴入ECL化學(xué)發(fā)光液，并使用凝膠成像系統(tǒng)顯影。

1.3.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 將處理后的細(xì)胞在4℃的70%乙醇中固定4 h。用PBS洗滌2次后，將細(xì)胞重懸于含有RNase A和碘化丙啶（10 ng·mL-1和50 μg·mL-1）的檸檬酸鹽緩沖液中，并在37℃孵育30 min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。使用ModFit 161 LT 3.0版軟件（美國(guó)Verity Software House公司）分析數(shù)據(jù)。

1.3.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 孵育后，收集細(xì)胞并在預(yù)冷的PBS中洗滌。加入Annexin V和PI在室溫下染色15 min，并立即通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.3.9 單克隆形成實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為4×102個(gè)/mL，每孔2 mL接種于6孔培養(yǎng)板中，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁，棄去原有的培養(yǎng)液，分別加入10、20 μmol·L-1虎杖多糖。RPMI1640培養(yǎng)基組作為空白對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后撤去加藥的培養(yǎng)基，換成正常的新鮮培養(yǎng)基放于37℃、5% CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)，且每隔2~3 d換液，并于光學(xué)顯微鏡下觀察克隆的形成。大約15 d后，6孔板中出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的克隆時(shí)終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液，用每孔1 mL的PBS清洗2次，每孔加1 mL的4%多聚甲醛固定30 min，棄去固定液，用PBS清洗2次。每孔加入1 mL結(jié)晶紫染色液染色20 min左右，然后用PBS緩慢洗去染色液。

1.3.10 TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將細(xì)胞爬片用PBS清洗2次，0.5%Triton X-100室溫孵育5 min，加入50 μL TUNEL檢測(cè)液（TdT酶∶熒光標(biāo)記液=1∶9）于37℃避光孵育60 min，PBS洗3次，用抗熒光淬滅封片劑封片后于熒光顯微鏡下觀察，用ImageJ圖像分析軟件進(jìn)行定量統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行處理，經(jīng)正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)后，符合正態(tài)分布且方差齊的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x+s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析或重復(fù)測(cè)量方差分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 虎杖多糖對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響

MTT檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，當(dāng)虎杖多糖濃度為0～5 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞增殖無(wú)變化（P＞0.05）。當(dāng)虎杖多糖濃度＞10 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞增殖受到抑制（P均＜0.05）。本研究采用10、20 μmol·L-1虎杖多糖進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 虎杖多糖對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響

2.2 虎杖多糖對(duì)P65 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2，與對(duì)照組相比，添加10、20 μmol·L-1虎杖多糖的細(xì)胞中P65 mRNA表達(dá)水平降低（P均＜0.05）。

圖2 虎杖多糖對(duì)P65 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

2.3 虎杖多糖對(duì)總P65蛋白以及核內(nèi)P65蛋白表達(dá)水平的影響

免疫印跡檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3，與對(duì)照組相比，添加10、20 μmol·L-1虎杖多糖的細(xì)胞中P65蛋白和核內(nèi)P65蛋白表達(dá)水平均降低（P均＜0.05）。

圖3 虎杖多糖對(duì)p65蛋白表達(dá)水平的影響

2.4 虎杖多糖對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

為了驗(yàn)證虎杖多糖對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，本研究用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡率，結(jié)果見(jiàn)圖4。與對(duì)照組相比，添加10、20 μmol·L-1虎杖多糖的細(xì)胞凋亡率增高（P均＜0.05）。

圖4 虎杖多糖對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

2.5 虎杖多糖對(duì)細(xì)胞周期的影響

為了探討虎杖多糖抑制SKOV3細(xì)胞增殖活性的可能機(jī)制，本研究用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了細(xì)胞周期的變化，虎杖多糖可明顯誘導(dǎo)S期阻滯，見(jiàn)圖5。

圖5 虎杖多糖對(duì)細(xì)胞周期的影響

2.6 虎杖多糖對(duì)細(xì)胞增殖的影響

如圖6所示，虎杖多糖可明顯抑制SKOV3細(xì)胞的增殖，并且隨濃度增高抑制效果逐漸增強(qiáng)。

圖6 虎杖多糖對(duì)細(xì)胞增殖的影響（×400）

3 討論

卵巢癌是病死率最高的婦科腫瘤，嚴(yán)重影響了婦女健康[7]。傳統(tǒng)草藥在癌癥的預(yù)防和治療中可發(fā)揮關(guān)鍵作用?；⒄茸鳛閭鹘y(tǒng)草藥，具有潛在的止血、止痛、抗炎和抗癌作用。目前關(guān)于虎杖多糖對(duì)卵巢癌抑制作用的研究較少。卵巢癌的化療耐藥及復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是醫(yī)學(xué)界待攻克的一大難題，需要研究新藥物和新的治療策略來(lái)改善卵巢癌的預(yù)后。中藥成分開(kāi)發(fā)正在成為發(fā)現(xiàn)抗癌藥物的新方法[8]。核因子NF-κB（nuclear factor kappa B）是一類具有多種生理功能的轉(zhuǎn)錄因子，主要由P65（RelA）、RelB，cRel、P52/P100及P52/P100等成員組成。正常生理狀態(tài)下，NF-κB在細(xì)胞質(zhì)中與IκB結(jié)合，呈無(wú)活性三聚體狀態(tài)。當(dāng)機(jī)體受到損傷、病毒或自由基等刺激后，IκB發(fā)生磷酸化降解，激活NF-κB使之移至核內(nèi)，從而促進(jìn)細(xì)胞因子、炎性因子以及趨化因子的轉(zhuǎn)錄[9]。有研究[10]表明，NF-κB/P65信號(hào)通路在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程均占有重要的地位。

虎杖具有活血定痛、清熱利濕、止咳化痰作用，臨床用于治療濕熱黃疽、肺熱咳嗽、瘡癰腫毒、關(guān)節(jié)痹痛、水火燙傷等[11]。虎杖多糖是一種天然的多酚類化合物，主要存在于虎杖這一傳統(tǒng)中草藥中，目前已收錄于《中國(guó)藥典》?；⒄溶漳軌蛘T導(dǎo)急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡[12]；誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞的增殖周期停滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]；還通過(guò)上調(diào)Bax/Bcl-2蛋白的比例以及減弱β反應(yīng)蛋白信號(hào)抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖[14]。本研究通過(guò)免疫印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著虎杖多糖濃度增加，P65蛋白和核內(nèi)P65蛋白表達(dá)水平均下降，證明虎杖多糖對(duì)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3的P65蛋白有抑制作用，從而達(dá)到抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、影響細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄表達(dá)、進(jìn)而抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。

綜上，虎杖多糖可能通過(guò)NF-κB/P65信號(hào)通路抑制卵巢癌細(xì)胞增殖，并促進(jìn)其凋亡。但由于虎杖多糖具有廣泛的生物學(xué)作用，并非作用單一靶點(diǎn)，因此還需要更進(jìn)一步討論虎杖多糖是否還通過(guò)其他途徑發(fā)揮了生理學(xué)作用，進(jìn)而為臨床研究提供理論依據(jù)。