馬利亞，趙 吉，李曉玉，謝永鑫，郭 新，楊惠芳

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)環(huán)境因素與慢性病控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004）

農(nóng)藥有導(dǎo)致免疫力下降、誘發(fā)慢性疾病、引起肝臟病變及致癌致畸致突變的危害[1]。本課題組前期對(duì)銀川市近郊蔬菜大棚內(nèi)農(nóng)藥殘留進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)氟氯氰菊酯的檢出率最高[2]。氟氯氰菊酯可對(duì)人類構(gòu)成潛在健康威脅，其暴露可引起神經(jīng)和生殖系統(tǒng)損傷[3-6]。研究[7-8]發(fā)現(xiàn)，擬除蟲菊酯可降低精子的濃度、質(zhì)量以及破壞精子DNA，還可引起成年男性的生殖損傷。本課題組前期研究[9]發(fā)現(xiàn)，暴露于氟氯氰菊酯可抑制大鼠睪丸抑制素B（INHB）的表達(dá)。INHB由生殖系統(tǒng)細(xì)胞分泌，是睪丸生精的主要標(biāo)記物，反映男性睪丸生精能力[10]。表明氟氯氰菊酯對(duì)大鼠睪丸具有一定的毒性作用，但其作用機(jī)制尚不明確。

干擾素刺激基因（STING）是在研究天然免疫信號(hào)通路過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的新型接頭蛋白，在機(jī)體抗感染、炎性反應(yīng)及抗腫瘤等方面都發(fā)揮了重要作用。在創(chuàng)傷性腦損傷中，STING表達(dá)上調(diào)導(dǎo)致促炎性細(xì)胞因子表達(dá)增加，自噬減少[11]。STING在氟氯氰菊酯所致大鼠睪丸損傷中的機(jī)制尚不明確。本研究探討STING在氟氯氰菊酯誘導(dǎo)大鼠睪丸損傷中的作用，確定農(nóng)藥暴露早期生物標(biāo)記物，以期為人群健康危險(xiǎn)度評(píng)估提供基礎(chǔ)資料，并為其預(yù)防和救治提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

氟氯氰菊酯（英國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司）；金龍魚牌玉米油；丙二醛（MDA）試劑盒（北京Solarbio公司）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成生物研究所）、乳酸脫氫酶（LDH）檢測(cè)試劑盒（北京Solarbio公司）；BCA蛋白檢測(cè)試劑盒（江蘇凱基公司）；全蛋白提取試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（上海碧云天公司）；STING一抗（美國(guó)Abcam公司）；白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、GAPDH一抗（中國(guó)Affinity公司）；蛋白Marker（Thermo公司）；TRIzol（Invitrogen公司）；引物由上海生工合成。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

40只SPF級(jí)雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量270 g左右，購(gòu)自遼寧昌盛生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（Liao）2015-0001。大鼠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房，環(huán)境溫度（22±2）℃，相對(duì)濕度為60%~70%，光照（8:30～20:30）和黑暗（20:30～8:30）交替保持12 h，自由飲水和飲食。待大鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，最終設(shè)置對(duì)照組（玉米油）、氟氯氰菊酯低劑量組（6.25 mg·kg-1，低劑量組）、氟氯氰菊酯中劑量組（12.50 mg·kg-1，中劑量組）和氟氯氰菊酯高劑量組（25.00 mg·kg-1，高劑量組），每組10只。對(duì)大鼠進(jìn)行隔天稱重，根據(jù)前一天稱取的體質(zhì)量配制染毒藥物。采用等濃度法進(jìn)行灌胃染毒，對(duì)照組大鼠灌胃等量玉米油，隔天染毒，持續(xù)4周。最后用10%水合氯醛麻醉并處死大鼠，在無(wú)菌條件下收集睪丸組織。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 HE染色 將睪丸組織從10%的福爾馬林溶液中取出，并在通風(fēng)櫥中用手術(shù)刀切割。組織的厚度約為3 mm。將修剪好的組織和相應(yīng)的標(biāo)簽放入脫水箱，在75%、85%、90%和95%的乙醇梯度中脫水1 h，在無(wú)水乙醇1中脫水30 min，無(wú)水乙醇2中脫水30 min，隨后置于二甲苯1和二甲苯2中分別脫水5 min。經(jīng)過(guò)包埋、切片和染色后，用顯微鏡（20×）觀察睪丸組織的結(jié)構(gòu)變化。

1.3.2 透射電鏡 取體積為3 mm×1 mm×1 mm的新鮮睪丸組織，迅速放入4℃的電鏡固定液中2~4 h，室溫（20℃）下在1%滲透壓0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖液PB（pH 7.4）中固定2 h。組織先后經(jīng)過(guò)50%→70%→80%→90%→95%→100%→100%乙醇→100%丙酮脫水，每次15 min；環(huán)氧樹脂包埋，將樣本插入包埋板中，置于37℃烘箱過(guò)夜，60℃烘箱聚合48 h；超薄切片機(jī)切60～80nm超薄切片；鈾-鉛雙重染色（2%乙酸鈾酰飽和乙醇溶液，檸檬酸鉛，每次染色15 min），切片在室溫下干燥過(guò)夜。在透射電子顯微鏡下觀察，采集圖像進(jìn)行分析。

1.3.3 乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測(cè) 選用LDH檢測(cè)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞膜的損傷程度。稱取不同組的大鼠睪丸組織約0.1 g，加入200 μL生理鹽水進(jìn)行冰浴勻漿；2 500 r·min-1離心20 min，取上清液，置于冰上，酶標(biāo)儀預(yù)熱后在450 nm處檢測(cè)OD值，按公式LDH活力（U·gprot-1）=（OD測(cè)定-OD對(duì)照）/（OD標(biāo)準(zhǔn)-OD空白）×0.2（μmol·mL-1）/待測(cè)樣本蛋白濃度（gprot·mL-1）計(jì)算，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3.4 丙二醛（MDA）檢測(cè) 稱取約0.1 g組織，加入1 mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿；8 000×g、4℃離心10 min，取上清液，置冰上待測(cè)。根據(jù)MDA試劑盒說(shuō)明進(jìn)行加樣，分別測(cè)定各樣本在450 nm、532 nm和600 nm處的吸光度，按照公式MDA含量（nmol·g-1）=5×［12.9×（ΔA532-ΔA600）-2.58×ΔA450］計(jì)算，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3.5 超氧化物歧化酶（SOD）檢測(cè) 稱取約0.1 g組織，加入0.9 mL生理鹽水，剪碎組織進(jìn)行冰浴勻漿；2 500 r·min-1離心10 min，取10%勻漿上清液置冰上待測(cè)。樣本準(zhǔn)備好后用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。根據(jù)SOD試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作，測(cè)定各樣本在450 nm處的OD值。SOD抑制率（%）=［（A對(duì)照-A對(duì)照空白）-（A測(cè)定-A測(cè)定空白）］/（A對(duì)照-A對(duì)照空白）×100%，SOD活力（U·mgprot-1）=SOD抑制率（%）/50%×12/待測(cè)樣本蛋白濃度（mgprot·mL-1），實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3.6 Western blot檢測(cè) 根據(jù)蛋白提取試劑盒提取睪丸組織總蛋白并采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。變性后取10 μg總蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜后，3%BSA封閉1 h，于1∶1 000稀釋的一抗中4℃孵育過(guò)夜，經(jīng)TBST洗滌3次，10 min/次，再于1∶1 000稀釋的二抗室溫孵育1 h，TBST清洗3次，10 min/次，滴加ECL發(fā)光液曝光。并采用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。根據(jù)內(nèi)參（GADPH）標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算目標(biāo)條帶相對(duì)值，判斷蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.7 q-PCR檢測(cè) 取出冷凍睪丸組織置于冰上，根據(jù)TRIzol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性10 s、60℃退火30 s、60℃延長(zhǎng)30 s，45個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)擴(kuò)增曲線數(shù)據(jù)，每個(gè)樣品重復(fù)試驗(yàn)3次。分析擴(kuò)增曲線后計(jì)算2-ΔΔCt，分析相關(guān)因子的mRNA表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANVOA），兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 氟氯氰菊酯對(duì)大鼠睪丸損傷的影響

2.1.1 病理切片觀察大鼠睪丸中細(xì)胞形態(tài) 對(duì)照組中，大鼠睪丸的生精小管分界清楚，排列相對(duì)松散，腔內(nèi)的支持細(xì)胞和生精細(xì)胞排列緊密，分界清晰，無(wú)異常；氟氯氰菊酯各劑量組中大鼠睪丸內(nèi)支持細(xì)胞和生精細(xì)胞形狀不規(guī)則，數(shù)量減少，且隨著染毒劑量的增加變化越明顯（圖1）。

圖1 各組大鼠睪丸中的細(xì)胞形態(tài)病理切片（HE×20）

2.1.2 透射電鏡觀察大鼠睪丸超微結(jié)構(gòu)變化 對(duì)照組大鼠睪丸中精子細(xì)胞膜完整，細(xì)胞器豐富，細(xì)胞核呈圓形，核膜完整清晰，染色質(zhì)均勻分布，頂體連續(xù)完整，線粒體豐富且均勻分布；氟氯氰菊酯低劑量組的精子細(xì)胞表現(xiàn)為輕度水腫，細(xì)胞膜完整，圓核，核膜完整，染色質(zhì)分布均勻，頂體連續(xù)且完整，線粒體輕微腫脹；氟氯氰菊酯中劑量組精子細(xì)胞中度水腫，細(xì)胞膜完整，細(xì)胞核不規(guī)則，染色質(zhì)稀疏，核膜部分上浮，核周間隙增寬，頂體結(jié)構(gòu)完整，線粒體中度腫脹；氟氯氰菊酯高劑量組精子細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重的水腫、空泡化，細(xì)胞核不規(guī)則，染色質(zhì)稀疏，核膜與頂體均不清晰，線粒體嚴(yán)重腫脹，嵴呈管狀泡狀，局部膜基質(zhì)變淺，呈空泡狀（圖2）。

圖2 透射電子顯微鏡觀察氟氯氰菊酯暴露對(duì)大鼠睪丸細(xì)胞影響（5 μm）

2.2 細(xì)胞損傷及氧化應(yīng)激損傷指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

與對(duì)照組相比，中、高劑量組LDH含量均增加（F=12.87，P＜0.05），低、中、高劑量組MDA含量均升高（F=9.465，P＜0.05），中、高劑量組SOD活力降低（F=12.42，P＜0.05），見圖3。

圖3 氟氯氰菊酯染毒后大鼠睪丸中LDH、MDA及SOD的變化

2.3 氟氯氰菊酯染毒大鼠后對(duì)睪丸中STING和炎癥的影響

q-PCR與Western blot結(jié)果均顯示，與對(duì)照組相比，低、中、高劑量組STING、IL-6與TNF-α的mRNA和蛋白表達(dá)水平均上調(diào)（P均＜0.05），見圖4。

圖4 氟氯氰菊酯染毒后大鼠睪丸中STING、IL-6與TNF-α的表達(dá)變化

3 討論

擬除蟲菊酯是高效、低毒、低殘、廣譜的環(huán)保型農(nóng)藥，在全世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用，其低毒性和長(zhǎng)期使用危害越來(lái)越引起人們的注意。擬除蟲菊酯及其代謝物在人類母乳和尿液等樣本中已被檢測(cè)到[12]，對(duì)人類健康構(gòu)成了威脅?，F(xiàn)有研究[13]表明，擬除蟲菊酯對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟、腎臟和男性生殖系統(tǒng)有不良影響。擬除蟲菊酯類殺蟲劑通過(guò)改變生殖激素的水平從而對(duì)睪丸激素水平產(chǎn)生不利的影響[14-15]。此外，擬除蟲菊酯殺蟲劑能降低精液的濃度和活性，增加異常精子的數(shù)量[16]。同時(shí)，擬除蟲菊酯通過(guò)破壞男性生殖器官的結(jié)構(gòu)和功能，從而損害男性生殖健康[17]。氯氰菊酯和溴氰菊酯對(duì)睪丸的損害體現(xiàn)在精子數(shù)量、精子活力、精子形態(tài)和睪丸激素水平上。有研究[4]發(fā)現(xiàn)，氟氯氰菊酯能引起精子的形態(tài)異常與死亡。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)HE染色在顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，隨著氟氯氰菊酯劑量的增加，生精細(xì)胞和支持細(xì)胞的數(shù)量逐漸減少，這與Sharma等[5]的研究結(jié)果一致，即氟氯氰菊酯暴露導(dǎo)致睪丸中的精子數(shù)量明顯減少。Taib等[6]研究發(fā)現(xiàn)，低毒倍硫磷可導(dǎo)致大鼠睪丸中的精子細(xì)胞腫脹，線粒體數(shù)量增加，并出現(xiàn)脂滴。這說(shuō)明氟氯氰菊酯對(duì)大鼠睪丸超微結(jié)構(gòu)造成了損傷，與本課題組前期研究結(jié)果一致[9]。

自噬伴隨著細(xì)胞膜的破裂[18]。通常情況下，LDH只存在于活細(xì)胞中，當(dāng)細(xì)胞膜受損時(shí)，LDH會(huì)從細(xì)胞膜上釋放出來(lái)，因此根據(jù)游離LDH的水平可以間接評(píng)估細(xì)胞的損傷程度。本研究通過(guò)檢測(cè)LDH的活性來(lái)驗(yàn)證氟氯氰菊酯對(duì)大鼠睪丸的毒性，發(fā)現(xiàn)低、中劑量組的LDH活性并未增加，可能是由于灌胃周期較短，低劑量的氟氯氰菊酯誘導(dǎo)了細(xì)胞的異常增殖，但細(xì)胞膜尚能維持正常功能。

ROS與糖尿病、腎損傷等多種疾病密切相關(guān)[19]。睪丸結(jié)構(gòu)和功能的惡化會(huì)直接影響精子生成。在男性不育的發(fā)病機(jī)制中，ROS起著重要作用[20]。據(jù)報(bào)道[21]，ROS會(huì)破壞男性和女性生殖細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致其功能紊亂。在正常情況下，人體保持氧化-抗氧化劑平衡的機(jī)制。SOD是體內(nèi)重要的抗氧化酶，可清除體內(nèi)釋放的過(guò)多自由基，減少細(xì)胞膜的損傷。MDA是間接反映人體的氧化損傷的指標(biāo)[22]。作為影響精子功能的信使之一，精子從睪丸到卵細(xì)胞的過(guò)程中，低水平的ROS可以調(diào)節(jié)精子功能，促進(jìn)精子獲能，并調(diào)節(jié)精子的成熟[23]。在精子獲得受精的過(guò)程中，低水平的ROS是必不可少的。Aitken等[24]首先提出了低水平的ROS可以調(diào)節(jié)精子的生理功能，并發(fā)現(xiàn)精子與透明帶結(jié)合的能力可以通過(guò)低水平的ROS來(lái)增強(qiáng)，這表明低水平的ROS可能對(duì)精子產(chǎn)生好的影響。然而，人類的精子特別容易受到氧化損傷，而且ROS的產(chǎn)生和抗氧化能力之間的不平衡將導(dǎo)致男性不育[25-26]。有研究[27]顯示，通過(guò)對(duì)比不育與可育男子精子中的氧化水平，發(fā)現(xiàn)ROS的過(guò)度產(chǎn)生會(huì)對(duì)精子造成損害。本研究結(jié)果表明，隨著氟氯氰菊酯濃度的增加，MDA水平增加，SOD水平減少，這說(shuō)明氟氯氰菊酯染毒后大鼠睪丸組織氧化應(yīng)激水平增加，發(fā)生氧化性損傷。

STING作為固有免疫系統(tǒng)的一個(gè)關(guān)鍵性接頭蛋白，在宿主抵御外界病原菌的入侵中發(fā)揮了重要作用，同時(shí)STING又具有炎癥分子的特征，與機(jī)體的炎性反應(yīng)密不可分。STING最初作為一個(gè)免疫炎性因子被報(bào)道，有研究[28]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激增加可以激活STING，活化后的STING可以促進(jìn)體內(nèi)炎癥反應(yīng)的發(fā)生。同時(shí)它可以調(diào)控腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）等炎癥因子的表達(dá)[29-30]。在百草枯誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷中，STING表達(dá)水平升高[11]。在本研究中，STING、IL-6及TNF-α的表達(dá)水平均隨染毒劑量的升高而上調(diào)。結(jié)合之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，說(shuō)明在氟氯氰菊酯染毒后大鼠睪丸發(fā)生氧化損傷并伴隨炎性反應(yīng)的產(chǎn)生，與沈艾[31]的研究結(jié)果一致。

綜上所述，氟氯氰菊酯具有一定的生殖毒性，STING可能通過(guò)正向調(diào)控炎性因子TNF-α與IL-6的表達(dá)促進(jìn)大鼠睪丸炎性反應(yīng)。在結(jié)直腸癌中，STING可能通過(guò)抑制AMPK并促進(jìn)mTOR相關(guān)通路進(jìn)而進(jìn)一步抑制mTOR下游重要靶點(diǎn)S6K1的磷酸化[32]，猜測(cè)可能因?yàn)镾TING能夠抑制AMPK介導(dǎo)的自噬信號(hào)通路從而發(fā)揮調(diào)控作用。因此后續(xù)將進(jìn)一步探討STING及AMPK/mTOR/P70S6K介導(dǎo)的自噬通路在氟氯氰菊酯誘導(dǎo)大鼠睪丸損傷中的作用。