楊英來 趙建廣 陳 赫 崔子峰

腮腺區(qū)的疾病構(gòu)成廣泛，臨床表現(xiàn)多樣，位置特殊，對(duì)頜面部功能、美觀及心理要求高，但其術(shù)前禁忌行病理活檢，病理類型復(fù)雜，鑒別困難，因此腮腺病變最初的診斷策略對(duì)明確診斷及治療方案的制訂顯得尤為重要[1]。目前在臨床工作中術(shù)前較多應(yīng)用影像學(xué)和細(xì)針吸取細(xì)胞學(xué)診斷來評(píng)估腫瘤，而FNAC是基于對(duì)細(xì)胞、細(xì)胞群或組織微粒評(píng)估的一種簡(jiǎn)捷、準(zhǔn)確的細(xì)胞學(xué)診斷方法，盡管分子發(fā)病機(jī)制多樣且生物學(xué)行為各不相同，但許多不同的腮腺腫瘤通常在細(xì)胞學(xué)上相似，這使得FNAC對(duì)鑒別腮腺腫瘤的價(jià)值存在爭(zhēng)議[2]。另外腫瘤標(biāo)記物也能提高診斷的準(zhǔn)確性，因此本研究擬評(píng)估FNAC在腮腺腫瘤中的診斷特性并聯(lián)合利用GFAP、Fas-FasL免疫組化以評(píng)估其診斷價(jià)值。

資料和方法

1.材料

回顧河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院口腔頜面外科2014年9月至2019年6月期間的腮腺腫瘤患者383例。入組標(biāo)準(zhǔn)：①具有完善的病例資料，包括性別、年齡、術(shù)前FNAC及術(shù)后組織病理學(xué)診斷報(bào)告；②FNAC均在超聲引導(dǎo)下完成，除送細(xì)胞學(xué)檢測(cè)外還將剩余樣本按照本研究方法成功制作細(xì)胞塊；③FNAC及術(shù)后組織病理學(xué)診斷均分別由我院細(xì)胞學(xué)室及病理科2名以上專職醫(yī)師完成。

2.方法

（1）超聲引導(dǎo)下穿刺：經(jīng)超聲探查、定位腫瘤，用20ml注射器配6號(hào)針頭，于定位點(diǎn)引導(dǎo)下經(jīng)皮刺入腮腺腫瘤內(nèi)，拉針?biāo)ňS持負(fù)壓不出針在4～5個(gè)不同方向提插，直至獲得足夠的樣本，除3～4張用于傳統(tǒng)細(xì)胞涂片送細(xì)胞學(xué)室檢測(cè)外，保留足夠樣本用于制作細(xì)胞塊。

（2）細(xì)胞塊制作：將穿刺出的組織或液體附于載玻片上，在豎起載玻片不流動(dòng)的情況浸入95%乙醇中0.5～1.0min，取出后用穿刺針將樣本集聚成小塊狀，再浸入10%中性甲醛溶液中30～60min，擦鏡紙包裹固定后的樣本放入脫水盒，后續(xù)按照活檢小標(biāo)本方法常規(guī)行脫水、透明、浸蠟，最終完成石蠟包埋。

（3）免疫組織化學(xué)檢測(cè)兔抗人膠質(zhì)纖維酸性蛋白多克隆抗體濃縮液GFAP，鼠抗人Fas單克隆抗體、兔抗人FasL多克隆抗體Fas-FasL蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)置于中杉金橋（北京）公司。對(duì)FNAC細(xì)胞塊行免疫組化，用已知陽性組織作為陽性對(duì)照，以PBS代替一抗作為空白對(duì)照。

（4）統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Kappa一致性檢驗(yàn)用于比較術(shù)前FNAC和術(shù)后組織病理學(xué)診斷，組間陽性率比較采用χ2檢驗(yàn)（包括連續(xù)校正法和Fisher確切概率法，兩兩比較使用卡方分割法），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.在383例病例中，36例因病例資料不完善或FNAC樣本未成功制作成細(xì)胞塊而被排除。對(duì)347例納入研究的病例進(jìn)行分析，其中男性198例（57.06%），女性149例（42.94%），平均年齡為53.10±13.47歲（范圍：6～83歲）。術(shù)前FNAC中疑似惡性或惡性68例，良性279例；術(shù)后組織病理學(xué)診斷中惡性52例，良性295例，其中最多見的惡性腫瘤為ACC（19/347，5.48%），最多見的良性腫瘤為PA（193/347，55.62%）。

2.FNAC對(duì)腮腺惡性腫瘤診斷的陽性預(yù)測(cè)值為57.35%，陰性預(yù)測(cè)值為95.34%，靈敏性為75.00%，特異性為90.17%，對(duì)研究例病例診斷的準(zhǔn)確率為87.90%，F(xiàn)NAC與組織病理學(xué)診斷有中等一致性（Kappa＝0.578）。假陰性、假陽性診斷較多出現(xiàn)于ACC與PA中（表1～3）。

表1 FNAC與組織病理學(xué)診斷結(jié)果對(duì)比

3.除外3例淋巴瘤，總共有16例腮腺ACC具有足夠的細(xì)胞塊樣本，選取同樣條件的PA 37例，腮腺正常組織塊37例，共90例行GFAP，F(xiàn)as及FasL免疫組化（表4、5）。

表4 Fas及FasL表達(dá)結(jié)果及統(tǒng)計(jì)分析

Fas及FasL：37例組織學(xué)診斷為正常腮腺組織的標(biāo)本經(jīng)免疫組化學(xué)染色后，36例顯示陽性，1例為陰性；37PA例組織學(xué)診斷為的標(biāo)本經(jīng)免疫組織化學(xué)染色后，34例顯示陽性，3例為陰性；16ACC例組織學(xué)診斷為的標(biāo)本經(jīng)免疫組化染色后，16例均顯示陰性。通過檢驗(yàn)，三組中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，（對(duì)Fas-fasl，差異分析P值小于0.05，說明三組間的檢驗(yàn)結(jié)果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；經(jīng)卡方分割法兩兩比較可知；正常組別與PA相比（χ2＝0.264，P＝0.607＞0.017），正常組陽性率與PA組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；正常組與ACC組相比（χ2＝48.534，P＝0.001＜0.017），正常組陽性率與ACC組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，正常組陽性率高于ACC組；ACC組別與PA相比（χ2＝40.013，P＝0.001＜0.017），ACC組陽性率低于PA組）。

表2 假陰性病例的FNAC和組織病理學(xué)診斷

表3 假陽性病例的FNAC和組織病理學(xué)診斷

GFAP：37例組織學(xué)診斷為正常腮腺組織的標(biāo)本經(jīng)免疫組化學(xué)染色后，35例顯示陰性，2例為陽性；37PA例組織學(xué)診斷為的標(biāo)本經(jīng)免疫組織化學(xué)染色后，37例顯示陽性，3例為陰性；16ACC例組織學(xué)診斷為的標(biāo)本經(jīng)免疫組化染色后，16例均顯示陰性。通過檢驗(yàn)，在三組中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表5 GFAP表達(dá)結(jié)果及統(tǒng)計(jì)分析

圖1 、2 免疫組化：正常腮腺、AP中Fas及FasL陽性表達(dá)（ ×200 ×400）

圖3 、4 免疫組化：AP中GFAP陽性表達(dá)（ ×200 ×400）

討 論

涎腺腫瘤約80%發(fā)生在腮腺。涎腺腫瘤的主要治療方式是外科手術(shù)切除，良惡性腫瘤的手術(shù)方式和手術(shù)范圍不同，治療方案主要取決于腫瘤的組織學(xué)類型，這就對(duì)腮腺腫瘤的術(shù)前診斷提出了挑戰(zhàn)[1]?？紤]腮腺本身的生理功能、腮腺中與腮腺床上重要的神經(jīng)血管以及腮腺腫瘤的特異性，在臨床實(shí)踐中幾乎被視為禁忌。因此術(shù)前鑒別涎腺腫瘤的良惡性在制定手術(shù)計(jì)劃中起著重要的作用。由于涎腺腫瘤在早期缺乏特異性癥狀和體征，術(shù)前在臨床上難以確定其性質(zhì)，在臨床工作中術(shù)前較多應(yīng)用CT、MRI、超聲等影像學(xué)來評(píng)估腫瘤[2]。

FNAC已較廣泛的應(yīng)用于甲狀腺腫瘤，乳腺腫瘤等；在涎腺腫瘤中，研究顯示:與涎腺檢查和放射學(xué)評(píng)估相比，F(xiàn)NAC被認(rèn)為對(duì)涎腺腫瘤具有更高的診斷準(zhǔn)確性[3]。但也有部分學(xué)者研究表明，盡管它在近1/3的病例中消除了手術(shù)治療的可能性，但由于其敏感性低和細(xì)胞學(xué)活檢結(jié)果的差異，其臨床益處仍然受到質(zhì)疑[4]。部分學(xué)者認(rèn)為術(shù)前行FNAC是不必要的，無論FNAC結(jié)果的準(zhǔn)確性如何，即便可能出現(xiàn)的假陽性和假陰性結(jié)果，其均需手術(shù)治療，因此不需要術(shù)前行FNAC；但是由于良性腮腺腫瘤和惡性腮腺腫瘤的手術(shù)方案的選擇具有差異，所以有相當(dāng)多的研究者主張術(shù)前對(duì)于腮腺腫瘤患者行FNAC的是必要的[5]。與傳統(tǒng)FNAC相比較，超聲引導(dǎo)下的FNAC的適應(yīng)證更廣：①傳統(tǒng)FNAC不能成功穿刺的腫塊，如直徑＞1cm但不能觸及的腫塊；②腫塊可觸及但直徑＜1cm；③深部腮腺區(qū)腫塊；④鄰近血管或神經(jīng)的腫塊；⑤囊性或混合性腫塊。雖然超聲引導(dǎo)下穿刺活檢能夠獲取較多的組織，但對(duì)腮腺腫瘤的生物學(xué)行為、惡性程度及預(yù)后的研究多從病理形態(tài)學(xué)的角度研究。受觀察人員的主觀因素影響而不能全面準(zhǔn)確的指導(dǎo)臨床治療措施及腫瘤預(yù)后的效果[2，6]。所以尋求從分子生物學(xué)角度研究腮腺腫瘤的性質(zhì)和轉(zhuǎn)歸，可以準(zhǔn)確的篩選具有高復(fù)發(fā)、高轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤患者，從而能夠制定合理的治療方案和臨床用藥。另外近年來，細(xì)胞蠟塊免疫組化檢查是一種介于涂片細(xì)胞學(xué)和病理組織學(xué)之間的一種有效的臨床診斷方法，利用細(xì)針穿刺標(biāo)本呈現(xiàn)局部組織病理學(xué)形態(tài)，細(xì)胞蠟塊切片中細(xì)胞數(shù)量豐富而且相對(duì)集中，為進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色后分子病理學(xué)檢測(cè)提供了良好的樣本平臺(tái)。

通過超聲引導(dǎo)下穿刺而制成的細(xì)胞塊具有如下優(yōu)點(diǎn)：①細(xì)胞塊切片能保持部分原有組織的排列結(jié)構(gòu)，細(xì)胞成分豐富，圖像背景清晰，易于作出準(zhǔn)確診斷；②切片的細(xì)胞集中，克服了傳統(tǒng)穿刺涂片中細(xì)胞重疊堆積、厚薄不均的現(xiàn)象；③細(xì)胞塊可連續(xù)切片，能有效減少漏診；④可反復(fù)重切，克服傳統(tǒng)穿刺涂片固定不佳、脫片、染色失敗等難以彌補(bǔ)的缺陷；⑤能作多種組織化學(xué)染色、免疫組織化學(xué)染色或分子病理學(xué)檢測(cè)[2，7]。但是通過該方法制作的細(xì)胞塊也有一定的局限性，在穿刺吸出物極少時(shí)難以完成。

本研究應(yīng)用細(xì)針穿刺細(xì)胞技術(shù)聯(lián)合免疫組化，試圖找到一個(gè)能夠確切地區(qū)別幵的標(biāo)記物，將會(huì)是解決這些診斷難題和選擇正確治療方法的關(guān)鍵。經(jīng)過大量的文獻(xiàn)閱讀，慎重篩選后得出的標(biāo)記物。應(yīng)用GFAP（膠質(zhì)纖維酸性蛋白）和Fas及FasL對(duì)細(xì)胞塊制備后進(jìn)行免疫組織染色[8，9]，我們本次試驗(yàn)結(jié)果顯示GFAP和Fas及FasL在在三組中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。運(yùn)用組織塊標(biāo)本來評(píng)估將作為診斷的一個(gè)輔助工具。

隨著分子診斷技術(shù)的進(jìn)步，有關(guān)涎腺腫塊分子標(biāo)志物檢測(cè)的研究不斷深入，對(duì)于涎腺腫塊的診斷、預(yù)后甚至選擇合適的治療方案均具有重要作用[1]。但是目前分子診斷技術(shù)多應(yīng)用于手術(shù)后涎腺腫塊的診斷，不能進(jìn)行早期診斷。本研究發(fā)現(xiàn)，在超聲引導(dǎo)下行腮腺組織FNAC并制作成細(xì)胞塊，結(jié)合分子標(biāo)志物檢測(cè)，能早期診斷涎腺腫塊，具有操作簡(jiǎn)便，創(chuàng)傷小，并發(fā)癥少的優(yōu)點(diǎn)，可以避免不必要的手術(shù)，在腮腺區(qū)腫塊診斷方面具有重要意義。

經(jīng)過本研究：在多形性腺瘤中的陽性表達(dá)以及在腺樣囊性癌中的無表達(dá)可以更加準(zhǔn)確的區(qū)分這兩種在腮腺中常見的良、惡性腫瘤；能否尋求到新的，更加有效的鑒別腫瘤的指標(biāo)，還有待進(jìn)一步探究。