王麗霞 申 靜 曲佳菲 王明輝

牙周炎是由菌斑微生物引起的以牙周支持組織破壞為主的慢性感染性疾病[1]，是成年人牙齒脫落的主要原因之一[2]。牙周非手術(shù)治療的主要目標(biāo)是徹底清除牙周袋內(nèi)的菌斑、牙石、病變牙骨質(zhì)等，從而去除感染組織，以防止疾病進(jìn)展、改善附著水平，并爭(zhēng)取適當(dāng)?shù)难乐芙M織再生，以維護(hù)牙周健康。齦下刮治和根面平整術(shù)（scaling and root planning，SRP）是目前牙周非手術(shù)治療最經(jīng)典、最有效的方法，通常通過(guò)手動(dòng)或超聲器械來(lái)完成[3]，但仍存在一定的局限性：其操作具有一定難度，術(shù)后根面敏感，機(jī)械治療后形成的含有細(xì)菌、細(xì)菌內(nèi)毒素和病變牙骨質(zhì)的玷污層可能會(huì)阻礙細(xì)胞與根面的重新附著，從而不利于牙周組織的愈合等[4，5]。

Er：YAG激光屬于中紅外線(xiàn)激光，波長(zhǎng)2.94μm，與水（3.0μm）和羥基磷灰石的OH-（2.8μm）對(duì)紅外線(xiàn)的吸收峰值相近，具備在水和羥基磷灰石中高度吸收的良好特性，對(duì)軟硬組織均有切割效果；且能量吸收主要集中在幾微米厚的組織表層，僅能穿透約0.01mm的牙體組織。Er:YAG激光較其它激光最為顯著的優(yōu)點(diǎn)是，在有效去除根面牙石的同時(shí)不對(duì)鄰近組織造成熱損傷，其能在盡量減小對(duì)軟硬組織損傷的情況下進(jìn)行牙周治療[6]。國(guó)外雖有大量關(guān)于Er:YAG激光在牙周治療領(lǐng)域的體內(nèi)外研究，但所選用的激光型號(hào)、參數(shù)設(shè)置、操作時(shí)間、照射角度等都不盡相同，得出的結(jié)論也不一致。國(guó)內(nèi)關(guān)于不同參數(shù)Er:YAG激光照射對(duì)牙周炎患牙根面形態(tài)影響的研究報(bào)道尚不多見(jiàn)。

本研究以新鮮拔除的重度牙周炎患牙為研究對(duì)象，分別采用單純超聲刮治，超聲聯(lián)合手工刮治以及超聲聯(lián)合手工刮治輔以不同參數(shù)Er:YAG激光照射對(duì)根面進(jìn)行處理，通過(guò)評(píng)估人牙周膜細(xì)胞接種于各組樣本后的粘附、增殖情況，初步探討Er:YAG激光用于牙周非手術(shù)治療時(shí)的合適治療參數(shù)，以期為該激光在牙周炎臨床治療中的應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)依據(jù)。

資料和方法

1.主要實(shí)驗(yàn)材料和儀器：DMEM培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)），CCK-8試劑盒（Solarbio，中國(guó)），F(xiàn)otona雙波長(zhǎng)激光（歐洲之星公司，斯洛文尼亞），Gracey刮治器（Hu-Friedy，美國(guó)），超聲治療儀（賽特力P5，法國(guó)），CO2恒溫培養(yǎng)箱（Thermo Forma，美國(guó)），掃描電子顯微鏡（日立SU8010，日本），生物顯微鏡（奧林巴斯 CH20，日本），酶標(biāo)儀（Mulliskan MK3，芬蘭）

2.研究對(duì)象：收集天津市口腔醫(yī)院口腔頜面外科門(mén)診因診斷為重度牙周炎而拔除的單根前牙及前磨牙90顆（經(jīng)天津市口腔醫(yī)院生物醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：2017BSZD04），隨機(jī)分為9組，每組10顆離體牙；同時(shí)收集正畸減數(shù)拔除的健康單根前磨牙10顆，作為空白對(duì)照組（Control組）。蒸餾水沖洗清除血漬，去除表面軟組織，避免損傷牙根面，并在37℃的生理鹽水中保存，準(zhǔn)備進(jìn)行實(shí)驗(yàn)處理。納入標(biāo)準(zhǔn)：①鄰面探診深度及附著喪失＞6mm，②IIIII°松動(dòng)，③近6個(gè)月內(nèi)未進(jìn)行過(guò)牙周治療、未服用抗生素，④未進(jìn)行過(guò)根管治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患牙根面有齲壞或結(jié)構(gòu)異常，②患有全身性疾病，③吸煙患者。

3.實(shí)驗(yàn)分組及樣本制備：Control組：10顆因正畸拔除的健康離體牙，采用手術(shù)刀片刮除牙周膜。90顆重度牙周炎離體牙隨機(jī)分為9組：Ultra組（單純超聲刮治）：使用超聲治療儀進(jìn)行根面處理，重度牙周炎患牙10顆。Gracey組（超聲聯(lián)合手工刮治）：使用超聲波治療儀和Gracey刮治器進(jìn)行根面處理，重度牙周炎患牙10顆。Er：YAG組（超聲聯(lián)合手工刮治輔以激光照射）：使用超聲治療儀、Gracey刮治器以及Er:YAG激光進(jìn)行根面處理，根據(jù)不同脈沖能量分為7個(gè)亞組（Er 40、Er 60、Er 80、Er 100、Er 120、Er 140、Er 160），分別為40mJ/P、60mJ/P、80mJ/P、100mJ/P、120mJ/P、140mJ/P、160mJ/P的激光處理（頻率10Hz，功率1W，水/氣：50%，與牙面呈15～20°角），每組重度牙周炎患牙10顆。所有離體牙根面的沖洗和刮治處理均由一名操作者完成。治療結(jié)果檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)是用尖銳探針探查及肉眼觀(guān)察牙根面平整光滑，沒(méi)有存在牙結(jié)石的臨床證據(jù)。在水冷卻下使用高速手機(jī)從鄰面釉牙骨質(zhì)界下2mm處切取面積5×5mm2、厚度1mm的根片用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

4.人牙周膜細(xì)胞培養(yǎng)：人牙周膜取自天津市口腔醫(yī)院口腔頜面外科門(mén)診因正畸拔牙的患者。患者年齡12到15歲。所選牙無(wú)齲壞、根尖周炎和牙周炎。在不含血清的細(xì)胞培養(yǎng)液潤(rùn)濕下用手術(shù)刀片刮取根中三分之一的牙周膜。將刮取的牙周膜組織均勻鋪于無(wú)菌的培養(yǎng)瓶中，加入DMEM培養(yǎng)基，置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育。顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞生長(zhǎng)至瓶底80%～90%時(shí)，胰酶消化傳代。取4～6代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

5.掃描電子顯微鏡觀(guān)察人牙周膜細(xì)胞在各組樣品的粘附生長(zhǎng)情況：人牙周膜細(xì)胞以5×104濃度接種到24孔板每組樣品上，每組4根片，繼續(xù)培養(yǎng)24h。置于2.5%戊二醛固定4小時(shí)，隨后用0.1M磷酸緩沖液清洗3次，每次15～30分鐘，無(wú)水乙醇配制梯度乙醇溶液（30%、50%、70%、90%和100%）脫水，乙酸異戊酯置換兩次后進(jìn)行CO2臨界點(diǎn)干燥，最后利用粘接劑將樣品固定在樣品臺(tái)上，使用離子濺射儀進(jìn)行鍍金以提高導(dǎo)電性，準(zhǔn)備掃描電鏡觀(guān)測(cè)牙周膜細(xì)胞在根片表面的粘附生長(zhǎng)情況并拍照。

6.CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力：人牙周膜細(xì)胞以每孔5×104濃度接種到4塊48孔板的所有樣本上，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組4根片。將培養(yǎng)板移入培養(yǎng)箱中，在37℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)。分別在接種細(xì)胞后的第1，3，5，7天，取出一塊48孔板，每孔加入配制好的CCK-8溶液40ul，37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸盡孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。選擇450nm波長(zhǎng)，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔光吸收值（OD值）并記錄結(jié)果。

7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以χ±s表示，進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，各組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.人牙周膜細(xì)胞的體外培養(yǎng)：牙周膜組織塊接種后3～6天可見(jiàn)有細(xì)胞游離出來(lái)，但尚不能分辨細(xì)胞結(jié)構(gòu)；接種20天后，可見(jiàn)大量成纖維細(xì)胞向四周呈放射狀生長(zhǎng)；第4代細(xì)胞呈放射狀或旋渦狀生長(zhǎng)，形態(tài)與原代相同：鏡下呈長(zhǎng)梭形，胞體豐滿(mǎn)，胞質(zhì)均勻，細(xì)胞透明度大，細(xì)胞核圓形或卵圓形，核仁清晰（圖1）。

圖1 人牙周膜細(xì)胞傳代培養(yǎng)第4代（倒置顯微鏡 ×40）

2.掃描電子顯微鏡觀(guān)察各組根面人牙周膜細(xì)胞粘附生長(zhǎng)情況：不同牙周治療方法處理后各組根片上均可看到人牙周膜細(xì)胞附著。Control組、單純超聲刮治Ultra組僅可觀(guān)察到圓形細(xì)胞粘附。超聲聯(lián)合手工刮治Gracey組、超聲聯(lián)合手工刮治輔以激光照射Er 40組及Er 60組可見(jiàn)細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，伸出偽足明顯。超聲聯(lián)合手工刮治輔以激光照射Er 80組及Er 100組細(xì)胞亦伸出偽足但不明顯。超聲聯(lián)合手工刮治輔以激光照射Er 140組及Er 160組細(xì)胞粘附數(shù)量較少，且出現(xiàn)皺縮現(xiàn)象（圖2）。

3.CCK-8法比較各組根面人牙周膜細(xì)胞增殖情況：不同牙周治療方法處理后各組內(nèi)人牙周膜細(xì)胞生長(zhǎng)增殖情況比較如圖3，與第1天比較，第3天、5天、7天Control組、超聲聯(lián)合手工刮治Gracey組、超聲聯(lián)合手工刮治輔以激光照射Er 40組、Er 60組、Er 80組、Er 100組、Er 120組及Er 160組根面附著細(xì)胞數(shù)均呈上升趨勢(shì)，而單純超聲刮治Ultra組及超聲聯(lián)合手工刮治輔以激光照射Er 140組與第5天比較，第7天時(shí)根面附著細(xì)胞數(shù)增加不明顯。

圖3 各組內(nèi)根面人牙周膜細(xì)胞增殖情況比較（CCK-8法）

各組間比較如圖4，第1天，各組細(xì)胞均存活，且各組之間無(wú)差異。在第3天、5天時(shí)，單純超聲刮治Ultra組附著于根面細(xì)胞數(shù)明顯高于其他各組。第7天時(shí)，該組根面附著細(xì)胞減少；而超聲聯(lián)合手工刮治Gracey組、超聲聯(lián)合手工刮治輔以激光照射Er 40組及Er 60組附著于根面的細(xì)胞數(shù)明顯高于其他各組；超聲聯(lián)合手工刮治輔以激光照射Er 40組附著于根面的細(xì)胞數(shù)略高于超聲聯(lián)合手工刮治Gracey組，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，超聲聯(lián)合手工刮治輔以激光照射Er 80組、Er 100組、Er 120組、Er 140組以及Er 160組之間沒(méi)有明顯的差異。

圖4 各組間根面人牙周膜細(xì)胞增殖情況比較（CCK-8法）

討 論

牙周組織再生是牙周治療的主要目標(biāo)之一，理想的結(jié)果是再生的高度組織化的膠原纖維可以重新牢固地附著在再生的牙骨質(zhì)和牙槽骨上[7]。從牙根表面清除齦下微生物群和細(xì)菌內(nèi)毒素是成纖維細(xì)胞遷移和附著的必要條件，而這通常是不可能通過(guò)機(jī)械治療實(shí)現(xiàn)的。多項(xiàng)研究表明，CO2，Nd:YAG和Er:YAG激光可以提高牙根表面清創(chuàng)效率[8，9]。

本研究中發(fā)現(xiàn)人牙周膜細(xì)胞在牙根表面的增殖隨Er：YAG激光能量的增高而增加，可能是由于Er：YAG激光處理后的根面表面粗糙度較高，增強(qiáng)了牙周膜細(xì)胞的粘附性。與我們的結(jié)果類(lèi)似，多項(xiàng)研究表明，與機(jī)械清創(chuàng)表面相比，激光照射后表面上的成纖維細(xì)胞能夠更快速地粘附和增殖[10]。亦有研究表明在一定程度上增加根面粗糙度，更有利于牙周膜成纖維細(xì)胞的附著，而不增加微生物的粘附[11]。Tsurumaki等[12]進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)，根面粗糙度的增加有利于纖維支架以及細(xì)胞的穩(wěn)定粘附。Schwarz等[13]比較Er:YAG激光（160mJ，10Hz）和超聲、手工治療組對(duì)牙周成纖維細(xì)胞附著于牙周炎病變根面的體外研究發(fā)現(xiàn)，激光治療組比超聲和手工治療組更能促進(jìn)成纖維細(xì)胞在牙周炎病變根面的附著。本研究采用體外培養(yǎng)人牙周膜細(xì)胞接種于不同方法處理的牙根面上，采用掃描電子顯微鏡和CCK-8法觀(guān)察其粘附和增殖能力。研究結(jié)果表明，與單純超聲刮治相比，超聲聯(lián)合手工刮治以及超聲聯(lián)合手工刮治輔以40mJ/P、60mJ/P的Er:YAG激光更有利于細(xì)胞的粘附與增殖，而且超聲聯(lián)合手工刮治輔以40mJ/P的Er:YAG激光組可能效果更好，但尚需要長(zhǎng)期的基礎(chǔ)和臨床研究予以證實(shí)。

Er:YAG激光具有公認(rèn)的抗菌作用，高效的牙結(jié)石清除能力，最小的周?chē)步M織損傷，并且更有利于細(xì)胞附著[14]，有望成為傳統(tǒng)牙周非手術(shù)治療的輔助手段之一。另一方面，應(yīng)用Er：YAG激光增加牙根表面粗糙度可能導(dǎo)致菌斑滯留增加，因此，需要進(jìn)一步的長(zhǎng)期體外和臨床研究，以評(píng)估細(xì)菌在Er：YAG激光照射的根面上定植的可能風(fēng)險(xiǎn)，這對(duì)維持長(zhǎng)期的牙周組織健康至關(guān)重要。