謝雪潔 吳澤鈺 宋 潔 范文獻(xiàn) 趙 今

齲病是全世界分布最廣泛的細(xì)菌性慢性疾病之一，雖然隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，近幾年發(fā)病率有下降趨勢，但其發(fā)病率仍處于較高水平，全世界約有80～90%的人們受其影響[1]。因此，探索安全可靠、經(jīng)濟(jì)有效的防齲措施迫在眉睫?？鄥?，一種我國應(yīng)用廣泛的傳統(tǒng)中藥，已被證實(shí)低毒且具有很高的藥用價值，其主要活性成分苦參堿及氧化苦參堿的抗病毒、抗炎、抗心律失常、抗纖維化等藥理作用也已得到充分證實(shí)[2～5]。S.mutans能在短期內(nèi)建立齲病動物模型，在口腔真實(shí)的環(huán)境中模擬齲病的自然進(jìn)程。本實(shí)驗(yàn)選用S.mut ans UA159，參照改良的大鼠齲病模型進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)[6]，旨在以前期體外研究[7]為基礎(chǔ)，進(jìn)一步評估苦參提取物防齲的有效性及安全性。

資料和方法

1.主要儀器及試劑

潔凈工作臺（上海博迅，SW-CJ-2FD）；體式顯微鏡（Struers Minitom，丹麥）；37℃恒溫?fù)u床（恒溫培養(yǎng)震蕩儀，ZWY-240，上海）；CLSM（TCS-SP8，德國）；苦參（新疆醫(yī)科大學(xué)天然藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）；氯己定（源葉生物，LOT：J25J7Y16622）；紫脲酸銨指示劑（源葉生物，LOT：M06GS147307）；羅丹明B熒光染料（Solarbio，CAS:81-88-9）。

2.動物及飼料

雄性SPF-SD大鼠36只（新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理中心），Keyes 2000 diet（Trophic，Nantong，China），通過新疆醫(yī)科大學(xué)倫理委員會審批。

3.致齲菌及培養(yǎng)基

S.mutansUA159標(biāo)準(zhǔn)株，購買于美國模式培養(yǎng)物集存庫（american type culture collection，ATCC）腦心浸液培養(yǎng)基（brain heart infusion，BHI）：美國BD公司，Lot號：7075659。輕唾瓊脂培養(yǎng)基（miltis salivarius agar base，MS）：青島日水生物技術(shù)有限公司，Cat.No.10922。

4.實(shí)驗(yàn)分組

隨機(jī)數(shù)表法將動物分為6組：2g/L、4g/L、8g/L苦參提取物干預(yù)的實(shí)驗(yàn)組；0.12%洗必泰（chlorhexidine，CHX）干預(yù)的陽性對照組（CHX）；無菌蒸餾水干預(yù)的齲病模型組（caries group，CA）以及不干預(yù)的空白對照組（Control）。

5.實(shí)驗(yàn)方法

（1）制備苦參提取物及S.mutans菌懸液：參照前期實(shí)驗(yàn)制得苦參提取物母液[7]，稀釋至2g/L、4g/L、8g/L。選取S.mutans凍存菌株接種于BHI瓊脂培養(yǎng)基，80%N2，20%CO2，37℃厭氧培養(yǎng)48h。觀察菌落生長形態(tài)，隨機(jī)取單個菌落涂片鏡檢，無污染且生化鑒定為純培養(yǎng)后，相同培養(yǎng)條件下培養(yǎng)48h，取形態(tài)一致的菌落溶于BHI液體培養(yǎng)基，麥?zhǔn)媳葷岱?biāo)定菌懸液濃度至106CFU/mL。

（2）建立動物模型：鼠齡21天，隨機(jī)分組編號。22～24天，內(nèi)源性細(xì)菌的抑制，飼以均勻混有氨芐西林鈉（每2g配1000g普通飼料）的飼料及含青霉素鉀（80萬單位，1瓶配200mL生理鹽水）的飲水。25天，口腔拭子檢測內(nèi)源性細(xì)菌的抑制情況。26～28天，用浸有飽和S.mutans懸液的棉簽感染大鼠口腔（1mL/只）。29天，大鼠口腔拭子檢測S.mutans的定植情況。鼠齡25天至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，除空白對照組飼以普通飲食及飲水，其余組均飼以Keyes 2000 diet及5%蔗糖水。實(shí)驗(yàn)中期，每只大鼠鼠磨牙拍攝X線片，確認(rèn)有低密度影像，證實(shí)齲齒形成后，繼續(xù)下一步實(shí)驗(yàn)。

（3）藥物口腔干預(yù)：30～50天，無菌棉簽蘸取實(shí)驗(yàn)藥液（1mL）至飽和，處理大鼠磨牙各牙面及口腔黏膜，剩余藥液注入口內(nèi)含漱，確保藥液作用到位。每天干預(yù)2次（早晨10點(diǎn)及下午6點(diǎn)），每個象限15s，處理后禁食水2h，持續(xù)3周，干預(yù)始終由同一操作者完成，每天稱重并記錄大鼠的健康狀況。

（4）標(biāo)本采集：①唾液：鼠齡50天，腹腔注射0.2%硝酸毛果蕓香堿（0.4mL/100g），采集大鼠唾液（100μL/只），稀釋1000倍，取10μL均勻涂于BHI瓊脂培養(yǎng)基（總菌菌落數(shù)）及MS瓊脂培養(yǎng)基（S.mutans菌落數(shù)），80%N2，20%CO2，37℃厭氧培養(yǎng)12h，由兩人分別進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)[11]，S.mutans水平＝（S.mutans菌落數(shù)/總菌落數(shù)）×100%。②頜骨標(biāo)本：51天，水合氯醛麻醉下處死大鼠，無菌解剖頜骨，高壓蒸汽滅菌鍋中處理5min，清理頜骨上軟組織，在0.4%紫脲酸胺溶液中染色12h。用0.15～0.2mm的線鋸，沿頜骨近遠(yuǎn)中方向?qū)⒀懒星虚_，體視顯微鏡下?lián)﨣eyes評分法[8]評估大鼠磨牙齲損情況。紫脲酸胺滲入牙齒的大小和深度代表齲損的影響范圍和嚴(yán)重程度。根據(jù)Keyes法，齲病分為四個等級:純釉質(zhì)齲（E）、輕度牙本質(zhì)齲（Ds）、中度牙本質(zhì)齲（Dm）和廣泛牙本質(zhì)齲（Dx）。Ds級齲損約占牙釉質(zhì)至髓室頂間牙本質(zhì)的1/4；Dm級齲損表示其間約1/4至3/4的牙本質(zhì)受累，而超過3/4牙本質(zhì)受累的齲損被標(biāo)記為Dx級齲損。每顆磨牙光滑面E級齲損記分相加，作為這只大鼠光滑面的E級齲損總記分，同樣方法進(jìn)行窩溝E、Ds、Dm、Dx級齲損記分，所有評分均是雙人雙評。③主要臟器:采集心、肝、脾、肺和腎臟稱重，計(jì)算臟器系數(shù)（臟器系數(shù)＝臟器重量/體重×100%）。④口腔黏膜組織:取每只大鼠同一部位口腔頰黏膜，4%多聚甲醛溶液固定24h，HE染色后顯微鏡觀察。⑤牙磨片:用細(xì)砂紙將鼠磨牙制成厚約300μm的牙磨片，37℃下避光經(jīng)羅丹明B熒光染料（0.1mmol/L）染色24h，CLSM下觀察牙磨片的熒光激發(fā)情況。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以α＝0.05作為組間比較的檢驗(yàn)水準(zhǔn)。計(jì)量資料用Shapiro-Wilk行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，不符合正態(tài)分布計(jì)量資料用P50（P25，P75）表示，分類資料用例數(shù)表示。①符合正態(tài)分布計(jì)量資料多組間比較，采用方差F檢驗(yàn)，組間兩兩比較用LSD-t法。Mann-Whitney U兩獨(dú)立樣本的非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。②不符合正態(tài)分布計(jì)量資料多組間比較用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，組間兩兩比較用Bonferroni矯正p法。③計(jì)量資料重復(fù)測量資料:采用重復(fù)測量方差模型，數(shù)據(jù)不滿足球形假設(shè)條件采用Greenhouse-Geisser法校正。

結(jié) 果

1.S.mutans水平：如表1，組間菌落計(jì)數(shù)情況比較結(jié)果顯示，BHI、MS、S.mutans水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。且經(jīng)兩兩比較:BHI指標(biāo)為CHX組顯著低于2g/L組，CA組顯著高于其余組別；MS指標(biāo)為CHX組顯著低于2g/L組，CA組顯著高于4g/L、8g/L、CHX和Control組；S.mutans水平指標(biāo)為2g/L組、CA組顯著高于4g/L組高于Control組、8g/L、CHX組。

表1 6組間菌落計(jì)數(shù)結(jié)果

2.Keyes記分：如圖1，在齲病模型中，牙齒逐漸發(fā)展為齲損（被紫脲酸胺染成紅色），CA組光滑面及窩溝明顯有更廣泛的顏色改變。如表2，各藥物干預(yù)組與CA組相比，光滑面及窩溝的各級齲損評分均有所降低；8g/L組未檢出Dm級齲損，CHX組未檢出Dm級及Dx級齲損，這兩組的光滑面齲評分、窩溝齲E級、Ds級、Dm級及Dx級評分與CA組均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）；4g/L苦參提取物組未檢出Dx級齲損，其窩溝齲Dx級齲損與CA組有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。

表2 6組間Keyes評分結(jié)果

圖1 齲齒Keyes評分及CLSM結(jié)果

3.體重、口腔黏膜HE染色及臟器系數(shù)：經(jīng)過4周的實(shí)驗(yàn)，各組大鼠體重均呈上升趨勢，Control組各時間點(diǎn)體重增幅最大。初始及第一周時，各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，第二周開始至處死前均為Control組體重顯著高于其余組別。其余組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。如圖2。表4見6組間臟器系數(shù)比較時，肝臟系數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Control組顯著低于其余組別。心臟、肺臟、腎臟、脾臟指數(shù)各組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖3。如圖4，各藥物干預(yù)組口腔黏膜組織結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞排列整齊，未見增生性改變、炎癥反應(yīng)和壞死等不良反應(yīng)，與Control組無明顯差異。

表4 6組間臟器系數(shù)比較

圖2 各組大鼠的體重變化

圖3 各組大鼠的臟器系數(shù)結(jié)果

圖4 各組大鼠的口腔粘膜HE染色結(jié)果

4.牙磨片CLSM：如圖1，CA組牙釉質(zhì)連續(xù)性明顯中斷，牙磨片滲入的紅色熒光強(qiáng)度與其余組相比較強(qiáng)；2g/L及4g/L苦參提取物組可見部分牙釉質(zhì)裂紋，熒光強(qiáng)度較CA組有減弱，但并不明顯；8g/L及CHX組牙釉質(zhì)較連續(xù)，未見明顯釉質(zhì)裂紋，熒光強(qiáng)度較CA組明顯降低。

討 論

洗必泰是一種具有廣泛抗菌活性的陽離子雙肌類藥物，對G+、G-和真菌都有殺菌作用，且抗菌效能高，臨床常用其0.12%～2%溶液作為口腔疾病的預(yù)防和輔助治療，常用作其他抗菌藥物評價的陽性對照和金標(biāo)準(zhǔn)。故本實(shí)驗(yàn)選用0.12%洗必泰作為陽性對照組。然而長期洗必泰使用會導(dǎo)致味覺遲鈍，口腔粘膜脫屑，牙齒、舌背著色和長期應(yīng)用口腔菌群失調(diào)等。近年來，中草藥防齲受到越來越多的關(guān)注和認(rèn)可，眾多學(xué)者已研究沒食子[9，10]、青皮[11]、紫草素[12]等天然植物，充分證實(shí)了天然藥物的防齲功效。

致齲菌對牙面的粘附是其致齲的前提，進(jìn)而代謝食物中的碳水化合物，產(chǎn)生各種有機(jī)酸導(dǎo)致牙體硬組織脫礦，引起齲病的發(fā)生。在齲病的發(fā)展過程中，致齲菌合成胞內(nèi)外多糖的能力和耐酸特性發(fā)揮著重要作用，胞內(nèi)、外多糖可貯存能量供細(xì)菌利用，胞外多糖還有促進(jìn)牙菌斑生物膜形成的作用[13]。因此，防齲的有效性通常體現(xiàn)在其對致齲菌及其生物膜生長、產(chǎn)酸、產(chǎn)糖及黏附的抑制方面。團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)[7]，S.mutans在苦參提取物濃度為2g/L、4g/L和8g/L時，在對浮游菌產(chǎn)酸產(chǎn)生顯著抑制作用；1g/L苦參能夠顯著抑制浮游菌合成水不溶性胞外多糖。牙菌斑生物膜是導(dǎo)致齲病發(fā)生的始動因子，因此在藥物防齲方面，抑制S.mutans生物膜的形成和清除成熟生物膜具有重要意義[14]。然而本實(shí)驗(yàn)的旨在調(diào)節(jié)口腔微生態(tài)環(huán)境，完全清除S.mutans生物膜可能導(dǎo)致菌群紊亂，因此未設(shè)置16g/L濃度組，由于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)與體外實(shí)驗(yàn)相比，藥物作用環(huán)境更為復(fù)雜，干擾因素也相對較多，據(jù)前期體外實(shí)驗(yàn)，1g/L組僅對浮游菌合成IEPS的抑制方面與陰性對照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而對浮游菌生長、產(chǎn)酸、黏附、生物膜的生長及清除方面未見顯著效果，因此本實(shí)驗(yàn)設(shè)置2g/L、4g/L、8g/L苦參提取物組作為實(shí)驗(yàn)藥物組。

本研究中，2g/L組與CA組的BHI、MS及S.mutans水平指標(biāo)均顯著高于其余組，見表1；2g/L及4g/L組光滑面齲、窩溝齲E級、Ds級、Dm級Keyes評分與CA組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），但4g/L組Dx級評分與CA組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。8g/L組及CHX組各級齲損評分與CA組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），見表2。以上差異綜合表明，2g/L苦參提取物抗齲效能欠佳；4g/L苦參提取物可阻止齲病向深層牙本質(zhì)進(jìn)展，但對釉質(zhì)齲及牙本質(zhì)淺層齲的防治作用有限；8g/L組可顯著降低大鼠口內(nèi)S.mutans水平，顯著降低齲齒各級Keyes評分，防齲效能良好，對照CLSM結(jié)果可得出一致結(jié)論。此濃度相對于體外實(shí)驗(yàn)的有效濃度偏高，可能因體內(nèi)環(huán)境為復(fù)雜的多菌種生物膜環(huán)境，對抗菌劑表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗藥性。

生物安全性方面，表3可見，初始、第一周時間點(diǎn)各組間體重差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），第二周至處死前Control組體重均顯著高于其余組別，其余組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)第一周進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)、S.mutans的定植及檢測等實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，第二周開始進(jìn)行藥物干預(yù)，即2～4周進(jìn)行為期3周的實(shí)驗(yàn)藥物干預(yù)，正是藥物干預(yù)階段，Control組與其余各組體重產(chǎn)生了差異。實(shí)驗(yàn)過程中也確發(fā)現(xiàn)，藥物干預(yù)期間各實(shí)驗(yàn)組大鼠大便較溏稀，飼料相較于空白對照組吃完的較慢等情況，可能是由于實(shí)驗(yàn)中所用的苦參提取物、CHX及長期高糖飲食可能會增加腸胃負(fù)擔(dān)，導(dǎo)致胃腸道功能紊亂，進(jìn)而導(dǎo)致體重較Control組增加較慢。表4見，6組間臟器系數(shù)比較中，肝臟系數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），且經(jīng)LSD-t法兩兩比較，Control組顯著低于其余組別。心臟、肺臟、腎臟、脾臟指數(shù)各組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）?？赡苁菍?shí)驗(yàn)中所用的苦參提取物、CHX及長期高糖飲食增加了肝臟的代謝負(fù)擔(dān)，使肝臟代償性的增大，導(dǎo)致肝臟系數(shù)略有增加。張明發(fā)[15]等人研究發(fā)現(xiàn)，大劑量使用苦參堿可能引起中毒癥狀，機(jī)體中毒時可引起肝臟、腎臟、肺臟和神經(jīng)麻痹等癥狀，認(rèn)為苦參堿可提高中樞神經(jīng)的興奮性遞質(zhì)谷氨酸水平，降低抑制性遞質(zhì)γ-氨基丁酸水平，并抑制膽堿酯酶活性從而造成膽堿能神經(jīng)興奮，這是苦參堿造成神經(jīng)麻痹的原因。楊良月[16]對綿羊的毒理學(xué)試驗(yàn)表明，大劑量使用苦參堿可造成肺臟、肝臟、腦、腎臟和心臟損傷。但除去自身較難恢復(fù)的肺臟，苦參堿造成的肝臟和腎臟造成的損害均可逐漸恢復(fù)?？鄥A在應(yīng)用中比較安全，但不可過量長期使用以，以免造成危害。

表3 6組間6個時間點(diǎn)體重變化情況

綜上，8g/L的苦參提取物可有效防齲并有較好的生物安全性，但過量長期使用可能會引起其它系統(tǒng)危害。后期天然藥物動物實(shí)驗(yàn)的安全性研究中，將對大鼠腸道粘膜及各臟器進(jìn)行進(jìn)一步研究。

本實(shí)驗(yàn)大鼠口內(nèi)僅定植S.mutans，不能完全代表復(fù)雜的口腔微生物環(huán)境，多菌種生物膜的齲病研究對于進(jìn)一步探索防齲制劑的作用勢在必行，課題組后期將致力于此方面的研究。綜上，8g/L苦參提取物可有效阻止齲病的發(fā)生和進(jìn)展，并初步表明具有一定的生物安全性，有望成為防齲制劑進(jìn)入臨床。