任百潔 姚紅英

牙周炎（periodontitis）是由多種因素導(dǎo)致的慢性破壞性疾病，同時(shí)也是發(fā)病率最高的口腔感染性疾病之一[1]。第四次口腔流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示我國(guó)80%～96%的成年人有不同程度的牙周問(wèn)題[2]。由此可見(jiàn)，牙周炎已成為影響成年人口腔健康的首要原因。目前研究觀點(diǎn)認(rèn)為，牙菌斑及其產(chǎn)物的直接破壞途徑和宿主免疫反應(yīng)所造成的間接破壞途徑是造成牙周炎發(fā)生發(fā)展的兩大主要途徑[3]。因此使用藥物調(diào)節(jié)免疫炎癥反應(yīng)是治療牙周炎的關(guān)鍵之一。與抗生素相比，中草藥因其毒副作用小、藥理作用豐富得到了學(xué)者們的重視。提取中草藥中有效成分用以治療牙周疾病已成為現(xiàn)代研究的熱點(diǎn)。

雷公藤多苷（tripterygium wilfordii polyglycosides，TWP）是從傳統(tǒng)中藥-雷公藤根部提取而來(lái)的一種糖苷，其主要成分是環(huán)氧二萜內(nèi)酯[4]?，F(xiàn)代藥理研究表明，雷公藤多苷對(duì)T淋巴細(xì)胞有明顯的抑制作用，對(duì)自身免疫有調(diào)節(jié)作用[5]。利用雷公藤多苷免疫調(diào)節(jié)的作用，臨床上已將其用來(lái)治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，甲狀腺炎等疾病[6，7]。但目前尚未查到關(guān)于雷公藤多苷用以治療牙周疾病的報(bào)道。本研究通過(guò)絲線結(jié)扎建立大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型，局部注射雷公藤多苷，探討其對(duì)大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎的抑制作用及其可能的機(jī)制，為臨床治療牙周疾病提供依據(jù)。

資料和方法

1.主要實(shí)驗(yàn)材料與儀器設(shè)備：福爾馬林、氫氧化鈉、鹽酸、PBS緩沖液（北京化工廠，中國(guó)）；水合氯醛（原葉生物科技有限公司，上海）；Trizol（Magen，中國(guó)）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒（Takara，日本）；Cr、ALT、AST檢測(cè)試劑盒（南京建成科技有限公司，中國(guó)）；包埋機(jī)（TB-718E，英國(guó)）；石蠟切片機(jī)（FINESSE325，英國(guó)）；PCR儀（Thermo，美國(guó)）。

2.動(dòng)物選取及實(shí)驗(yàn)分組：選取24只雄性、6周齡的SD（Sprague Dawley）大鼠，體重范圍為220～250g。在12:12h的明/暗周期，24°C±2°C的環(huán)境下飼養(yǎng)大鼠，所有大鼠的飲食和飲水保持一致性。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)了江蘇省倫理委員會(huì)審查。經(jīng)過(guò)一周的適應(yīng)性喂養(yǎng)（符合上述所有條件）后，除空白對(duì)照組的大鼠外，對(duì)所有大鼠進(jìn)行絲線結(jié)扎，將它們隨機(jī)分為4組（n＝6）：①空白對(duì)照組（稱為“NL”）；②結(jié)扎對(duì)照組（稱為“LC”）；③結(jié)扎+生理鹽水組（稱為“L+NaCl”）；④結(jié)扎+雷公藤多苷組（稱為“L+TWP”），于尾部進(jìn)行分組標(biāo)記（圖1.A）。

圖1 雷公藤多苷給藥對(duì)大鼠一般情況及肝腎功能的影響

3.大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型的建立及給藥處理：大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型建立方法如下：實(shí)驗(yàn)前一晚禁食不禁水，通過(guò)腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛（當(dāng)天配置，避光保存）麻醉大鼠（0.35μL/100g劑量注射），自制擴(kuò)口器輔助張口，完全暴露雙側(cè)上頜第一磨牙，并使用牙齦分離器分離牙齦。用絲線將磨牙結(jié)扎一圈，確保絲線位于牙齦溝內(nèi)。L+TWP組及L+NaCl組分別于大鼠牙齦注射1mg·kg-1·d-1的雷公藤多苷和等體積的生理鹽水。

4.臨床指標(biāo)檢測(cè)及取材：注射給藥1周后，檢測(cè)各組大鼠簡(jiǎn)化軟垢指數(shù)（debris index simplified，DIS）及齦溝出血指數(shù)（sulcus bleeding index，SBI）（具體檢測(cè)方法參照[8，9]，結(jié)果記錄評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表1及表2）；去除軟垢后，使用尖端直徑為0.3毫米的圓頭探針測(cè)量探診深度（probing depth，PD），記號(hào)筆標(biāo)記探診探入末端，使用游標(biāo)卡尺精確記錄數(shù)值，最后進(jìn)一步檢測(cè)計(jì)算臨床附著喪失水平（clinical attachment level，CAL）（具體檢測(cè)方法參照[10]）。對(duì)腭側(cè)近中、遠(yuǎn)中和中央三個(gè)進(jìn)行評(píng)分，并計(jì)算平均值。處死大鼠，快速分離目標(biāo)牙的牙齦組織，標(biāo)準(zhǔn)選取為：橫向距離為目標(biāo)牙的近遠(yuǎn)中距離，寬度約為齦方2mm，每組隨機(jī)取3只置于-80℃冰箱中保存，另3只于福爾馬林固定并同時(shí)取其肝臟組織同樣進(jìn)行固定；亞甲藍(lán)染色骨組織觀察骨吸收情況。

表1 DIS評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

表2 SBI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

5.生化指標(biāo)檢測(cè)：各組大鼠取其動(dòng)脈血，參照相應(yīng)試劑盒檢測(cè)方法檢測(cè)血清中肌酐（creatinine，Cr）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）水平。

6.qRT-PCR檢測(cè)牙周組織相關(guān)炎癥因子：根據(jù)Takara試劑盒說(shuō)明對(duì)大鼠牙齦組織進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，得到相應(yīng)OD值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。PCR引物序列為：β-Actin：F-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA，R-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG；IL-6：FAAGCCAGAGCTGCAGGATGAGTA，R-TGTCCTGCAGCCACTGGTTC；TNF-α：F-TTCCAATGGGCTTTCGGAAC，R-AGACATCTTCAGCAGCCTTGTGAG；IL-1β：F-CCCTGAACTCAACTGTGAAATAGCA，RCCCAAGTCAAGGGCTTGGAA。

7.組織學(xué)分析：取出置于福爾馬林中的大鼠牙齦組織和肝臟組織，流動(dòng)水沖洗1h，修整組織后常規(guī)梯度乙醇脫水，透明，浸蠟，石蠟包埋，切片厚度為4mm，伊木精-蘇紅染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察牙齦組織和肝臟組織的病理變化。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 7.00統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。通過(guò)卡方檢驗(yàn)和Student t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，P＜0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.大鼠一般情況及肝臟HE染色結(jié)果：給藥組大鼠和其余三組大鼠一般情況無(wú)差異，體型及代謝正常，體重穩(wěn)定增長(zhǎng)，毛發(fā)光澤且活動(dòng)敏捷。肝臟HE染色顯示：各組大鼠的肝索結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞的形態(tài)沒(méi)有變化，未見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)。血清生化檢測(cè)顯示：各組大鼠血清AST、ALT、Cr水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

2.實(shí)驗(yàn)性牙周炎大鼠臨床指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果：第7天，對(duì)每組大鼠進(jìn)行口腔檢查以評(píng)估其牙周炎癥和藥物的抗炎作用，并測(cè)量DIS、SBI、PD及CAL值。上頜第一磨牙的口腔內(nèi)臨床檢查顯示，結(jié)扎日（時(shí)間0）7天后，結(jié)扎組的牙齦顏色，質(zhì)地和形態(tài)與NL組不同，表現(xiàn)為大量的黃色軟垢附著在結(jié)扎絲線上，完全覆蓋了牙齒表面（圖2A）；去除這種軟垢后，牙齦顯示出炎癥，水腫，顏色變化和齦溝出血，牙周探診探診齦溝后，可見(jiàn)牙齦出血，溢出齦溝（圖2B）。LC組的DIS，SBI的變化顯著高于NL組（P＜0.05）。與LC組相比，L+NaCl及L+TWP組的DIS沒(méi)有觀察到顯著差異（P＞0.05）。L+NaCl與L+TWP組的SBI比較，發(fā)現(xiàn)有顯著差異（P＜0.05）（表3）。LC組的牙周袋深度和附著喪失水平與NL組相比顯著增加（P＜0.05）。與此同時(shí)，L+TWP組與L+NaCl組比較，PD及CAL值顯著降低（P＜0.05）（表3）。

圖2 牙周炎建模示意圖及牙周臨床指標(biāo)檢查圖

表3 各組牙周臨床指標(biāo)比較

3.qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果：LC組中3個(gè)促炎細(xì)胞因子IL-1β，IL-6和TNF-αmRNA的表達(dá)量與NL比較均有顯著性差異（P＜0.05），且分別比NL組高約7.31，75.04和5.03倍。與L+NaCl組相比，L+TWP組中的IL-1β，IL-6和TNF-αmRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.05）（圖3）。

圖3 雷公藤多苷對(duì)大鼠牙齦組織中IL-1β，IL-6和TNF-α mRNA表達(dá)的影響

4.牙齦及骨組織觀察結(jié)果：NL組的組織切片中觀察到正常的牙齦組織結(jié)構(gòu)，組織中未發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖4A）。LC組及L+NaCl組的切片見(jiàn)牙齦結(jié)締組織內(nèi)大量的中性粒細(xì)胞，淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞等炎癥細(xì)胞（圖4B，C）。L+雷公藤多苷組的牙齦組織接近正常組，炎癥反應(yīng)幾乎消失（圖4D）。與HE染色結(jié)果相似，L+雷公藤多苷組的骨組織吸收程度明顯低于LC組及L+NaCl組（圖4E-G）。

圖4 牙齦HE切片及單側(cè)上頜骨組織染色圖

討 論

本研究主要對(duì)雷公藤多苷抑制大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎的作用效果進(jìn)行觀察，并進(jìn)一步分析其作用機(jī)制。

牙齦炎是牙周炎的早期癥狀，牙周探診出血是臨床診斷牙齦炎的金標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠雙側(cè)上頜第一磨牙進(jìn)行絲線結(jié)扎處理，對(duì)其DIS、SBI、PD及CAL進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明結(jié)扎構(gòu)建的炎癥環(huán)境是相同的，在相同軟垢刺激的條件下，雷公藤多苷組的牙齦炎癥明顯緩解，提示雷公藤多苷具有抑制牙齦炎癥的功能。我們?cè)谘例l組織切片及亞甲藍(lán)染色的上頜組織中觀察到了相同的抗炎效果：應(yīng)用雷公藤多苷實(shí)現(xiàn)了局部微環(huán)境中炎癥的抑制。

牙周炎是多種因素造成的炎性感染性疾病，細(xì)胞因子（IL-1β，IL-6和TNF-α等）介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致牙周炎癥進(jìn)一步發(fā)展的重要因素[11～13]。目前有效的牙周治療手段包括牙周潔治刮治、翻瓣術(shù)、引導(dǎo)性骨組織再生術(shù)等主要致力于消除菌斑，忽視了針對(duì)免疫炎癥反應(yīng)的干預(yù)，故治療效果總是差強(qiáng)人意。針對(duì)炎癥較重的牙周病患者，臨床常輔以藥物治療。但現(xiàn)今臨床上治療牙周炎的藥物主要以抗生素為主，長(zhǎng)期應(yīng)用易產(chǎn)生耐藥菌和胃腸道反應(yīng)等副作用，因此副作用小的中藥提取物具有臨床研究意義。藥理研究顯示[14]，雷公藤多苷具有抗炎、免疫抑制和抗腫瘤等多方面的功能。艾燕等[15～17]研究表明，雷公藤多苷可通過(guò)抑制TNF-α及IL-1β等促炎細(xì)胞因子水平實(shí)現(xiàn)治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，結(jié)腸炎及腎炎等疾病。我們對(duì)大鼠牙齦組織進(jìn)行qRTPCR檢測(cè)，結(jié)果顯示雷公藤多苷可以抑制IL-1β，IL-6和TNF-α的表達(dá)，從而對(duì)牙周組織炎癥產(chǎn)生積極而有效的對(duì)抗及治療作用。因此，雷公藤多苷可能成為抑制牙周炎的有效藥物。但是相對(duì)于雷公藤多苷的副作用[18]，其用于牙周治療帶來(lái)的益處是否足以支持其作為牙周治療用藥呢？研究發(fā)現(xiàn)，雷公藤藥物的最大安全劑量為40g·d-1[19]。Sen等[20]使用12mg·kg-1·d-1的雷公藤多苷對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃后，對(duì)其血清ALT和AST進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)與正常對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。我們的實(shí)驗(yàn)再次驗(yàn)證了該說(shuō)法，給藥組大鼠與其他大鼠血清中Cr、AST和ALT的檢測(cè)結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。此外，F(xiàn)eng等[21]研究發(fā)現(xiàn)，小劑量使用雷公藤多苷甚至可通過(guò)腎臟代謝和抗炎作用改善腎功能和結(jié)構(gòu)改變?？梢?jiàn)在合理范圍內(nèi)使用雷公藤多苷并無(wú)毒副作用。本實(shí)驗(yàn)藥物使用劑量為1mg·kg-1·d-1，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于安全劑量，因此本實(shí)驗(yàn)使用的藥物劑量對(duì)大鼠相對(duì)安全。

綜上所述，雷公藤多苷的應(yīng)用可以抑制牙齦組織炎癥及骨吸收的發(fā)生發(fā)展，這與其調(diào)控多種炎癥細(xì)胞因子表達(dá)有關(guān)，提示雷公藤多苷可以作為牙周炎早期治療的潛在輔助用藥。雷公藤多苷的應(yīng)用既可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)治療的不足，強(qiáng)化宿主炎癥的抑制，又不易產(chǎn)生毒副作用，且藥理作用豐富，因此應(yīng)用雷公藤多苷治療牙周炎具有研發(fā)意義。但應(yīng)用于臨床，還需更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)其抑制骨吸收的作用機(jī)制及肝腎損傷等做更為深入的實(shí)驗(yàn)研究。