王會娟，王繼紅，趙興山，劉 巍

(北京積水潭醫(yī)院 心內科，北京 100096)

高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol,HDL-C)水平與冠狀動脈疾病的發(fā)病風險呈一種顯著的負相關趨勢，即使在強化他汀(statins)治療使LDL-C達標后，這種負相關作用依然存在[1]。HDL-C發(fā)揮心血管保護作用的主要機制為膽固醇的逆轉運(reverse cholesterol transport RCT)，即將周圍血管壁巨噬細胞中的膽固醇轉運至肝臟，從而排出體外的過程[2]。此外，HDL-C還具有抗氧化、抗感染、抗凋亡、抗栓等多種抗動脈粥樣硬化作用[3]。他汀類藥物均具有顯著降低低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平的作用，但升高HDL-C水平的作用卻存在很大差異。目前的多項研究顯示，與其他類型的他汀類藥物相比，匹伐他汀(pitavastatin)升高HDL-C的作用更為顯著[4]。但關于匹伐他汀對HDL-C功能的研究卻鮮有報道。基于上述研究現狀，本研究通過檢測匹伐他汀對HDL-C膽固醇外流功能以及抗氧化因子對氧磷酶1(paraoxonase-1, PON-1)的影響，從而探索匹伐他汀的多效性抗動脈粥樣硬化作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象：選取2018年1月至2020年1月就診于北京積水潭醫(yī)院心內科門診及病房的合并脂代謝異常的穩(wěn)定型冠心病患者60例，納入標準包括：1)經冠狀動脈造影證實或既往存在心肌梗死病史的穩(wěn)定型冠心病患者；2)年齡≥18歲;排除標準：1)肝、腎功能異常者；2)甲狀腺疾病及甲狀腺藥物應用史；3)妊娠；4)嚴重心力衰竭、感染、電解質紊亂。上述所有患者簽署知情同意書,經北京積水潭醫(yī)院倫理委員會批準(批準號：201803-05)。符合上述標準的受試者隨機分為兩組，一組予以匹伐他汀(pitavastatin)2～4 mg/d，另一組予以阿托伐他汀(atorvastatin)10～20 mg/d，觀察治療6個月，調整他汀劑量使LDL-C達標(<70 mg/dL)。

1.1.2 試劑與細胞：胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基(Gibco公司)；PCR引物(上海生工生物工程公司); Trizol(TaKaRa公司);qPCR檢測試劑盒(DBI公司)；3H-膽固醇油酸酯(GE公司)；20%的聚乙二醇、對氧磷、苯乙酸酯(Sigma-Aldrich公司)；急性單核細胞白血病細胞系THP-1(由中國醫(yī)學科學院基礎所免疫學系免疫學實驗室友情提供)。

1.2 方法

1.2.1 脂代謝指標的檢測:分別于治療前、治療后6個月抽取外周靜脈血10 mL，應用濕化學法進行各項脂代謝指標檢測，包括：LDL-C、HDL-C、TG、apoA-1和apoB等。

1.2.2 細胞的培養(yǎng): THP-1細胞在含有20%胎牛血清(FBS)與100 μg/mL青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經0.4 μmol/L的PMA孵化48 h分化為巨噬細胞，用油紅O染色及CD68免疫組化染色鑒定巨噬細胞。

1.2.3 聚乙二醇(PEG)-HDL的制備:血清標本與20%的PEG溶液按100∶40的比例混合，在200 mmol/L的甘氨酸緩沖液中在室溫下共同孵育15 min，4 000 r/min離心20 min,使含有apoB的脂蛋白沉淀，獲得上清液(PEG-HDL)備用。

1.2.4 膽固醇外流率的測定:THP-1巨噬細胞加入3.7×104Bq/mL[1 ci(居里)=3.7×1010Bq(貝可勒爾)]的3H膽固醇孵育液，37 ℃孵育24 h，同步化2 h，分別以PEG-HDL、apoA1及自身血清為接受體，觀察膽固醇外流率的變化。具體方法如文獻[5]所述。

1.2.5 氧磷酸1(PON-1)活性的測定：以PEG-HDL作為HDL相關性PON-1活性酶測定的反應物，以對氧磷和苯乙酸酯為底物，用分光光度法檢測對氧磷酶與芳基酯酶兩種酶活性。具體方法如下：對氧磷酶活性測定：應用對氧磷作為底物，以100 mmol/L Tris-Cl緩沖液(pH 8.5)建立200 μL的分析體系，包含2 mol/L NaCl和2 mmol/L CaCl2，1.2 mmol/L對氧磷，加入20 μL PEG-HDL。在25 ℃下，利用酶標儀在405 nm處連續(xù)掃描記錄5 min內產物生成速率。酶活性以μmol/(min·L)表示 1個PON-1酶活性單位值(U)。芳基酯酶活性測定：通過苯乙酸酯水解為苯酚的速率來進行測定，以20 mmol/L Tris緩沖液制成200 μL體系，包括：5 μL PEG-HDL樣品，1 mmol/L苯乙酸酯，0.9 mmol/L Cacl2(pH 8.0)。上述反應在37 ℃下，用酶標儀在260 nm處連續(xù)掃描5 min。酶活性以μmol/(min·L)表示1個PON-1活性單位。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 兩組患者治療前后血脂水平變化比較

兩組患者基線資料差異無統(tǒng)計學意義。治療后，兩組患者的LDL-C水平均有顯著下降(P<0.05)。HDL-C水平在匹伐他汀組治療后較治療前升高了9.0%，而阿托伐他汀組僅升高了1.8%(表1)。

表1 治療前后血脂水平比較

2.2 膽固醇外流率變化

2.2.1 PEG-HDL介導的膽固醇外流率：PEG-HDL介導的膽固醇外流率在匹伐他汀組治療后較治療前顯著增加(P<0.001)，而阿托伐他汀組治療前后則差異無統(tǒng)計學意義(圖1A)。

2.2.2 ApoA1及自身血清介導的膽固醇外流：兩組患者治療前后apoA1介導的膽固醇外流率差異均無顯著性(圖1B)。自身血清介導的膽固醇外流率在匹伐他汀治療后較治療前顯著增加(P<0.01)；而阿托伐他汀治療前后差異則無顯著性(圖1C)。

A.cholestrol efflux to PEG-HDL before and after statin treatment; B.cholestrol efflux to apoA1 before and after statin treatment; C.cholestrol efflux to auto-serum before and after statin treatment; *P<0.01 compared with pre-treatment

2.3 氧磷酶1(PON-1)酶活性水平的變化

PON-1酶活性水平(包括對氧磷酶和芳基酯酶)治療前后在匹伐他汀和阿托伐他汀兩組中均有顯著升高。匹伐他汀組，對氧磷酶和芳基酯酶活性水平較治療前分別增加了21%和18%(P<0.001)；阿托伐他汀治療組，對氧磷酶和芳基酯酶活性分別增加了24%和17%(P<0.001)(圖2)。

A.paraoronase activity of pre-and post-statin treatment; B.arylesterase activity of pre-and post-statin treatment;*P<0.001 compared with pre-treatment

3 討論

本研究在合并脂代謝異常的穩(wěn)定型冠心病患者中觀察到，匹伐他汀可使患者HDL-C水平顯著升高，而阿托伐他汀治療對HDL-C水平則無顯著影響，這與之前的研究結果相一致[6]。匹伐他汀具有更廣的降脂作用譜(不僅作用于含apoB的脂蛋白，還作用于含apoA的脂蛋白)，能夠刺激肝細胞apoA1的合成與分泌，從而導致HDL-C合成增加[7]。此外，匹伐他汀可通過誘導肝細胞ATP結合盒轉運蛋白A1(ATP-binding cassette transporter A1 ABCA1)的表達，使肝細胞內膽固醇外流至apoA1,從而使HDL-C合成增加[8]。

盡管大量研究結果顯示血漿 HDL-C水平與冠心病發(fā)病風險呈負相關，但HDL是一類異質性脂蛋白，不同HDL亞組分的組成、形狀大小、密度、電荷和抗動脈粥樣硬化特性等方面均不相同[9]，因此近年的研究認為，除了HDL-C水平檢測，針對HDL功能的評價指標將對冠心病的風險評估具有更重要的價值。本研究在觀察到匹伐他汀升高HDL-C的基礎上進一步探索了HDL-C功能的變化。結果發(fā)現，匹伐他汀治療6個月使HDL介導的膽固醇外流率顯著增加，同時，作為HDL-C相關的抗氧化因子PON-1活性水平也存在顯著升高。

膽固醇逆轉運是HDL-C發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用最重要的機制之一。在膽固醇逆轉運過程中，膽固醇外流是其中的限速步驟，多種轉運蛋白及分子參與了這個復雜的過程。本研究發(fā)現HDL介導的膽固醇外流率在匹伐他汀治療組顯著增高，提示匹伐他汀升高HDL-C水平的同時，使HDL-C的膽固醇外流功能得到改善，這與之前的研究結果是一致的[10]。

除了膽固醇外流功能外，抗氧化功能是HDL-C的另一項重要的抗動脈粥樣硬化機制。PON1是循環(huán)中與HDL緊密結合的一種鈣依賴性酯酶，是HDL抗氧化活性的最重要的成分之一。PON-1具有對氧磷酶活性，通過抑制LDL的氧化修飾發(fā)揮抗氧化作用，此外，PON-1還具有磷脂酶活性，通過水解氧化磷脂(致炎因子)，使細胞間黏附分子-1(ICAM-1)表達水平下降，從而發(fā)揮抗炎作用[11]。與之前的研究相一致，本研究發(fā)現，無論是匹伐他汀還是阿托伐他汀，均可導致PON-1水平增高，而這一HDL-C相關性的抗氧化作用可能是他汀類藥物的類效應[12]。

綜上所述，匹伐他汀治療不僅能使HDL-C水平升高，而且使HDL-C的膽固醇外流功能及抗氧化功能也得到保留和改善。本研究也存在一定局限與不足，樣本量偏小，治療時間相對較短，研究結果還需要為更多的研究所證實。