柯維忠 曾曉健 徐婷 劉霞霞 胡品書 游檢

摘要：獲取黃獨皂苷合成途徑關鍵酶環(huán)阿屯醇合酶（CAS）的基因全長 cDNA 序列，并進行序列分析。通過黃獨微型塊莖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫篩選得到 CAS基因的核心片段，利用RT-PCR 技術獲得CAS 基因保守片段，采用cDNA末端快速擴增（RACE）技術獲得CAS 基因的 3′及 5′末端序列，并采用生物信息學方法進行序列分析。結果表明，黃獨微型塊莖CAS基因編碼序列長2 280 bp，編碼814 bp的氨基酸序列，相對分子量為86 665.17 u，等電點為 6.21。CAS蛋白主要是由α螺旋（3366%）、延伸鏈（21.62%）以及無規(guī)則卷曲（44.72%）構成。CAS蛋白為親水性蛋白，無信號肽，三級結構為單體，含有CAS所必需的功能結構域，具有PLN03012多元結構域。CAS蛋白主要存在于質(zhì)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，可能為膜蛋白。黃獨CAS蛋白與其他植物的CAS 蛋白同源性較高，其中與菊葉薯蕷的CAS蛋白氨基酸相似性為9605%。從黃獨微型塊莖中首次獲得 CAS 基因 cDNA 全長序列，該基因具有 CAS 同源基因的典型特征。

關鍵詞：黃獨;微型塊莖;環(huán)阿屯醇合酶;基因克隆;序列分析

中圖分類號： R282;S188文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）04-0029-07

收稿日期：2021-05-26

基金項目：江西省教育廳科學技術研究一般項目（編號：GJJ190877）;國家自然科學基金（編號：31360072）;上饒市科技局平臺載體建設項目（編號：2019I017、2020I001、2020J001）。

作者簡介：柯維忠（1976—），男，江西上饒人，實驗師，主要從事植物生物技術研究。E-mail：258536862@qq.com。

黃獨（Dioscorea bulbifera L.）為薯蕷科薯蕷屬纏繞草質(zhì)藤本植物[1]。黃獨地下塊莖（俗稱黃藥子）藥性寒、味苦，有小毒，能清熱解毒、涼血止血、化痰消癭[2-3]。黃藥子生物活性廣泛[4]，臨床上多用于治療甲狀腺腫等疾病，療效顯著[5]。黃藥子化學成分豐富，其特有的成分為黃獨總皂苷[6-7]。研究表明，甾醇皂苷是由異戊二烯途徑合成的。環(huán)阿屯醇合酶（cycloartenol synthase，CAS）可將鯊烯環(huán)氧酶（squalene epoxidase，SE）催化成為環(huán)阿屯醇，這個反應是異戊二烯代謝途徑中進一步合成甾醇皂苷的必經(jīng)步驟[8]。因此，CAS 是植物甾醇及甾體類物質(zhì)生物合成的第一個關鍵酶，其基因的克隆和序列分析受到了專家和學者重視。因此，研究黃獨環(huán)阿屯醇合酶的基因克隆與序列分析具有現(xiàn)實意義。

目前，對環(huán)阿屯醇合酶基因克隆與序列分析的研究主要集中在葫蘆巴（Trigonella foenum-graecum L.）[9]、丹參（Salvia miltiorrhiza）[10]、滇重樓[Paris polyphylla Smith var. yunnanensis （Franch.） Hand.-Mazz.][11]和盾葉薯蕷（Dioscorea zingiberensis C.H.Wright）[8]等植物上，而關于黃獨環(huán)阿屯醇合酶基因的克隆與序列分析未見報道。近年來，黃獨的藥用價值愈加得到人們重視，黃獨的市場需求較為旺盛，造成黃獨資源的缺乏。因此，采用植物組織培養(yǎng)技術對其進行育苗，是提高黃獨種苗的有效途徑。目前，對黃獨的莖尖脫毒快繁[12]、種質(zhì)超低溫保存[13]以及微型塊莖誘導形成[14]等方面已經(jīng)開展研究，今后利用細胞懸浮培養(yǎng)的方法提高總皂苷的產(chǎn)量，也是總皂苷生產(chǎn)的一個總方向[15]。因此，對黃獨環(huán)阿屯醇合酶基因進行克隆與序列分析可以為黃獨細胞懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)總皂苷提供靶向篩選選擇。本研究擬以黃獨微型塊莖為材料，采用CDNA末端快速擴增（RACE）技術克隆其皂苷合成代謝途徑中的黃獨環(huán)阿屯醇合酶（CAS）基因，并對其進行序列分析，為進一步研究黃獨總皂苷合成代謝機制和利用次生代謝工程的手段提高黃獨品質(zhì)奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黃獨試管苗微型塊莖由上饒師范學院生命科學學院植物組織培養(yǎng)室提供。試驗時間：2016年10月至2017年3月。試驗地點：上饒師范學院生命科學學院。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設計 以從黃獨微型塊莖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選的CAS基因中間序列為基礎，利用Primer 5軟件設計引物：RC190-CAS-1F（A A C A Y A T W C A T T A T G A A G A T G A G A A C A）;RC190-CAS-1R（C C A W G C A C C T T T W G A A A T G T G A C）;RC190-CAS-1R1（C C A R C C A C C W G A A G G W A G C T S T）。接頭引物：3′adaptor（G C T G T C A A C G A T A C G C T A C G T A A C G G C A T G A C A G T G T T T T T T T T T T T T T T T T T T）;5.3′outer（G C T G T C A A C G A T A C G C T A C G T A A C）;5.3′inner（G C T A C G T A A C G G C A T G A C A G T G）;AUAP（G G C C A C G C G T C G A C T A G T A C）;AAP（G C C A C G C G T C G A C T A G T A C G G G G G G G G G G）。3′RACE 特異性引物：RC190-CAS-F3（G A T G C A A A A C G G C T T T A T G A T G C T G T C）;RC190-CAS-F4（G G C T T T G C C A C T T A T G A A C T G A C A C G A T）;RC190-CAS-F4i（G A G A T C C A A A A C C A T T G C A T）。5′RACE 特異性引物：RC190-CAS-R10（T G T G A C C C T C G A T G T G T A A A C C C C A A）;RC190-CAS-R9（G C C C C A T C T C C T C C T T C A G C T T C T T）;RC190-CAS-R6（G C A G G T G C A A C T T A A A G G C C T C T G A A T T）;RC190-CAS-R5（G G C T G C C A T T A T A A C C C T G C A T T T T C A T）;RC190-CAS-RT1（C C A C C A T C T T C A T T C A T G A G G G A A A G G A T）。

1.2.2 RNA抽提與純化 RNA抽提與純化采用柱式Trizol總RNA提取試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司的試劑盒SK1312]。采用1.5%瓊脂糖進行電泳，經(jīng)1×TAE電泳緩沖液，在紫外透射光下進行觀察并對其拍照。

1.2.3 cDNA第一鏈合成 在0.2 mL PCR管中加入total RNA（10 μL）和 3′adaptor（1 μL）。70 ℃溫浴 5 min，然后冰浴2 min，加入 5× First-Strand Buffer 4.0 μL、10 mmol dNTP 2 μL、RNase抑制劑1 μL、逆轉(zhuǎn)錄酶2 μL進行離心（總體積 20.0 μL）。離心后42 ℃溫浴60 min，再72 ℃溫浴10 min。

1.2.4 基因調(diào)取 PCR反應體系（總體積25 μL）：2×GC Buffer Ⅰ 12.5 μL、10 μmol/L RC190-CAS-1F 0.5 μL、10 μmol/L RC190-CAS-1R/RC190-CAS-1R1 0.5 μL、2.5 mmol/L dNTP 4 μL、ddH2O 6.3 μL、cDNA模板1 μL、5 U/μL Taq酶0.2 μL。PCR循環(huán)條件：95 ℃預變性3 min;94 ℃ 變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，33個循環(huán);72 ℃修復延伸7 min。利用柱式DNA膠回收試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司試劑盒B518131]進行PCR電泳與回收。經(jīng)1%糖凝膠電泳觀察結果后，對PCR產(chǎn)物膠進行回收測序。

1.2.5 3′RACE 第一輪巢氏PCR反應體系（以3′adaptor為反轉(zhuǎn)引物的cDNA為模版）（總體積 25 μL）：2×GC Buffer Ⅰ 12.5 μL、10 μmol/L RC190-CAS-F3 0.5 μL、10 μmol/L 5.3′outer 0.5 μL、2.5 mmol/L dNTP 4 μL、ddH2O 6.3 μL、模板（cDNA）1 μL、5 U/μL Taq 酶0.2 μL。第二輪巢氏PCR反應體系（以3′adaptor為反轉(zhuǎn)引物的cDNA為模版）（總體積50 μL）：2×GC Buffer Ⅰ 25 μL、10 μmol/L RC190-CAS-F4 1 μL、10 μmol/L 5.3′inner 1 μL、2.5 mmol/L dNTP 8 μL、ddH2O 12.5 μL、模板（第一輪PCR稀釋產(chǎn)物） 1 μL、5 U/μL Taq酶 0.5 μL。第一輪PCR循環(huán)條件：95 ℃ 預變性3 min;94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，33個循環(huán);72 ℃修復延伸7 min。第二輪PCR循環(huán)條件：95 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，33個循環(huán);72 ℃修復延伸7 min。利用柱式DNA膠回收試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司試劑盒B518131]進行PCR電泳與回收。經(jīng)1%糖凝膠電泳觀察結果后，對PCR產(chǎn)物膠進行回收測序。

1.2.6 5 ′RACE 第一輪巢氏PCR反應體系（末端加C法，以特異性引物RC190-CAS-RT1反轉(zhuǎn)，得到cDNA，經(jīng)核糖核酸酶H（RNase H）和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）處理后，進行巢氏PCR，操作步驟見Invitrogen 5′ RACE系統(tǒng)手冊）（總體積25 μL）：2×GC Buffer Ⅰ 12.5 μL、10 μmol/L AAP 0.5 μL、10 μmol/L RC190-CAS-R5/RC190-CAS-R9 05 μL、25 mmol/L dNTP 4 μL、ddH2O 6.3 μL、模板（cDNA） 1 μL、5 U/μL Taq酶0.2 μL。第二輪巢氏PCR反應體系（末端加C法，以特異性引物RC190-CAS-RT1反轉(zhuǎn)，得到cDNA，經(jīng)RNase H 和TdT處理后，進行巢氏PCR，操作步驟見Invitrogen 5′ RACE系統(tǒng)手冊）（總體積50 μL）：2×GC Buffer Ⅰ 25 μL、10μmol/L AUAP 1 μL、10 μmol/L RC190-CAS-R6/RC190-CAS-R10 1 μL、2.5 mmol/L dNTP 8 μL、ddH2O 12.5 μL、模板（第一輪PCR稀釋產(chǎn)物）1 μL、5 U/μL Taq酶 05 μL。第一輪PCR循環(huán)條件：95 ℃ 預變性 3 min;94 ℃變性30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸 60 s，33個循環(huán);72 ℃修復延伸7 min。第二輪PCR循環(huán)條件：95 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，33個循環(huán);72 ℃修復延伸7 min。按照柱式DNA膠回收試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司試劑盒B518131]進行PCR電泳與回收。經(jīng)1%糖凝膠電泳觀察結果后，對PCR產(chǎn)物進行克隆測序。

1.2.7 序列拼接 利用 DNAMAN 軟件將中間序列及RACE試驗得到的序列進行拼接，得到基因全長序列。

1.2.8 分析方法 測序獲得的基因cDNA序列經(jīng)NCBI的ORF finder（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）服務器，進行開放閱讀框分析。此外，借助ProtParam pI/Mw（http：//web.expasy.org/compute_pi）、GOR IV（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_gor4.html）、SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）軟件預測目標序列一、二、三級結構;再依次利用 SigalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）和 ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）軟件預測基因編碼氨基酸的信號肽和疏水性/親水性;最后使用Blastp 工具在NCBI 上查找基因同源氨基酸序列，并運用MEGA 4.0軟件中的近鄰相接法（nerghbor-joining，NJ）（1 000次Bootstrap）構建同源進化樹。

2 結果與分析

2.1 RNA 提取

黃獨微型塊莖總RNA的電泳圖見圖1。左側(cè)泳道可清晰觀察到28S和18S 2條區(qū)帶，表明提取的RNA較為完整，質(zhì)量較高，可用于RT-PCR。

2.2 黃獨微型塊莖CAS基因克隆

通過RACE技術（圖2），得到全長為2 280 bp的cDNA序列（圖3），G+C含量為45.70%，A+T含量為54.30%，堿基組成見圖4。經(jīng)NCBI的ORF finder進行開放閱讀框分析，得到814 bp的氨基酸序列（圖5）。

2.3 CAS基因預測氨基酸的一級結構分析

Protparam預測顯示該蛋白由759個氨基酸組成，分子量為86 665.17 u，等電點為6.21，為親水性蛋白。氨基酸的組成和比例為49個丙氨酸 （Ala），占6.5%;40個精氨酸 （Arg），占5.3%;31個天冬酰胺 （Asn），占4.1%;36個天冬氨酸（Asp），占47%;19個半胱氨酸（Cys），占2.5%;24個谷氨酰胺 （Gln），占3.2%;50個谷氨酸（Glu），占6.6%;59個甘氨酸 （Gly），占7.8%;27個組氨酸 （His），占3.6%;42個異亮氨酸（Ile），占5.5%;79個亮氨酸（Leu），占10.4%;35個賴氨酸 （Lys），占 4.6%;22個甲硫氨酸 （Met），占2.9%;28個苯丙氨酸 （Phe），占3.7%;41個脯氨酸 （Pro），占5.4%;47個絲氨酸 （Ser），占6.2%;33個蘇氨酸 （Thr），占4.3%;27個色氨酸 （Trp），占3.6%;33個酪氨酸 （Tyr），占4.3%;37個纈氨酸 （Val），占4.9%。負電荷殘基（Asp+Glu）總數(shù)為86;正電荷殘基（Arg+Lys）總數(shù)為75;原子總數(shù)為12 058個，具體組成如下：碳原子3 917個，氫原子5 950個，氮原子1 050個，氧原子1 100個，硫原子41個。

2.4 CAS蛋白二級結構分析

由GOR IV軟件預測（圖6和表1）得知，CAS蛋白主要是由α螺旋（圖6中藍色部分，占33.66%）、延伸鏈（圖6中紅色部分，占21.62%）以及無規(guī)則卷曲（圖6中黃色部分，占44.72%）構成，該蛋白質(zhì)可能不含β折疊結構。

2.5 CAS蛋白親水性/疏水性預測

通過ProtScale軟件預測分析，從圖7可知，圖中的高峰值（正值）的區(qū)域表示疏水的區(qū)域，而負值的低谷區(qū)域是親水區(qū)域。 由親疏水性分析可知，該蛋白為親水性蛋白質(zhì)。

2.6 CAS蛋白信號肽預測與分析

SignalP 4.0 Server軟件預測結果（表2）顯示，CAS編碼蛋白的第25位苯丙氨酸殘基可能是信號肽原始剪切位點，其最高預測分值及最高的信號肽分值分別僅為0.168、0.277，第35位丙氨酸殘基的最高綜合剪切位點分值0.201，綜合分析結果表明CAS蛋白無信號肽。

2.7 CAS蛋白三級結構分析

蛋白質(zhì)三維結構預測分析結果顯示，CAS蛋白質(zhì)主要由α螺旋、延伸鏈以及無規(guī)則卷曲構成，與二級結構分析結果一致。SWISS-MODEL預測結果顯示其三級結構為單體。蛋白質(zhì)結構域分析結果表明，CAS蛋白包含有CAS所必需的功能結構域（圖8）。

2.8 CAS蛋白功能預測

通過CAS氨基酸序列比對KEGG數(shù)據(jù)庫，得到直系同源KEGG號：K01853（http：//www.genome.jp/dbget-bin/www_bget？K01853）（圖9）。參與 2，3-環(huán)氧角鯊烯生成環(huán)阿屯醇的酶促反應過程。

2.9 CAS蛋白的保守結構域分析

經(jīng)軟件分析，該蛋白屬于 IDOPREN_C2_like superfamily，具有PLN03012多元結構域。

2.10 CAS蛋白亞細胞定位

采用 Psort在線軟件對CAS基因的表達部位進行預測結果（圖10）表明，定位于質(zhì)膜（plas）中的數(shù)量為6，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（E.R.）中的數(shù)量為4，葉綠體（chlo）中的數(shù)量為1，細胞核（nucl）中的數(shù)量為1，細胞質(zhì)（cyto）中的數(shù)量為1，線粒體（mito）中的數(shù)量為1，表明CAS蛋白主要存在于質(zhì)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。該蛋白可能為膜蛋白。

2.11 CAS蛋白的氨基酸同源性分析

應用NCBI中的BlastP程序，對CAS蛋白的氨基酸序列進行同源性分析（圖11）發(fā)現(xiàn)，該蛋白與菊葉薯蕷（Dioscorea composite，AIW81530.1）的CAS蛋白氨基酸相似性為96.05%。系統(tǒng)進化樹分析也顯示，該蛋白與菊葉薯蕷CAS蛋白（AIW81530.1）親緣關系較近。

3 討論

薯蕷皂苷廣泛存在于藥用植物中，如薯蕷科、百合科、石竹科和薔薇科等，尤其在薯蕷屬植物根莖中含量豐富[16-17]，具有抑瘤、抗菌、免疫調(diào)節(jié)等多種藥用活性[9]。薯蕷皂苷為糖綴合物，1個或多個糖鏈連接于非極性三萜或類固醇苷骨架，化學結構類似甾體激素[18]。因此，薯蕷皂苷廣泛用于激素類藥物的合成，是醫(yī)藥工業(yè)中僅次于抗生素的世界第二大類藥物，被譽為“激素之母”，我國薯蕷皂苷年產(chǎn)量約為3 500 t，占全世界年需求總量的70%[19]。研究表明，膽固醇或 β-谷甾醇是薯蕷皂素的合成前體，而薯蕷皂素合成的必經(jīng)中間體是環(huán)阿屯醇[20]。氧化鯊烯環(huán)化酶家族中一個重要成員是CAS，它可以催化2，3-氧化鯊烯轉(zhuǎn)化為環(huán)阿屯醇[21]，CAS基因是環(huán)阿屯醇合成的關鍵調(diào)控基因，也是甾醇及甾體類物質(zhì)生物合成的重要環(huán)化酶[22]。環(huán)阿屯醇為植物甾醇類化合物，是甾醇類化合物生物合成的關鍵前體物質(zhì)，可抗炎、抗氧化、抗腫瘤、調(diào)節(jié)膽固醇等。目前，CAS基因已從葫蘆巴（Trigonella foenum-graecum L.）[9]、丹參（Salvia miltiorrhiza）[10]、滇重樓[Paris polyphylla Smith var. yunnanensis （Franch.） Hand.-Mazz.][11]和盾葉薯蕷（Dioscorea zingiberensis C.H.Wright）[8]等多種植物中分離和克隆，并對其序列特征進行了分析。

微型塊莖別稱“零余子”“小塊莖”“珠芽”，是腋芽形成的地上變態(tài)小塊莖顆粒，特指薯蕷屬植物組培試管苗腋芽處極易誘導形成且附生較多氣生根的小型變態(tài)塊莖[23]，可以在黑暗和低溫處長期保存且可恢復活力萌芽，具有體積小、便于儲存和運輸?shù)葍?yōu)點[23]，不僅可作為薯蕷屬植物田間繁殖的生產(chǎn)種子，也可作為薯蕷皂苷提取和生產(chǎn)的重要來源[24]。本試驗通過對黃獨微型塊莖轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行分析，篩選到CAS基因的中間序列核心片段，利用RACE 技術獲取該基因全長cDNA序列，生物信息學分析結果表明，CAS基因編碼序列長2 679 bp，編碼814 bp的氨基酸序列，相對分子量為 92 703.04 u，等電點為 621。這是在黃獨中首次分離得到該基因，研究結果對下一步利用該基因構建表達載體，分析其在微型塊莖誘導形成過程中所具有的功能具有重要意義。同時，也為進一步研究黃獨總皂苷合成代謝機制和利用次生代謝工程的手段提高黃獨品質(zhì)奠定了基礎。

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