陳 燁，黃璟雯，王熠璠，黃家祺，李康寧，李才明，王小三，楊兆琪

(1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫214122; 2. 江南大學 藥學院，江蘇 無錫214122)

n-3多不飽和脂肪酸(PUFA)指在甲基端第三位出現第一個雙鍵的多烯脂肪酸。n-3 PUFA常見的形式有二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)、二十二碳六烯酸(DHA)和α-亞麻酸(ALA)，其中： DHA和EPA主要來源于藻油以及海豹油、沙丁魚油等海洋油脂，微藻中EPA和DHA分別占總脂的13.19%～31.93%和4.25%～13.36%[1]，海豹油中DHA和EPA相對含量分別為7.98%和8.24%[2]，沙丁魚中EPA與DHA的含量分別為99.0 mg/100 g和495.0 mg/100 g[3]；DPA在海豹油、深海魚油等海洋油脂中含量相對較高，其中，海豹油中DPA相對含量為4.09%，深海魚油中含2.09%的DPA[2]；而ALA主要來源于亞麻籽油、紫蘇籽油等植物油，亞麻籽油中不飽和脂肪酸含量為80%以上,其中α-亞麻酸含量約60%，紫蘇籽油中不飽和脂肪酸含量達90%以上，其中α-亞麻酸含量在60%左右[4]。

n-3 PUFA與機體健康密切相關。研究表明，n-3 PUFA具有良好的抗炎、免疫調節(jié)等作用，對膿毒癥患者腸道菌群失調的改善、重型顱腦損傷患者炎癥的抑制與治療具有良好的作用[5-6]。同時，n-3 PUFA對于癌癥也具有一定的治療功效，DHA和EPA不但可以預防癌癥的發(fā)生，還能夠抑制癌細胞的增殖，加快癌細胞凋亡，減少不良反應的發(fā)生，目前已被廣泛應用于胃癌、食管癌、大腸癌等癌癥患者的治療[7-9]。n-3 PUFA對于母嬰健康也有重要意義，n-3 PUFA能夠參與卵母細胞的物質代謝，調節(jié)卵母細胞膜的合成與功能，因此n-3 PUFA能夠提高卵母細胞質量，有利于尋找不孕病因從而對生殖的改善具有重要作用[10]。DHA有利于嬰幼兒大腦、視覺、機體的認知和免疫功能的發(fā)育[11]。不僅如此，由于EPA和DHA能夠抑制炎癥、增強巨噬細胞的吞噬能力，因此EPA和DHA被認為可以用于新冠病毒(COVID-19)的輔助治療[12]。

n-3 PUFA作為藥物及保健品的功效取決于兩方面：n-3 PUFA的純度和其存在的形式。n-3 PUFA主要有3種存在形式，即游離型、乙酯型和甘油酯型。

由于天然油脂中n-3 PUFA的含量較少，對其進行高效富集極其重要。由于提取與制備游離型與乙酯型的n-3 PUFA工藝較為成熟，故目前市場上常見的食品或藥品中的n-3 PUFA多以游離型和乙酯型存在。游離型n-3 PUFA生物利用度較高，但是穩(wěn)定性差，在制備與富集的過程中易被氧化，造成產率降低；乙酯型n-3 PUFA穩(wěn)定性好，不易被氧化，但是生物利用度低，很難被機體吸收；而甘油酯型n-3 PUFA的生物利用度高且不易被氧化，其作為DHA和EPA的天然存在形式，機體中的胰脂酶水解甘油酯型n-3 PUFA的速度為乙酯型的10～50倍[13]，因此甘油酯型n-3 PUFA更容易被生物體利用。在市面上已有的添加甘油酯型魚油的保健品及藥品中，n-3 PUFA的含量普遍不高，而且目前鮮有對甘油酯型n-3 PUFA進行高純度富集的方法。在已經存在的甘油酯型n-3 PUFA富集方法中，酶法以其安全環(huán)保、選擇性強等優(yōu)點近年來備受關注，但是僅有少數脂肪酶被證實擁有選擇性富集甘油酯型n-3 PUFA的能力，導致該方法的成本較高，難以實現工業(yè)化生產。本文著重整理了目前甘油酯型n-3 PUFA的3種常見富集方法，以期為甘油酯型n-3 PUFA的高值化更加深入的研究提供參考。

1 物理法一步富集甘油酯型n-3 PUFA

低溫結晶法為較為常見的富集甘油酯型n-3 PUFA的物理法，其是利用不同脂肪酸甘三酯因脂肪酸不飽和程度和分子結構的不同而引起的溶解度不同的性質，在較低的溫度下，使溶解度較低的脂肪酸甘三酯結晶析出，從而達到富集n-3 PUFA的目的。Mu等[14]分別以游離脂肪酸(FFA)和甘三酯為原料，富集其中的DHA，研究了反應溫度、溶劑類型、FFA(或甘三酯)與溶劑比和反應時間等因素對富集效果的影響，發(fā)現在以FFA為原料時，FFA質量與溶劑(乙腈)體積比為1∶5，在-60℃下結晶80 min時，DHA產率最高，為52.57%，含量為64.81%；而以甘三酯為原料時，在甘三酯質量與溶劑(丙酮)體積比1∶10、-80℃下結晶4 h，DHA產率和含量分別為62.46%和53.87%。 Wang等[15]將裂殖壺菌油在-80℃下結晶6 h后，甘油酯型的DPA含量由16.4%提高到28.1%。近兩年來，由于低溫結晶法可以有效避免產物被氧化，其成為了物理法富集甘油酯型n-3 PUFA的重要方法。

2 兩步法富集甘油酯型 n-3 PUFA

為了避免物理法直接富集甘油酯型n-3 PUFA存在的產物得率低等局限性，學者們研究利用兩步法富集甘油酯型n-3 PUFA。甘油酯型n-3 PUFA的兩步法富集工藝為首先富集游離型或乙酯型n-3 PUFA，然后再經過酯化或酯交換制得高n-3 PUFA含量的甘油酯。

2.1 游離型及乙酯型n-3 PUFA的富集

2.1.1 物理法

傳統(tǒng)的游離型及乙酯型n-3 PUFA的物理富集方法主要有分子蒸餾法、尿素包合法、低溫結晶法等。王亞男等[16]使用分子蒸餾法對金槍魚油乙酯的富集工藝進行了研究，結果表明，經過3級分子蒸餾，最終得到得率為10.1%、n-3 PUFA含量為70.78%的產品。孫素玲[17]以海狗油為原料，采用皂化法制備游離脂肪酸，再使用尿素包合法富集PUFA，結果表明，在尿素與脂肪酸質量比為4.5∶1、結晶溫度4℃、結晶時間20 h條件下，富集得到的脂肪酸產率為17.91%，EPA、DPA和DHA的總含量從21.1%提高至73.32%。羅慶華等[18]采用低溫結晶法富集鳡魚內臟油中PUFA，可使PUFA的含量提高24.26百分點。尿素包合法和低溫結晶法為傳統(tǒng)富集游離型n-3 PUFA的方法，工藝簡單，成本低廉，n-3 PUFA的雙鍵不易被氧化；但是這兩種方法產品得率都不高，并且尿素包合過程中會產生致癌物，對人的健康安全帶來隱患[19]。

2.1.2 酶法

利用脂肪酶選擇性富集游離型或乙酯型n-3 PUFA也是一種常用的方法。游離型和乙酯型PUFA酶法選擇性富集路線示意圖如圖1所示。由圖1可知，游離型和乙酯型n-3 PUFA分別通過酶催化選擇性酯化和水解，再采用堿法分離獲得富集。富集游離型n-3 PUFA時，利用酶選擇性地催化飽和、單不飽和脂肪酸與甘油進行酯化，生成脂肪酸酯，而PUFA難以與甘油發(fā)生酯化反應，以游離脂肪酸形式存在于產物中，將游離脂肪酸與脂肪酸酯分離后，即可得到高純度的游離型PUFA[20]。富集乙酯型n-3 PUFA時，利用酶選擇性催化飽和、單不飽和脂肪酸乙酯水解生成游離脂肪酸，而PUFA仍以乙酯的形式存在于產物中，分離游離脂肪酸后即可得到高純度的乙酯型PUFA。

圖1 游離型和乙酯型PUFA酶法選擇性富集路線示意圖

2.2 酶法酯化或酯交換制備甘油酯型n-3 PUFA

此步驟主要通過乙酯型n-3 PUFA與甘三酯發(fā)生酯交換，或游離型n-3 PUFA與甘油直接酯化合成甘油酯型n-3 PUFA。孫兆敏等[21]采用固定化酶Novozym 435催化脂肪酸乙酯與甘三酯進行酯交換反應，制備甘三酯型n-3 PUFA，在反應溫度60℃、反應時間24 h、底物質量比5∶4、加酶量80 U、體系中不加水的條件下，制得甘三酯中EPA和DHA的含量分別為32.40%和13.10%的產品。陳小娥等[22]利用脂肪酶催化游離型EPA、DHA與甘油反應，在反應體系中含正己烷6 mL、甘油與EPA(DHA)摩爾比1∶3、Novozym 435脂肪酶添加量100 mg條件下，于40℃反應24 h后添加1 g分子篩，繼續(xù)反應48 h，最終甘三酯型EPA和甘三酯型DHA的得率分別為88.64%和88.07%，酯化度分別高達95.0%和94.5%。使用酶法將游離型和乙酯型n-3 PUFA轉換為甘油酯型n-3 PUFA，方便快捷，但是使用的脂肪酶如Novozym 435，雖能重復利用，卻價格昂貴，導致總體生產成本較高。因此，若要將此方法應用于大規(guī)模生產，仍需尋找價廉且高效的脂肪酶。

兩步法富集甘油酯型n-3 PUFA需要先將含n-3 PUFA的天然油脂水解或乙酯化得到游離型或乙酯型n-3 PUFA，然后在酶的催化下通過酯化或酯交換反應生成甘油酯型n-3 PUFA。該富集工藝復雜，在轉化過程中易造成n-3 PUFA的氧化，導致產率降低，同時還會產生廢水，且酯化反應較易生成不穩(wěn)定的sn-1,3位的甘油酯型n-3 PUFA，這些缺陷嚴重制約著該方法在甘油酯型n-3 PUFA富集中的應用。

3 酶法一步富集n-3 PUFA甘油酯

近20年來，脂肪酶催化水解甘三酯(TAG)直接富集n-3 PUFA的研究一直在進行，許多研究人員在探尋能夠選擇性水解甘三酯上的飽和脂肪酸(SFA)和單不飽和脂肪酸(MUFA)以產生富含n-3 PUFA的甘油酯的脂肪酶。表1總結了一些近年來酶法水解直接富集n-3 PUFA的反應中使用的脂肪酶、最適溫度、pH和相應的富集效果。

表1 脂肪酶水解富集n-3 PUFA的研究

影響脂肪酶催化水解反應活性的主要因素是反應溫度和pH，脂肪酶水解反應的pH一般為5～8，溫度一般為25～45℃。脂肪酶催化水解富集甘油酯型n-3 PUFA不僅需要脂肪酶具有脂肪酸選擇特異性，也要控制水解反應的程度，避免過度水解。PUFA的酶催化水解富集通常需要8 h以上的水解時間，加入金屬離子可以大大縮短反應時間[29]。Akanbi等[26]加入鈣離子后能在3 h內完成水解反應，遠低于純油水體系8 h的反應時間；Yang等[28]發(fā)現，鈣離子的加入能將反應到達平衡的時間從10 h縮短至4 h，大大提升水解效率，在降低成本的同時減少n-3 PUFA因長時間暴露而產生的損失。Kamal等[30]研究了38種有選擇性濃縮n-3 PUFA甘油酯潛力的脂肪酶，通過共價和非共價連接，對底物-脂肪酶相互作用進行了詳細的研究，并從脂肪酶的微觀結構對脂肪酶的選擇性進行了解釋。盡管如此，現有脂肪酶對甘油酯型n-3 PUFA的富集能力有限，因而對于富集能力更強的選擇性脂肪酶的發(fā)掘是必要的。酶法水解可以直接將含有n-3 PUFA的天然油脂上的SFA和MUFA水解下來，產生的游離脂肪酸SFA和MUFA可以通過加堿中和的方法比較容易地去除，操作簡單方便。Kralovec等[31]發(fā)現，天然魚油中sn-2位的n-3 PUFA含量高于sn-1, 3位，而酶法水解天然油脂得到的產品中n-3 PUFA仍然保持在sn-2位，因此可以最大程度保持天然結構，使產物具有更強的結構穩(wěn)定性和更高價值[32]。綜合看來，酶法催化水解是富集甘油酯型n-3 PUFA最有效可行的方法。

4 結 語

甘油酯型n-3 PUFA作為n-3 PUFA的自然存在狀態(tài)，具有吸收性好、安全性高等優(yōu)點。傳統(tǒng)的甘油酯型n-3 PUFA富集方法為物理一步法與兩步法。物理一步法可以避免產物氧化，但是得率較低；兩步法工藝復雜，并有可能產生環(huán)境污染。而酶一步法富集甘油酯型n-3 PUFA以其簡單、高效等優(yōu)點成為了近年來學者們關注的焦點。目前已經發(fā)現了能夠特異性識別并“剪切”甘油酯的脂肪酶，但是甘油酯型n-3 PUFA的商業(yè)化應用仍未形成規(guī)模，主要原因為酶法選擇性水解工藝尚不成熟，難以達到甘油酯型n-3 PUFA的高效富集以及高值化應用。因此，未來應加大對于增加固定化酶重復利用的次數、降低富集成本以及進一步提高所得n-3 PUFA甘油酯的純度和得率的深入研究。