李小敏，胡志雄，張維農(nóng)，齊玉堂，張燕鵬，杜 言，左 陳

(武漢輕工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，武漢 430023)

碳量子點(diǎn)是碳納米材料家族中尺寸小于10 nm的新成員之一[1-2]，由配體修飾的碳質(zhì)核心表面組成，顯示出內(nèi)在的光致發(fā)光特性。碳量子點(diǎn)具有良好的生物相容性、光學(xué)和化學(xué)穩(wěn)定性，豐富的表面官能團(tuán)和極好的水溶性等特性，被廣泛應(yīng)用于生物傳感[3]、細(xì)胞成像[4]、藥物輸送[2]及催化等領(lǐng)域。碳量子點(diǎn)主要有“自上而下”和“自下而上”兩種合成路線。其中“自上而下”法通常是通過各種方法將最大的宏觀結(jié)構(gòu)分解成許多納米結(jié)構(gòu)，主要包括激光燒蝕、電弧放電、電化學(xué)氧化法[5]等，其碳源包括石墨、煤炭、活性炭和納米金剛石[6]等；“自下而上”法的思路是由小分子構(gòu)建更大的分子結(jié)構(gòu)體系，主要包括熱解[7]、水熱[8]、微波合成[9]、化學(xué)氧化[10]和模板法[11]等，碳源包括檸檬酸鹽、碳水化合物、有機(jī)酸等。

近幾年，以天然和生態(tài)友好的材料作為碳前體，合成無毒、量子化產(chǎn)率高、水溶性好、綠色環(huán)保的熒光碳量子點(diǎn)備受關(guān)注[12]，各種生物質(zhì)材料如植物果實、果皮、中草藥、奶制品等作為碳源制備熒光碳量子點(diǎn)的報道很多。Sahu等[13]通過水熱合成法處理橙汁制備高綠色熒光碳量子點(diǎn)，可用于細(xì)胞成像；Huang等[14]以草莓汁為原料合成含氮碳量子點(diǎn)，并將其應(yīng)用于Hg2+的檢測。我國作為稻米生產(chǎn)大國，稻谷加工過程中的副產(chǎn)物米糠蛋白資源豐富，氨基酸組成接近FAO/WHO推薦的最佳模式，具有高生物價、生物效價、消化率及低致敏性等優(yōu)點(diǎn)，常被用于嬰幼兒食品配方中。米糠及其副產(chǎn)物米糠蛋白含有豐富的碳元素，為碳量子點(diǎn)的制備提供了所需的碳源。目前使用米糠及其副產(chǎn)物開發(fā)新型碳量子點(diǎn)的報道甚少，米糠蛋白為碳源制備高熒光性能的碳量子點(diǎn)尚未見報道。本文首次以米糠蛋白為原料制備碳量子點(diǎn)，并對米糠蛋白碳量子點(diǎn)進(jìn)行了表征，探究其穩(wěn)定性及應(yīng)用效果，為米糠蛋白的高值循環(huán)再利用提供了一條創(chuàng)新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

米糠，潛江市洪湖浪米業(yè)有限責(zé)任公司；鹽酸、氫氧化鈉、氯化鈉、甲醇、丙醇、二甲基亞砜(DMSO)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，均為分析純；無水乙醇為色譜純，國藥集團(tuán)；三氯化鐵、三羥甲基氨基甲烷，阿拉丁試劑有限公司；正己烷、乙腈、二氯甲烷，均為分析純，科密歐試劑有限公司。

Alpha 1-2 LD plus冷凍干燥機(jī)，德國Christ公司；Perkin Elmer Lambda 650紫外可見分光光度計；Enspire酶標(biāo)儀，美國珀金埃爾默公司；水熱反應(yīng)釜，河南博碩儀器設(shè)備有限公司；傅里葉紅外光譜儀，Perkin Elmer Frontier公司；F-4600熒光光譜儀，日本日立公司；ZF-7A手提紫外檢測燈，上海寶光電光儀器廠；44 Talos F200X場發(fā)射透射電子顯微鏡(TEM)，荷蘭飛利浦公司；FV1200激光共聚焦顯微掃描鏡，日本Olympus公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 米糠蛋白(RBP)的制備

參考文獻(xiàn)[15]的方法制備RBP。將米糠用正己烷脫脂，取一定量脫脂米糠粕，按質(zhì)量體積比 1∶10加入雙蒸水，混勻，用2 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH 恒定為9.0，于55℃攪拌浸提2 h后，于12 000 r/min離心15 min，沉淀為脫脂脫蛋白米糠，置于45℃的烘箱烘干，上清液用2 mol/L的HCl調(diào)節(jié)pH為4.5，離心，沉淀水洗3次，直至水洗溶液的pH為7.0，冷凍干燥獲得RBP，于4℃冰箱保存?zhèn)溆?。凱氏定氮法測定RBP的蛋白質(zhì)含量為85.1%。

1.2.2 米糠蛋白碳量子點(diǎn)的制備

采用水熱合成法制備米糠蛋白碳量子點(diǎn)(RBP-CDs)。稱取1.0 g米糠蛋白，置入50 mL水熱反應(yīng)釜中，加入30 mL蒸餾水，攪拌使其溶解或分散均勻，于180℃反應(yīng)12 h，取出反應(yīng)后的溶液攪拌均勻，于5 000 r/min離心10 min，過濾后濾液透析(分子質(zhì)量1 000 Da)24 h，每隔4 h換1次水，透析后的溶液冷凍干燥即得RBP-CDs粉末。

1.2.3 RBP-CDs的熒光光譜、紫外-可見吸收光譜測定

采用F-4600熒光光譜儀，在310～600 nm范圍內(nèi)掃描熒光光譜，掃描速度1 200 nm/s，掃描電壓700 V，EX/EM狹縫寬度5/5 nm。配制0.2 mg/mL的RBP-CDs溶液(以50 mmol/L pH 7.4的Tris-HCl緩沖溶液配制)，采用紫外可見分光光度計在200～600 nm范圍內(nèi)掃描測定，記錄其紫外-可見吸收光譜。

1.2.4 RBP-CDs的形貌及結(jié)構(gòu)表征

透射電鏡測定：配制1 mg/mL的RBP-CDs水溶液，超聲分散均勻，滴加5～10 μL于碳膜上，自然晾干，于200 kV電壓下觀測樣品的微觀形態(tài)。

傅里葉紅外光譜(FTIR)分析：按質(zhì)量比1∶100將RBP-CDs與溴化鉀混合，研磨均勻，壓片后于傅里葉紅外光譜儀測定，波數(shù)掃描范圍4 000～400 cm-1，掃描次數(shù)32次，分辨率4 cm-1。

1.2.5 RBP-CDs的穩(wěn)定性分析

pH的影響：配制一定濃度的RBP-CDs溶液，取2 mL pH 2～12的50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液加入200 μL RBP-CDs溶液，期間采用HCl和NaOH調(diào)節(jié)pH，使RBP-CDs最終質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，于激發(fā)波長334 nm、發(fā)射波長415 nm處測定其熒光強(qiáng)度(F)，以2 mL pH 7.4 Tris-HCl緩沖溶液加200 μL RBP-CDs為空白，測定熒光強(qiáng)度(F0)，計算F/F0，考察pH對RBP-CDs穩(wěn)定性的影響。

鹽濃度的影響：向50 mmol/L pH 7.34的Tris-HCl緩沖溶液中添加NaCl，使其濃度范圍為0～2.0 mol/L，加入RBP-CDs粉末使其質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，于激發(fā)波長334 nm、發(fā)射波長415 nm處測定其熒光強(qiáng)度(F)，以未添加NaCl的RBP-CDs溶液為空白，測定熒光強(qiáng)度(F0)，計算F/F0，考察鹽濃度對RBP-CDs穩(wěn)定性的影響。

光學(xué)穩(wěn)定性：紫外燈(波長為365 nm)距離0.2 mg/mL RBP-CDs溶液(以50 mmol/L pH 7.4的Tris-HCl緩沖溶液配制)5 cm處持續(xù)照射0～120 min，于激發(fā)波長334 nm、發(fā)射波長415 nm處測定其熒光強(qiáng)度(F)，以未紫外燈照射(0 min)為空白，測定熒光強(qiáng)度(F0)，計算F/F0，考察紫外光照射時間對RBP-CDs光學(xué)穩(wěn)定性的影響。

化學(xué)穩(wěn)定性：使用多種不同溶劑配制RBP-CDs溶液，使其質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，于激發(fā)波長334 nm處測定其熒光發(fā)射光譜，考察溶劑對RBP-CDs穩(wěn)定性的影響。

1.2.6 RBP-CDs的應(yīng)用評價

1.2.6.1 陰、陽離子猝滅實驗

取2.5 mL 50 mmol/L pH 7.4的Tris-HCl緩沖溶液，加入250 μL 0.2 mg/mL RBP-CDs溶液，然后分別添加10 μL不同陰、陽離子溶液(0.1 mol/L)，混勻后在激發(fā)波長334 nm、發(fā)射波長415 nm處測定其熒光強(qiáng)度。以未加離子的RBP-CDs的Tris-HCl緩沖溶液為空白，計算加入相應(yīng)離子時體系的熒光強(qiáng)度(F)與未加離子的熒光強(qiáng)度(F0)比值(F/F0)。

1.2.6.2 Fe3+的傳感測定

按1.2.6.1的方法操作，調(diào)節(jié)Fe3+濃度范圍為0.05～400 μmol/L，記錄其熒光發(fā)射光譜(激發(fā)波長334 nm)，并作相關(guān)統(tǒng)計分析，考察碳量子點(diǎn)對Fe3+的靈敏度、準(zhǔn)確度。

1.2.6.3 細(xì)胞毒性實驗

采用CCK-8試劑盒測定RBP-CDs對人肝癌細(xì)胞(HepG-2)的毒性。將HepG-2接種到96孔板(每孔1 000個細(xì)胞)中，每孔100 μL的HepG-2細(xì)胞懸浮液，將培養(yǎng)板于37℃培養(yǎng)箱(5% CO2)中孵育24 h。向培養(yǎng)板中加入10 μL不同質(zhì)量濃度(0、50、100、200、400、800 μg/mL)的RBP-CDs溶液(以無菌去離子水配制)，孵育一段時間后加入10 μL CCK-8溶液，孵育3 h，酶標(biāo)儀測定吸光度(測定波長450 nm)。按下式計算細(xì)胞存活率(R)。

R=(As-Ab)/(Ac-Ab)×100%

(1)

式中：As為實驗孔吸光度(含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、待測物質(zhì))；Ac為對照孔吸光度(含有細(xì)胞的培養(yǎng)基、CCK-8、無待測物質(zhì))；Ab為空白孔吸光度(不含細(xì)胞和待測物質(zhì)的培養(yǎng)基、CCK-8)。

1.2.6.4 細(xì)胞成像實驗

取RBP-CDs，以無菌去離子水配制質(zhì)量濃度1.0 mg/mL的溶液并緩慢加入到含HepG-2細(xì)胞的培養(yǎng)基中，使RBP-CDs最終質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，孵育40 min后于1 200 r/min離心10 min，棄去上清液，用50 mmol/L pH 7.4 Tris-HCl緩沖溶液清洗3次，置于玻片上用于成像。

細(xì)胞成像通過FV1200激光共聚焦顯微掃描鏡測定，分別在405、488、543 nm處激發(fā)，收集藍(lán)、綠、紅色發(fā)射光譜帶。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用Origin 8.5繪圖軟件進(jìn)行處理，碳量子點(diǎn)的粒徑采用Nano Measure軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同米糠原料水熱合成法制備的碳量子點(diǎn)的熒光強(qiáng)度對比

分別以過0.25 mm(60目)篩的米糠、脫脂米糠、脫脂脫蛋白米糠、米糠蛋白為原料，按1.2.2方法制備碳量子點(diǎn)，按照1.2.3方法進(jìn)行熒光光譜掃描，結(jié)果如圖1所示。由圖1可看出，相同條件下，RBP-CDs的熒光強(qiáng)度大大強(qiáng)于過0.25 mm(60目)篩的米糠、脫脂米糠、脫脂脫蛋白米糠碳量子點(diǎn)，因此本文采用米糠蛋白為原料制備高熒光碳量子點(diǎn)，同時測得其量子化產(chǎn)率為3.76%，元素組成中C、N、O原子質(zhì)量比為70∶10∶18。

2.2 RBP-CDs的熒光光譜及紫外-可見吸收光譜

圖2為不同激發(fā)波長下RBP-CDs的熒光發(fā)射光譜。

圖2 不同激發(fā)波長下RBP-CDs的熒光發(fā)射光譜

由圖2可看出：隨著激發(fā)波長從310 nm增加至500 nm時，RBP-CDs熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)先升后降的趨勢，激發(fā)波長330 nm時熒光強(qiáng)度達(dá)到最大值；發(fā)射峰位置由400 nm逐漸紅移至550 nm，顯示RBP-CDs 具有明顯熒光激發(fā)依賴性，這可能與碳量子點(diǎn)的尺寸效應(yīng)與不同表面發(fā)射缺陷態(tài)的廣泛分布有關(guān)[16]。

圖3 RBP-CDs的紫外-可見吸收光譜

2.3 RBP-CDs的表征

2.3.1 透射電鏡

圖4為RBP-CDs的透射電鏡圖。

圖4 RBP-CDs的透射電鏡圖

由圖4可看出，RBP-CDs粒子數(shù)目較多且分散性較好，尺寸大小較均一，形狀呈類球形。利用Nano Measure軟件對RBP-CDs的粒徑進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)RBP-CDs顆粒大部分集中在2～4 nm，計算得到RBP-CDs顆粒的平均粒徑為(3.44±0.22)nm，粒徑分布圖大致呈正態(tài)分布(見圖5)。

圖5 RBP-CDs的粒徑分布圖

2.3.2 FTIR

通過FTIR對RBP-CDs的表面官能團(tuán)進(jìn)行表征，結(jié)果見圖6。

圖6 RBP-CDs的FTIR譜圖

2.4 RBP-CDs的穩(wěn)定性

圖7為pH、鹽濃度、紫外光照射時間、溶劑對RBP-CDs熒光的影響。

由圖7(A)可看出，在pH 4～10時，F(xiàn)/F0穩(wěn)定，說明此pH范圍內(nèi)RBP-CDs的熒光強(qiáng)度相對穩(wěn)定，而在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿的條件下，RBP-CDs熒光強(qiáng)度明顯下降。由圖7(B)可看出，RBP-CDs在不同濃度的NaCl溶液中，F(xiàn)/F0變化不大，說明不同鹽濃度下，RBP-CDs可保持較好的熒光穩(wěn)定性。由圖7(C)可看出，在波長為365 nm紫外燈連續(xù)照射120 min條件下，RBP-CDs的F/F0變化不大，說明RBP-CDs的光學(xué)穩(wěn)定性較好。由圖7(D)可看出：在DMF、DMSO、甲醇、無水乙醇的化學(xué)環(huán)境中，RBP-CDs的熒光強(qiáng)度有所增強(qiáng)；在異丙醇、乙醚、丙酮、正己烷、乙腈、二氯甲烷環(huán)境中，RBP-CDs的熒光強(qiáng)度下降幅度較大。表明有的化學(xué)環(huán)境能增加RBP-CDs的表面缺陷態(tài)，使RBP-CDs能夠保持其優(yōu)秀的熒光特性；有的則能破壞RBP-CDs表面缺陷態(tài)使其熒光強(qiáng)度降低。

2.5 RBP-CDs的應(yīng)用

2.5.1 陰、陽離子對RBP-CDs的猝滅效果

按照1.2.6.1方法測定多種不同陰、陽離子對RBP-CDs的猝滅效應(yīng)，結(jié)果如圖8所示。

由圖8可看出：陰離子對RBP-CDs的熒光強(qiáng)度基本均無影響；而部分陽離子對RBP-CDs有猝滅效果，如Cu2+、Ti2+、Fe3+等，其中Fe3+的猝滅效果尤其顯著，猝滅率可達(dá)73.8%，呈現(xiàn)較強(qiáng)選擇性，這種現(xiàn)象與大多數(shù)以生物質(zhì)碳源碳量子點(diǎn)具有相似性，其原因可能是Fe3+與RBP-CDs表面的羥基、氨基、羧基發(fā)生相互作用，改變了RBP-CDs表面態(tài)的缺陷結(jié)構(gòu)及電子轉(zhuǎn)移進(jìn)程，從而導(dǎo)致動態(tài)猝滅過程的出現(xiàn)。

2.5.2 對Fe3+的傳感

基于Fe3+對RBP-CDs的顯著猝滅效果與良好選擇性，按1.2.6.2方法對RBP-CDs作為“Turn-Off”型熒光傳感器測定Fe3+的效果進(jìn)行了評價，結(jié)果分別見圖9、圖10。

圖9 不同濃度Fe3+的RBP-CDs的熒光發(fā)射譜圖

圖10 F/F0和Fe3+濃度之間的關(guān)系

由圖9、圖10可看出，隨著Fe3+濃度的增加，RBP-CDs在最大發(fā)射波長415 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸降低，并且體系中Fe3+濃度在50～300 μmol/L范圍內(nèi)，F(xiàn)/F0(y)與Fe3+濃度(x)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=-0.001 4x+0.756 8,R2為0.990 6，檢出限為15.2 nmol/L(S/N=3)。由此可見，RBP-CDs可以作為熒光探針對Fe3+進(jìn)行高靈敏的傳感檢測分析。

2.5.3 細(xì)胞毒性及成像

2.5.3.1 細(xì)胞毒性

為了探索RBP-CDs在細(xì)胞成像和傳感領(lǐng)域中的應(yīng)用潛力，通常需要評估其是否具有光學(xué)優(yōu)點(diǎn)及低細(xì)胞毒性[17]。按1.2.6.3方法測定了RBP-CDs對HepG-2的毒性，結(jié)果如圖11所示。

圖11 RBP-CDs對HepG-2細(xì)胞的毒性效應(yīng)

由圖11可看出：隨著RBP-CDs質(zhì)量濃度的升高，細(xì)胞存活率緩慢降低，在RBP-CDs質(zhì)量濃度為200 μg/mL時，細(xì)胞存活率為93.6%；RBP-CDs質(zhì)量濃度高達(dá)800 μg/mL時，細(xì)胞存活率仍可達(dá)到88.5%?？梢姡琑BP-CDs的細(xì)胞毒性非常低，具有良好的生物親和性，可以安全應(yīng)用于細(xì)胞標(biāo)記與細(xì)胞成像領(lǐng)域中。

2.5.3.2 細(xì)胞成像

按1.2.6.4方法，采用0.2 mg/mL(兼顧毒性、染色效果與成本)的RBP-CDs溶液對HepG-2細(xì)胞孵育進(jìn)行細(xì)胞成像實驗，使用激光共聚焦顯微掃描鏡對細(xì)胞進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖12所示。

注：(A)405 nm，藍(lán)色熒光；(B)488 nm，綠色熒光；(C)543 nm，紅色熒光；(D)明場。

由圖12可看出，與未標(biāo)記的HepG-2細(xì)胞(明場)比較，以RBP-CDs標(biāo)記的HepG-2細(xì)胞通過不同波長的激光進(jìn)行激發(fā)，呈現(xiàn)明亮的多色熒光，細(xì)胞狀態(tài)良好，且熒光主要分布于細(xì)胞膜、細(xì)胞核區(qū)域，說明RBP-CDs具有良好的細(xì)胞通透性、生物相容性。

3 結(jié) 論

本文以米糠蛋白為碳源，采用水熱合成法制備強(qiáng)熒光、水溶性良好的熒光碳量子點(diǎn)(RBP-CDs)，原料資源豐富、低廉易得，操作過程簡便、綠色環(huán)保。通過紫外、熒光、TEM、FTIR對RBP-CDs的光學(xué)特性及結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，制備的RBP-CDs分散性較好，粒徑主要集中在2～4 nm，平均粒徑為3.44 nm；其表面富含羥基、羧基等親水基團(tuán)，碳量子點(diǎn)水溶性良好。將RBP-CDs置于不同pH、NaCl濃度、紫外光照射時間以及不同化學(xué)環(huán)境中，發(fā)現(xiàn)RBP-CDs在pH 4～10、不同濃度的鹽環(huán)境中，其熒光性能良好；而不同化學(xué)環(huán)境其熒光強(qiáng)度差別較大，主要是與其表面缺陷態(tài)有關(guān)；在365 nm紫外燈長時間照射下，RBP-CDs表現(xiàn)出良好的光學(xué)穩(wěn)定性。通過陰、陽離子的猝滅實驗發(fā)現(xiàn)Fe3+對RBP-CDs的熒光猝滅效果較好；Fe3+濃度在50～300 μmol/L時，RBP-CDs熒光強(qiáng)度與Fe3+濃度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，表明RBP-CDs對Fe3+的熒光傳感有較高靈敏度；細(xì)胞毒性實驗發(fā)現(xiàn)RBP-CDs細(xì)胞毒性較低，將其用于HepG-2細(xì)胞染色，發(fā)現(xiàn)其對細(xì)胞的染色效果較好，細(xì)胞狀態(tài)良好，表明其具備良好的生物相容性。基于RBP-CDs上述優(yōu)良特點(diǎn)，其在熒光染料、細(xì)胞成像等領(lǐng)域的應(yīng)用前景廣闊。