劉國(guó)艷，李思童，梁 麗，朱雯綺，周婉麗，徐 鑫

(揚(yáng)州大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009)

油茶籽油被譽(yù)為“東方橄欖油”，具有較高的氧化穩(wěn)定性，酚類化合物作為其中重要的抗氧化成分，具有清除自由基、延緩油脂自氧化及抑制氧化產(chǎn)物生成的作用[1-2]。根據(jù)與基質(zhì)中其他物質(zhì)結(jié)合與否，酚類化合物分為游離酚(free phenolics，F(xiàn)P)與結(jié)合酚(bound phenolics，BP)，而根據(jù)結(jié)合對(duì)象或價(jià)鍵不同，BP分為酯化酚(esterified phenolics，EP)及不溶性結(jié)合酚(insoluble-bound phenolics，ISP)，其中EP又稱為可溶性結(jié)合酚[3-4]。酚類化合物的抗氧化活性與其形態(tài)相關(guān)，但目前的研究大多集中在非油脂體系的化學(xué)抗氧化性的考察，而對(duì)油脂體系中的研究較少。Thiyam等[5]研究表明，油菜籽中芥子酸及FP表現(xiàn)出較高的抗氧化性，BP與總酚則因芥子堿的存在表現(xiàn)出一定的促油脂氧化作用；裘芳成等[6]研究發(fā)現(xiàn)，山茶油中糖苷態(tài)酚類化合物具有較強(qiáng)的抗氧化能力，其次為ISP、EP及FP；Alu’Datt等[7]研究發(fā)現(xiàn)，不同油料中FP及ISP的抗氧化能力排序不同。因此，有必要研究油茶籽油不同形態(tài)酚類化合物對(duì)油脂氧化穩(wěn)定性的影響。另外，油茶籽油中酚類化合物組成復(fù)雜，其成分間常存在互作關(guān)系，如相加、協(xié)同及拮抗作用等，從而影響油脂的氧化穩(wěn)定性[8-9]。因此，對(duì)油茶籽油酚類化合物進(jìn)行形態(tài)區(qū)分，基于不同形態(tài)研究其抗氧化性及其互作關(guān)系具有重要意義。

含水有機(jī)溶劑會(huì)破壞酚類化合物分子間的氫鍵，有利于酚類化合物的溶出[10]，故本文采用60%甲醇對(duì)油茶籽油FP進(jìn)行提取。BP以共軛或價(jià)鍵形式與基質(zhì)中其他物質(zhì)結(jié)合，需經(jīng)堿解或酸解釋放后提取，而堿解條件下酚類化合物損失較小[11]，故本文采用堿解方式對(duì)油茶籽油ISP進(jìn)行提取。在優(yōu)化FP、EP及ISP提取工藝基礎(chǔ)上，本文采用Schaal烘箱法，模擬油茶籽油自身所含F(xiàn)P、EP及ISP在加速氧化過程中對(duì)油茶籽油氧化穩(wěn)定性的影響，同時(shí)對(duì)其互作關(guān)系進(jìn)行探究，為闡明酚類化合物的抗氧化機(jī)理及利用其協(xié)同增效作用延緩脂質(zhì)氧化提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

長(zhǎng)林系列油茶籽，購(gòu)于江西，經(jīng)烘干、脫殼及粉碎后備用；油茶籽油，冷榨法提取(自制)。甲醇、無(wú)水碳酸鈉、氫氧化鈉、乙酸乙酯、福林酚、冰乙酸、氯仿，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；沒食子酸，阿拉丁試劑有限公司。

PHG-9070電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司；DF-15連續(xù)投料粉碎機(jī)，溫嶺市林大機(jī)械有限公司；QYZ-230型自動(dòng)液壓榨油機(jī)，山東省泰安市良君益友機(jī)械有限公司；SHJ-A6數(shù)顯恒溫?cái)嚢杷″?，上海比朗儀器有限公司；SHB-III真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；RV-10 Basic旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國(guó)IKA公司；UV1000紫外分光光度計(jì)，上海天美科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 油茶籽油不同形態(tài)酚類化合物的提取

參考Ayoub[12]、Kang[13]等的方法提取油茶籽油不同形態(tài)酚類化合物。

FP提取：稱取5 g油茶籽油，按照料液比1∶10加入60%甲醇，常溫(25℃)下提取1 h后離心(8 000 r/min，5 min)，沉淀重復(fù)提取3次，合并上清液(甲醇層)，于40℃下真空濃縮后按照體積比1∶1加入乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯層，于40℃下真空蒸干，用甲醇溶解獲得FP提取液。

ISP提?。合蛱崛P后的沉淀中按照體積比1∶1 加入0.2 mol/L NaOH溶液，于50℃下避光堿解6 h后調(diào)節(jié)pH至2，離心(8 000 r/min,5 min)分離，向水相(下層)中按照體積比1∶1加入乙酸乙酯重復(fù)萃取3次，合并乙酸乙酯層，于40℃下真空蒸干，用甲醇溶解獲得ISP提取液。

EP提?。合騀P提取過程中乙酸乙酯萃取后的殘余水相中按照體積比1∶1加入0.2 mol/L NaOH溶液，于50℃下避光堿解6 h，調(diào)節(jié)堿解液pH至2后，按照體積比1∶1加入乙酸乙酯重復(fù)萃取3次，合并乙酸乙酯層，于40℃下真空蒸干，用甲醇溶解獲得EP提取液。

1.2.2 酚類化合物含量測(cè)定

采用Folin-Ciocalteu法[14]，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定各酚類化合物提取液中酚類化合物含量，最終換算為油茶籽油中酚類化合物含量。

1.2.3 油茶籽油不同形態(tài)酚類化合物對(duì)油脂氧化穩(wěn)定性的影響及其互作關(guān)系研究

1.2.3.1 油樣制備及加速氧化

將FP、EP及ISP提取液?jiǎn)为?dú)、兩兩或三種復(fù)配，按照油茶籽油原本酚類化合物含量添加至提取總酚后的空白油茶籽油中，氮吹除去甲醇后渦旋混勻。將適量油樣置于敞口燒杯中，采用Schaal烘箱法于(63±1)℃黑暗烘箱中加速氧化1個(gè)月，期間每3 d取樣測(cè)定過氧化值、酸值和茴香胺值。其中過氧化值的測(cè)定參照GB 5009.227—2016，茴香胺值的測(cè)定參照GB/T 24304—2009，酸值的測(cè)定參照GB 5009.229—2016。

1.2.3.2 不同形態(tài)酚類化合物互作關(guān)系分析

參考Marinova等[9]的方法，根據(jù)一、二級(jí)氧化產(chǎn)物的生成情況，作圖確定各油樣的誘導(dǎo)期。根據(jù)各樣品誘導(dǎo)期計(jì)算穩(wěn)定系數(shù)和協(xié)同價(jià)(見式(1)和式(2))，以分析不同形態(tài)酚類化合物對(duì)油脂氧化穩(wěn)定性的影響及其互作關(guān)系。

(1)

(2)

式中：F為穩(wěn)定系數(shù)；Iinh為添加酚類化合物的油樣的誘導(dǎo)期；I0為空白油樣的誘導(dǎo)期；Imix為添加混合酚類化合物的油樣的誘導(dǎo)期；Ii為添加第i種酚類化合物油樣的誘導(dǎo)期；S為不同形態(tài)酚類化合物的協(xié)同價(jià)，S<0表示拮抗作用，數(shù)值越小，拮抗作用越強(qiáng)；S>0表示協(xié)同作用，數(shù)值越大，協(xié)同作用越強(qiáng)。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)中所有測(cè)試均重復(fù)進(jìn)行3次，結(jié)果采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示。使用Origin軟件繪圖，SPSS 19.0軟件進(jìn)行方差及顯著性差異分析，顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶籽油不同形態(tài)酚類化合物提取工藝優(yōu)化

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)

采用單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)FP、EP和ISP提取條件進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，選擇一個(gè)變量，其他提取條件參照1.2.1。不同提取因素對(duì)FP、ISP和EP提取的影響分別見圖1、圖2和圖3。

由圖1可見，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)、料液比增加及提取溫度的升高，F(xiàn)P含量呈先上升后下降趨勢(shì)。隨著料液比增加，雜質(zhì)大量溶出，影響FP分離；而提取時(shí)間過長(zhǎng)或提取溫度過高會(huì)使FP發(fā)生降解，造成FP含量下降[15-16]；隨著提取次數(shù)的增加，F(xiàn)P含量逐漸升高并在3次后趨于平緩(p>0.05)。

注：提取次數(shù)單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，提取條件A、B、C、D、E分別代表提取1、2、3、4、5次；料液比單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，提取條件A、B、C、D、E分別代表料液比為1∶25、1∶20、1∶15、1∶10、1∶5；提取時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，提取條件A、B、C、D、E分別代表提取時(shí)間為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h；提取溫度單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，提取條件A、B、C、D、E分別代表提取溫度為25、35、45、55、65℃。柱狀圖上不同字母表示相同單因素條件下具有顯著差異，下同。

由圖2可見，隨著堿解溫度升高、堿解時(shí)間延長(zhǎng)、料液比及NaOH濃度的增加，ISP含量呈先增加后降低的趨勢(shì)。較短的堿解時(shí)間及較低的堿解溫度會(huì)使ISP溶出不完全，但堿解時(shí)間過長(zhǎng)、堿解溫度過高及溶劑量過大會(huì)導(dǎo)致酚類化合物氧化分解或雜質(zhì)溶出影響其分離[15-16]；另外，堿解會(huì)破壞酯鍵釋放出與酯類化合物結(jié)合的酚類化合物，但NaOH濃度過高會(huì)使酚羥基發(fā)生電離，造成ISP的損失[10]。

注：堿解溫度單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，提取條件A、B、C、D、E分別代表堿解溫度為25、35、45、55、65℃；料液比單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，提取條件A、B、C、D、E分別代表料液比為1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1；NaOH濃度單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，提取條件A、B、C、D、E分別代表NaOH濃度為0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mol/L；堿解時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，提取條件A、B、C、D、E分別代表堿解時(shí)間為4、6、8、10、12 h。

由圖3可見，隨著堿解液與乙酸乙酯體積比及萃取次數(shù)的增加，EP含量先逐漸增加后趨于平緩(p>0.05)。綜合考慮，選擇堿解液與乙酸乙酯體積比為1∶1，萃取次數(shù)為3次。在此條件下，EP含量為(28.67±1.51)mg/kg。

注：萃取次數(shù)單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，提取條件A、B、C、D、E分別代表乙酸乙酯萃取1、2、3、4、5次；料液比單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，提取條件A、B、C、D、E分別代表料液比(堿解液與乙酸乙酯體積比)為1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1。

2.1.2 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)FP和ISP的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。FP和ISP的正交實(shí)驗(yàn)因素水平分別見表1和表2，正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3。

表1 FP正交實(shí)驗(yàn)因素水平

表2 ISP正交實(shí)驗(yàn)因素水平

表3 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

續(xù)表3

由表3可見：4個(gè)因素對(duì)FP含量影響的主次順序?yàn)樘崛囟?提取時(shí)間>提取次數(shù)>料液比，F(xiàn)P最優(yōu)提取工藝條件為A2B3C3D2，即料液比1∶15、提取時(shí)間1.5 h、提取溫度45℃、提取次數(shù)3次；4個(gè)因素對(duì)ISP含量影響的主次順序?yàn)镹aOH濃度>堿解時(shí)間> 堿解溫度>料液比，ISP最優(yōu)提取工藝條件為A3B3C3D1，即堿解溫度45℃、料液比1∶3、NaOH濃度0.25 mol/L、堿解時(shí)間6 h。在最優(yōu)提取工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，油茶籽油中FP及ISP含量分別為(43.43±2.05)mg/kg及(65.87±1.34)mg/kg。

2.2 添加不同形態(tài)酚類化合物油茶籽油的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性及其互作關(guān)系

2.2.1 添加不同形態(tài)酚類化合物油茶籽油的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性

油脂氧化的主要底物為不飽和脂肪酸，在氧氣或高溫條件下氧化形成氫過氧化物(一級(jí)氧化產(chǎn)物)，過氧化值是反映初級(jí)氧化產(chǎn)物生成量的重要指標(biāo)[17-18]。氫過氧化物穩(wěn)定性較差，氧化過程中分解產(chǎn)生大量二級(jí)氧化產(chǎn)物，而茴香胺值用于檢測(cè)動(dòng)植物油脂中的所有醛類，使用茴香胺值可以反映各油樣二級(jí)氧化產(chǎn)物生成情況[19-21]。酸值反映了各油樣中游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)含量，是油脂氧化過程中的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)之一，且FFA含量越高的油脂越容易氧化[22]。測(cè)定了添加不同形態(tài)酚類化合物的油樣在加速氧化過程中氧化指標(biāo)的變化情況，結(jié)果見圖4。

由圖4(A)可見，前期氧化速率較低，氫過氧化物生成量較少，過氧化值變化平緩，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，氧化速率增加，氫過氧化物生成量顯著增加，30 d 時(shí)各油樣的過氧化值均低于空白，說明不同形態(tài)酚類化合物均具有增強(qiáng)油脂氧化穩(wěn)定性的作用，其中EP+ISP表現(xiàn)出較高的抗氧化活性，其油樣的過氧化值較空白油樣下降了33.78%，而添加FP+EP+ISP及FP的油樣過氧化值較空白油樣分別下降了6.19%及2.55%，抗油脂氧化能力較差。另外，加速氧化結(jié)束后，各油樣過氧化值均超出GB 2716—2018規(guī)定的植物原油過氧化值小于等于0.25 g/100 g(約9.85 mmol/kg)。

由圖4(B)可見，加速氧化過程中茴香胺值與過氧化值呈現(xiàn)相似的變化趨勢(shì)，氧化初期氫過氧化物分解量較低，茴香胺值維持較平穩(wěn)狀態(tài)，隨著油脂氧化程度的加深，氫過氧化物大量分解產(chǎn)生二級(jí)氧化產(chǎn)物，茴香胺值表現(xiàn)出較高的增長(zhǎng)速率。另外，由于二級(jí)氧化產(chǎn)物是油脂酸敗過程中不良風(fēng)味的主要來(lái)源，在氧化末期可以明顯嗅到油脂酸敗的氣味。加速氧化結(jié)束后，各油樣的茴香胺值均低于空白油樣，其中添加EP+ISP油樣的茴香胺值較空白油樣降低了51.30%，油樣的氧化穩(wěn)定性較強(qiáng)；添加FP的油樣茴香胺值較空白油樣降低了23.01%，說明FP抗油脂氧化能力較差。

由圖4(C)可見，各油樣的酸值均隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，這是由于油脂的氧化酸敗會(huì)導(dǎo)致FFA的增加，而FFA的產(chǎn)生又對(duì)油脂氧化酸敗起促進(jìn)作用。加速氧化結(jié)束后，各油樣酸值均未超過GB 2716—2018規(guī)定的植物原油酸值(KOH)小于等于4 mg/g。其中，添加酚類化合物的油樣中，添加EP+ISP 油樣的酸值最低，較空白油樣降低了12.70%，而添加FP油樣的酸值最高，較空白僅降低了3.17%。

注：A.空白；B.FP；C.EP；D.ISP；E.FP+ISP；F.FP+EP；G.EP+ISP；H.FP+EP+ISP；I.對(duì)照(VE，添加量410 mg/kg)。

2.2.2 不同形態(tài)酚類化合物的互作關(guān)系

采用雙切線法計(jì)算各油樣的誘導(dǎo)期，并對(duì)各形態(tài)酚類化合物復(fù)配組的穩(wěn)定系數(shù)和協(xié)同價(jià)進(jìn)行計(jì)算，確定不同形態(tài)酚類化合物的互作關(guān)系，結(jié)果見表4。

表4 各油樣的氧化誘導(dǎo)期及不同形態(tài)酚類化合物的互作關(guān)系

由表4可見，結(jié)合酚(BP)的抗氧化性強(qiáng)于FP。這是因?yàn)橐环矫?，油脂氧化過程中，氫過氧化物分解形成大量自由基，抗氧化劑(酚類化合物)提供氫原子與氧自由基結(jié)合形成非自由基產(chǎn)物或更穩(wěn)定的抗氧化劑自由基，終止自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以達(dá)到延緩油脂氧化的作用，而體系中結(jié)合態(tài)酚類化合物除自身發(fā)揮抗氧化作用外，還可能通過FP轉(zhuǎn)移電子或氫原子與體系中抗氧化劑自由基結(jié)合實(shí)現(xiàn)再生，從而達(dá)到更長(zhǎng)效且顯著的抗油脂氧化能力[23]，如?elik等[24]研究發(fā)現(xiàn)麥麩中結(jié)合態(tài)阿魏酸可通過游離態(tài)酚類化合物實(shí)現(xiàn)再生，從而增強(qiáng)整體的抗氧化能力；另一方面，酚類化合物的活性基團(tuán)(如羥基)位置及數(shù)目影響其抗氧化能力，不同形態(tài)酚類化合物組成存在差異，其活性基團(tuán)的數(shù)量及排列也有所不同，進(jìn)而影響其電離勢(shì)或解離能，使其抗氧化活性存在差異[25]。

由表4還可看出，各酚類化合物復(fù)配后在油脂體系中均表現(xiàn)出不同程度的拮抗作用，其中FP+EP+ISP的拮抗作用最強(qiáng)。據(jù)報(bào)道，ISP主要與油脂中甘油酯結(jié)合存在，使其苯環(huán)鄰位或間位羥基以及碳碳雙鍵等活性基團(tuán)形成分子間氫鍵，同時(shí)降低其解離能及電離勢(shì)，發(fā)揮出更強(qiáng)的抗氧化能力，而本研究中ISP經(jīng)堿解破壞其結(jié)合狀態(tài)，使其抗氧化能力降低，可能是表現(xiàn)出拮抗作用的原因之一[26]；另外，本研究基于油茶籽油不同形態(tài)酚類化合物實(shí)際含量向空白油樣中反添加，與其他油樣相比，復(fù)配組分中酚類化合物濃度較高，其中FP+EP+ISP中酚類化合物濃度最高，體系中抗氧化劑濃度越高形成的自由基越多，而抗氧化劑自由基同樣可能參與自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，加速其氧化進(jìn)程，從而表現(xiàn)出一定的拮抗作用[27]。后續(xù)可深入探究不同形態(tài)酚類化合物具體物質(zhì)結(jié)構(gòu)對(duì)油脂氧化穩(wěn)定性的影響，進(jìn)一步揭示酚類化合物抗油脂氧化能力及其相互作用的差異及其原因。

穩(wěn)定系數(shù)表示酚類化合物及其混合物作用的有效性，穩(wěn)定系數(shù)越高表示其具有更穩(wěn)定的抗氧化能力，其中酚類化合物兩兩復(fù)配時(shí)具有最高的穩(wěn)定系數(shù)，而單一FP的穩(wěn)定系數(shù)最低。根據(jù)誘導(dǎo)期，添加EP+ISP的油樣氧化穩(wěn)定性最強(qiáng)。

3 結(jié) 論

采用單因素實(shí)驗(yàn)及正交實(shí)驗(yàn)得到不同形態(tài)酚類化合物的最優(yōu)提取工藝條件，其中：FP的最優(yōu)提取工藝條件為提取溫度45℃、提取時(shí)間1.5 h、提取次數(shù)3次、料液比1∶15；EP的最優(yōu)提取工藝條件為堿解液與乙酸乙酯體積比1∶1，萃取次數(shù)3次；ISP的最優(yōu)提取工藝條件為NaOH濃度0.25 mol/L、堿解時(shí)間6 h、堿解溫度45℃、料液比1∶3。在最優(yōu)提取工藝條件下，油茶籽油FP、EP及ISP含量分別為(43.43±2.05)mg/kg、(28.67±1.51)mg/kg及(65.87±1.34)mg/kg。利用Schaal烘箱法對(duì)不同形態(tài)酚類化合物單獨(dú)及復(fù)配條件下對(duì)油茶籽油氧化穩(wěn)定性的影響及其互作關(guān)系進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，不同形態(tài)酚類化合物單獨(dú)及復(fù)配使用時(shí)均具有抑制氧化產(chǎn)物生成，增強(qiáng)油脂氧化穩(wěn)定性的作用。另外，酚類化合物形態(tài)影響其復(fù)配條件下對(duì)油脂氧化穩(wěn)定性的影響，各互作組分在油脂體系中均呈拮抗作用，其中FP+EP+ISP拮抗作用最強(qiáng)。本文研究結(jié)果揭示了油茶籽油不同形態(tài)酚類化合物對(duì)油脂氧化穩(wěn)定性的影響，為發(fā)揮酚類化合物協(xié)同增效作用，增強(qiáng)油脂氧化穩(wěn)定性提供了理論依據(jù)。