王英特，張媛媛，王 昕，段 蓉，王云霞，Hai Woong Lee

（1.山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山西 太原 030006；2.山西綠膳源酒業(yè)有限公司，山西 太原 030063；3.韓國東義大學(xué)韓醫(yī)學(xué)科，韓國 釜山 47227）

引言

羥基自由基（·OH）被認(rèn)為是人體新陳代謝產(chǎn)生的活性最強(qiáng)的活性氧[1-2]，在體內(nèi)的半衰期約為9 s～10 s，具有極強(qiáng)的氧化能力。過量的·OH 能夠通過加成反應(yīng)、電子轉(zhuǎn)移、脫氫等多種方式與生物體內(nèi)的分子發(fā)生相互作用致使脂類、核酸等物質(zhì)發(fā)生氧化性損傷[3-4]，同時(shí)也會(huì)引發(fā)蛋白質(zhì)變性、酶失去活性[5-6]，最終導(dǎo)致機(jī)體衰老或者引起腫瘤、糖尿病[7]等諸多疾病的發(fā)生。·OH 清除劑能抑制·OH 產(chǎn)生的損傷，維持機(jī)體正常的生命代謝。有效的·OH 清除劑對于阻止生命體病變、衰老等具有實(shí)際意義[8-9]。

保健酒中通常含有來源于植物和中草藥提供的抗氧化劑，能夠阻止氧化反應(yīng)的發(fā)生（干擾鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、氧自由基初始反應(yīng)），有效清除機(jī)體內(nèi)·OH[10]，致使保健酒清除自由基功效日益被重視[11-12]。鐘文武、普貴宏等[13]對自制紅葡萄保健酒抗氧化活性進(jìn)行測定，結(jié)果表明，對1，1-二苯基-2-苦肼（DPPH）自由基清除率為54.41%，·OH 清除率為67.31%，說明自制紅葡萄酒有一定的抗氧化活性。由此可見，選取有效的抗氧化能力強(qiáng)的中草藥是提高保健酒·OH 清除率的重要環(huán)節(jié)。山西是我國傳統(tǒng)的中藥材主產(chǎn)區(qū)，道地藥材大約30 余種，其中，黃芪、黨參、遠(yuǎn)志、連翹是4 種具有代表性的藥食同源中藥材。系統(tǒng)地研究山西藥食同源道地藥材的·OH 清除功能，可為道地藥材用于提高保健酒的·OH 清除效果提供理論依據(jù)，為藥食同源中藥材在保健酒領(lǐng)域的應(yīng)用提供具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的指導(dǎo)[14]。

本文以羅丹明B（RB）為顯色劑[15]，由Fenton 體系（Fe2+-H2O2）產(chǎn)生的·OH，可以迅速氧化RB 溶液使其褪色，利用紫外-可見分光光度法測定溶液在554nm處吸光度的變化，可確定·OH 的產(chǎn)生量；保健酒可以消除溶液中的·OH，從而使溶液的吸光度下降程度減弱；保健酒加入體系前后吸光度的差值（ΔA）與保健酒對·OH 的清除率成正比，據(jù)此建立了一種測定保健酒·OH 清除率的方法。實(shí)驗(yàn)從4 種藥食同源的山西道地藥材（黃芪、黨參、遠(yuǎn)志、連翹）中優(yōu)選·OH 清除率高的藥材，以太原市非物質(zhì)文化遺產(chǎn)黃米白酒為基酒，炮制功能保健酒。結(jié)果表明，中藥和酒的協(xié)同效應(yīng)更有助于提升保健酒對人體內(nèi)·OH清除功能，從而使保健酒的抗氧化性更具優(yōu)勢[16-17]。本研究可為開拓現(xiàn)代食藥用途、開發(fā)功能性保健酒提供理論和技術(shù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

紫外-可見分光光度計(jì)，UV-2450，島津公司；電子分析天平。

過氧化氫（H2O2）；羅丹明B（C28H31ClN2O3）；硫酸亞鐵（FeSO4·7H2O）；抗壞血酸（C6H8O6）；稀硫酸（H2SO4）；黃米白酒基酒，35%（體積分?jǐn)?shù)），山西綠膳源酒業(yè)有限公司提供；中藥（黨參、黃芪、連翹、遠(yuǎn)志等），同仁堂藥店購買；實(shí)驗(yàn)用水均為去離子水。

1.2 試劑的制備

1.2.1 H2O2 溶液的配制

按“GB 1616—1988 H2O2含量的測定”標(biāo)定市售體積分?jǐn)?shù)為30%的H2O2溶液。準(zhǔn)確移取H2O2溶液27 μL 于25.00 mL 容量瓶中，加入去離子水定容至刻度，得到1.05×10-2mol/L H2O2溶液。

1.2.2 Fe2+溶液的配制

準(zhǔn)確稱取FeSO4·7H2O 0.073 g 于小燒杯中，加入適量去離子水溶解，并加入一定量的0.5 mol/L 稀H2SO4溶液，轉(zhuǎn)移至25.00 mL 容量瓶中，以去離子水定容至刻度，得到濃度為1.05×10-2mol/L 的FeSO4溶液。

1.2.3 RB 溶液的配制

準(zhǔn)確稱取RB 0.012 g 于小燒杯中，加入適量去離子水溶解，轉(zhuǎn)移至250.00 mL 容量瓶中，以去離子水定容至刻度，得到濃度為1.00×10-4mol/L RB 儲(chǔ)備液；準(zhǔn)確移取儲(chǔ)備液1.75 mL 于25.00 mL 容量瓶中，以去離子水定容至刻度，得到濃度為7.00×10-6mol/L RB 工作溶液。

1.2.4 抗壞血酸溶液的配制

準(zhǔn)確稱取抗壞血酸0.092 g 于小燒杯中，加入適量去離子水溶解，轉(zhuǎn)移至25.00 mL 容量瓶中，以去離子水定容至刻度，得到濃度為2.00×10-2mol/L 抗壞血酸溶液。

1.2.5 中藥水提液制備

選取黨參、黃芪、連翹、遠(yuǎn)志4 種中草藥，清洗晾干，然后將其粉碎過篩。稱取上述藥材1.0 g，加入20.00 mL 蒸餾水，水浴加熱0.5 h，趁熱過濾，得到4種中藥的水提取液進(jìn)行測定。

1.2.6 黨參、黃芪保健酒制備

稱取5.0 g 粉末狀黨參、黃芪中藥藥材于燒杯中，加入50.0 mL 黃米白酒，攪拌均勻，轉(zhuǎn)入封口瓶中炮制30 d 后，過濾，分別得到黨參、黃芪保健酒。

1.3 ·OH 反應(yīng)機(jī)理及清除率的計(jì)算

根據(jù)Fenton 反應(yīng)[18]，H2O2為氧化劑，以Fe2+為催化劑的氧化法，其反應(yīng)機(jī)理如式（1）～式（4）。

通過Fenton 反應(yīng)產(chǎn)生的·OH 能夠迅速氧化RB溶液，使體系的吸光度降為A；抗氧化劑具有清除·OH 能力，體系的吸光度降低程度減弱為As；空白溶液RB 顯色劑吸光度為Ao，則·OH 清除率計(jì)算公式[19]如式（1）。

1.4 樣品測定

1.4.1 最大吸收波長的選取

移取3.0 mL RB 溶液（7.00×10-6mol/L）于紫外杯中，在450 nm～600 nm 內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，記錄體系的紫外吸收光譜，確定其最大吸收波長為554 nm，該吸收峰記錄為體系的空白吸收峰，此時(shí)的最大吸光度為Ao。

1.4.2 ·OH 的測定

移取3.0 mL RB 溶液（7.00×10-6mol/L）、20 μL Fe2+溶液（1.05×10-2mol/L）、20 μL H2O2溶液（1.05×10-2mol/L）于紫外杯中，在450 nm～600 nm內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，記錄反應(yīng)體系的紫外吸收光譜，此時(shí)的最大吸光度為A。

1.4.3 ·OH 清除率的測定

由于·OH 在體系中存在的時(shí)間較短，為充分保證Fenton 體系產(chǎn)生的·OH 能夠及時(shí)與RB 及抗氧化劑發(fā)生反應(yīng)，故·OH 清除率的測定實(shí)驗(yàn)中試劑加入順序依次為：RB→Fe2+→抗氧化劑→H2O2。

1.4.3.1 抗壞血酸（對照）

移取3.0 mL RB 溶液（7.00×10-6mol/L）、20 μL Fe2+溶液（1.05×10-2mol/L）、32 μL 抗壞血酸溶液（2.10×10-2mol/L）、20 μLH2O2溶液（1.05×10-2mol/L）于紫外杯中，在450 nm～600 nm 內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，記錄紫外吸收光譜，利用此時(shí)的最大吸光度為As，根據(jù)公式（1）可計(jì)算抗壞血酸的·OH 清除率。

1.4.3.2 中藥水提液

移取3.0 mL RB 溶液（7.00×10-6mol/L）、20 μL Fe2+溶液（1.05×10-2mol/L）、5.0 μL 中藥水提液（黨參、黃芪、連翹、遠(yuǎn)志）、20 μL H2O2溶液（1.05×10-2mol/L）于紫外杯中，在450 nm～600 nm 內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，記錄紫外吸收光譜，利用此時(shí)的最大吸光度為As，根據(jù)公式（1）可計(jì)算中藥水提液的·OH 清除率。

1.4.3.3 保健酒

移取3.00 mL RB 溶液（7.00×10-6mol/L）、20 μL Fe2+溶液（1.05×10-2mol/L）、5.0 μL 已稀釋10 倍的保健酒、20 μL H2O2溶液（1.05×10-2mol/L）于紫外杯中，在450 nm～600 nm 內(nèi)進(jìn)行光譜掃描，記錄紫外吸收光譜，利用此時(shí)的最大吸光度為As，根據(jù)公式（1）可計(jì)算保健酒的·OH 清除率。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.1.1 pH 值的影響

Fenton 反應(yīng)在H2SO4介質(zhì)中進(jìn)行。如前所述，由Fenton 體系（Fe2+-H2O2）產(chǎn)生的·OH，可以迅速氧化RB 溶液使其褪色，為了探究pH 值對體系褪色的影響，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH 值依次為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，測定不同pH 值下體系吸光度變化值ΔA（ΔA=Ao-A）。如第11 頁圖1 所示，在體系的pH 值為4 時(shí)，ΔA 值有最大值，信號(hào)最強(qiáng)，說明·OH 在此條件下產(chǎn)生量最大。因此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置H2SO4溶液pH 為4 進(jìn)行后續(xù)測試。

圖1 pH 值對反應(yīng)體系的影響

2.1.2 Fe2+和H2O2 用量的影響

Fe2+和H2O2的用量直接影響到·OH 的產(chǎn)生，根據(jù)Fe2+和H2O2化學(xué)計(jì)量反應(yīng)方程式，設(shè)置兩者用量比為1∶1。當(dāng)二者用量均為8、12、16、20、24、28 μL，體系吸光度變化值ΔA 如圖2 所示。結(jié)果表明，在Fe2+和H2O2溶液用量為20 μL 時(shí)，ΔA 值基本穩(wěn)定，有最大值。因此，本實(shí)驗(yàn)選取的Fe2+和H2O2溶液最適用量為20 μL。

圖2 試劑用量對反應(yīng)體系的影響

2.1.3 反應(yīng)時(shí)間的影響

為了獲得穩(wěn)定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，對反應(yīng)時(shí)間進(jìn)行了控制。選取反應(yīng)時(shí)間依次為2、4、6、8、10、12 min，吸光度變化值ΔA 如圖3 所示。結(jié)果表明，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為8 min 時(shí)，ΔA 值基本穩(wěn)定，有最大值。因此，本實(shí)驗(yàn)選取的最適反應(yīng)時(shí)間為8 min。

圖3 時(shí)間對反應(yīng)體系的影響

2.2 ·OH 清除率測定結(jié)果

2.2.1 中藥水提液測定結(jié)果

按照1.4.3.2 節(jié)的方法依次測定4 種（黨參、黃芪、連翹、遠(yuǎn)志）中藥的水提取液對·OH 的清除率。如圖4 所示，發(fā)現(xiàn)黨參、黃芪清除·OH 的能力比較強(qiáng)，可以達(dá)到較好的清除效果；連翹、遠(yuǎn)志清除·OH的能力次之；由表1 可看出，4 種中藥水提取液對·OH 清除能力強(qiáng)弱順序依次為：黨參（63.74%）>黃芪（62.27%）>連翹（57.69%）>遠(yuǎn)志（56.96%）。實(shí)驗(yàn)選擇黨參和黃芪作為保健酒的藥食同源原料藥。

圖4 中藥水提液和抗壞血酸溶液對·OH 清除率測定

表1 4 種中藥水提液和抗壞血酸清除·OH 能力

2.2.2 保健酒測定結(jié)果

按照1.4.3.3 節(jié)的方法依次測定保健酒對·OH的清除率。如第12 頁圖5 所示，與基酒的·OH 的清除率相比，加入黨參和黃芪后的保健酒對·OH 的清除率均有提高，將黃米白酒的·OH 清除率由67.04%（第12 頁表2）分別提高到76.82%（黨參保健酒，表2）和79.39%（黃芪保健酒，表2），說明抗氧化性較高的中藥材加入基酒中是提高保健酒的·OH 清除率有效途徑；對比黨參和黃芪2 種保健酒，雖然黨參水提液（63.74%，表1）比黃芪水提液（62.27%，表1）的·OH清除率高，然而，黃芪保健酒的·OH 的清除率提高較大（79.39%，表2），高于黨參保健酒的·OH 的清除率（76.82%，表2），說明酒精作為溶劑更有利于黃芪有效成分的浸出，更能有效地萃取黃芪的有效成分，進(jìn)一步說明中藥和酒的協(xié)同效應(yīng)有利于促進(jìn)保健酒的抗氧化性能的提升。與市售相同酒精度數(shù)具有抗氧化性的某品牌保健酒相比（75.93%，表2），黨參保健酒的·OH 清除率與某品牌保健酒幾乎相同，說明黨參保健酒達(dá)到了市售保健酒抗氧化性的要求；而黃芪保健酒·OH 清除率略優(yōu)于市售品牌的保健酒，說明中藥和酒的協(xié)同效應(yīng)提高了保健酒的抗氧化性。

圖5 不同保健酒對·OH 清除率測定

表2 不同保健酒清除·OH 能力

3 結(jié)論

本文以·OH 清除率為標(biāo)準(zhǔn)，篩選具有較高·OH清除率的山西道地藥材黨參、黃芪制備保健酒。通過對比中藥水提液和保健酒，發(fā)現(xiàn)將抗氧化性較高的中藥材加入基酒是提高保健酒的·OH 清除率有效途徑；同時(shí)，由于酒是某些中藥材有效成分的優(yōu)良溶劑，中藥和酒的協(xié)同效應(yīng)有利于促進(jìn)保健酒抗氧化能力的提升。與市售酒精度數(shù)的具有抗氧化性的某品牌保健酒相比，本研究制備黨參保健酒的抗氧化活性達(dá)到市售保健酒要求；黃芪保健酒略優(yōu)于市售保健酒。由此可見，本文提出用·OH 清除率來評(píng)價(jià)保健酒，為行之有效的解決保健酒抗氧化性提供一個(gè)新的思路。