楊艾華 宋姍姍 林宇杰 胡小嬌 王秋 王微微

摘要 [目的]研究火炭母水提液的體內及體外抗氧化活性。[方法]采用體外試驗測定火炭母水提液對超氧陰離子自由基和羥基自由基的清除能力;體內試驗以秀麗隱桿線蟲為模型，測定火炭母水提液對線蟲壽命和應激損傷的影響。[結果]火炭母水提液對超氧陰離子自由基和羥基自由基具有一定的清除能力，并且隨著濃度的增加，自由基清除率逐漸增強;50 mg/mL火炭母水提液可以顯著延長線蟲壽命，并且提高線蟲在急性熱應激和氧化應激條件下的存活率。[結論]火炭母水提液具有良好的抗氧化活性，該研究為火炭母開發(fā)成為天然抗氧化劑和保健產品提供理論基礎。

關鍵詞 火炭母;水提液;體內外;抗氧化活性;秀麗隱桿線蟲

中圖分類號 R-284.1? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）13-0184-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.13.046

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study on Antioxidant Activity of Polygonum chinese L.Water Extracts in vitro and in vivo

YANG Ai hua，SONG Shan shan，LIN Yu jie et al

（College of Basic Medical Sciences，Zunyi Medical University，Zunyi，Guizhou 563000）

Abstract [Objective]To study the antioxidant activity of Polygonum chinese L.water extracts in vitro and in vivo.[Method]The in vitro test was used to determine the scavenging ability of the Polygonum chinese water extract on superoxide anion free radicals and hydroxyl free radicals.In vivo，Caenorhabditis elegans were used to study the effects of Polygonum chinese? water extracts on lifespan，hot stress and oxidative stress.[Result]The water extract of Polygonum chinese? had a certain scavenging ability to superoxide anion free radicals and hydroxyl free radicals，and as the concentration increases，the free radical scavenging rate gradually increased.The treatment with 50 mg/mL Polygonum chinese water extracts could increase the lifespan，and obviously improve the survival rate of C.elegans under hot stress and oxidative stress.[Conclusion]The water extract of Polygonum chinese has good antioxidant activity.This study provides a theoretical basis for the development of Polygonum chinese as a natural antioxidant and health care product.

Key words Polygonum chinese L.;Water extracts;In vitro and in vivo;Antioxidant activity;Caenorhabditis elegans

機體正常的代謝活動會產生自由基，正常情況下自由基的產生與清除會處于一種動態(tài)平衡狀態(tài)，但當體內自由基積累過多或機體抗氧化機能下降，過量的自由基會造成過氧化反應的發(fā)生并加速組織功能的損傷，此類氧化損傷也是造成腫瘤等疾病及機體衰老的原因之一[1-2]。因此，人們將關注點轉向具有良好抗氧化活性的天然產物，而中藥因其成分天然、整體均衡調節(jié)和毒副作用小等優(yōu)點受到廣泛關注[3]?；鹛磕福≒olygonum chinese L.）為蓼科蓼屬植物，是民間常見的中草藥，曾被收錄于1977年版《中華人民共和國藥典》、2004年《廣東省藥材地方標準》、2014年《廣西壯族自治區(qū)瑤藥材質量標準 第一卷》[4-6]，具有清熱除濕、涼血解毒、利肝明目、活血舒筋等功效[7]。研究表明，火炭母提取物具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗氧化、抑菌、抗腫瘤等藥理作用[8-12]。因此，火炭母在養(yǎng)生保健和臨床治療方面具有一定的開發(fā)價值。

秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）具有易培養(yǎng)、壽命短、便于觀察及全基因組序列明確等優(yōu)點，是中藥研究領域的常用模式生物[13-14]。該研究采用體外和體內相結合的方法，探討火炭母水提液對羥基自由基、超氧陰離子自由基的清除能力，并以秀麗隱桿線蟲為模型，觀察火炭母水提液對線蟲壽命和應激損傷的影響，以期為火炭母資源的深入開發(fā)與應用提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試材。火炭母，購于本地中藥市場;大腸桿菌（Escherichia coli）OP50、野生型N2秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans），由遵義醫(yī)科大學微免實驗室保存。

1.1.2 試劑。LB液體培養(yǎng)基、胰蛋白胨、瓊脂粉，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;氯化鈉、氯化鈣、磷酸鉀、無水硫酸鎂，均為分析純，天津市瑞金特化學品有限公司;膽固醇、硫酸鏈霉素、制霉菌素、5-FuDR （5-氟尿嘧啶脫氧核苷），北京索來寶科技有限公司。

1.1.3 設備。高速離心機（TD5M-WS），上海盧湘儀離心機儀器有限公司;酶標儀（ELx800），美國博騰儀器有限公司;電熱鼓風干燥箱（101-2AB），天津市泰斯特儀器有限公司;超凈工作臺（BCM-1000A），蘇州安泰空氣技術有限公司;恒溫水浴鍋（HH·W21·600S）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（HH-B11·600BY），上海躍進醫(yī)療器械有限公司;體視顯微鏡（MZ62-3D），廣州市明美廣電技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 火炭母水提液制備。

火炭母粉碎過40目篩備用，稱取火炭母粉末按1∶10的料液比加水浸泡30 min，加熱煮沸1 h，過濾并收集濾液。藥渣加水再提取1次，合并2次濾液，5 000 r/min 離心10 min，過濾取上清液。濾液加熱濃縮制成濃度為1 g/mL的火炭母提取液，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 火炭母水提液體外抗氧化活性測定。

將火炭母水提液配制為不同濃度樣品溶液，以VC作為陽性對照，分別采用鄰苯三酚自氧化法測定超氧陰離子自由基清除作用、水楊酸法測定羥基自由基清除作用[15]。

1.2.3 火炭母水提液體內抗氧化活性測定。

1.2.3.1 線蟲培養(yǎng)及同步化。參照文獻方法配制NGM培養(yǎng)基[16]，使用時以LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)OP50大腸桿菌，然后將菌液涂布在 NGM 培養(yǎng)基表面，37 ℃過夜培養(yǎng)后使用。選取線蟲生長良好的NGM平板，用M9緩沖液將線蟲沖洗收集于無菌離心管中，反復離心清洗后棄上清，加入裂解液（1 mol/L NaOH 與10% NaClO等體積混合，現(xiàn)配現(xiàn)用）混勻，渦旋振蕩5～8 min后離心棄上清得蟲卵。將蟲卵置于M9緩沖液中，20 ℃培養(yǎng)箱放置過夜，得到L1期幼蟲。將幼蟲轉移置NGM平板，20 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，此時即得L4期線蟲。

1.2.3.2 線蟲暴露處理方法。取同步化后的L4期成蟲，對照組加入M9緩沖液，試驗組以火炭母水提液處理線蟲24 h，用M9緩沖液清洗并收集于無菌EP 管中，反復離心洗滌，用于后續(xù)各試驗的測定。

1.2.3.3 線蟲壽命試驗。取經火炭母提取液暴露處理24 h后的線蟲，每個平板約20條線蟲，20 ℃培養(yǎng)。從轉移當天（壽命試驗當天）起計算線蟲存活天數(shù)，以鉑金絲碰觸線蟲仍然不動即判定為死亡，每隔2 d記錄線蟲存活和死亡條數(shù)，直至線蟲全部死亡。

1.2.3.4 線蟲急性熱應激試驗。取經火炭母提取液暴露處理24 h后的線蟲，每個平板約20條線蟲，將平板轉移置37? ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1 h 記錄線蟲存活數(shù)目，直至線蟲全部死亡。

1.2.3.5 線蟲急性氧化應激試驗。取經火炭母提取液暴露處理24 h后的線蟲加入12孔板中，每孔約20條線蟲。每孔中含有2 mL新鮮配制的0.03%過氧化氫溶液，每隔1 h 記錄線蟲存活數(shù)目，直至線蟲全部死亡。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗結果以 Excel 2010、SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件進行繪圖及統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 火炭母水提液的體外抗氧化活性

2.1.1 火炭母水提液對超氧陰離子自由基的清除作用。超氧陰離子在體內的積累是機體引發(fā)氧中毒的主要原因，因此，超氧陰離子的清除能力是體外抗氧化活性試驗中的一個重要指標[17]。由圖1可知，火炭母水提液對超氧陰離子自由基具有一定的清除能力，隨著濃度的增加，清除率逐漸升高，在試驗濃度范圍內的最大清除率達35.79%。但在相同濃度情況下，火炭母水提液清除超氧陰離子自由基的能力始終低于抗壞血酸（VC）。

2.1.2 火炭母水提液對羥基自由基的清除作用。

機體內羥基自由基能夠衍生為多種氧自由基，并快速與細胞分子發(fā)生反應，造成機體的多種損傷，是加速衰老及疾病發(fā)生的重要原因[18]。由圖2可知，火炭母水提液對羥基自由基具有一定的清除能力，隨著濃度的增加，清除率逐漸升高，并在50 mg/mL 時與同濃度條件下VC的清除效果相當。

2.2 火炭母水提液的體內抗氧化活性

2.2.1 火炭母水提液對線蟲壽命的影響。

正常培養(yǎng)情況下，秀麗線蟲的壽命為14～21 d[19-20]。由圖3和表1可知，50 mg/mL 火炭母水提液對線蟲壽命有顯著的促進作用（P<0.05），火炭母水提液處理后的線蟲最長壽命為20 d，明顯高于對照組，并且對照組線蟲的平均壽命為（9.63±0.92）d，用火炭母水提液處理后的線蟲平均壽命延長了16.61%。

2.2.2 火炭母水提液對熱應激條件下線蟲壽命的影響。

由圖4和表2可知，將秀麗線蟲置于37 ℃培養(yǎng)條件下，經50 mg/mL火炭母水提液處理后的線蟲在熱應激條件下的存活率得到顯著提高（P<0.05）。此時對照組線蟲的平均壽命為（3.41±0.32）h，用火炭母水提液處理后的線蟲平均壽命延長了17.88%。

2.2.3 火炭母水提液對氧化應激條件下線蟲壽命的影響。

由圖5和表3可知，將秀麗線蟲置于0.03%過氧化氫溶液中造成氧化損傷，經50 mg/mL火炭母水提液處理后的試驗組線蟲的存活率顯著提高（P<0.05）。此時對照組線蟲的平均壽命為（2.68±0.29）h，用火炭母水提液處理后的線蟲平均壽命延長了20.52%。

3 討論與結論

抗氧化劑能夠清除機體內積累過多的自由基，在維持正常生命活動及保持身體健康方面起著重要作用。隨著年齡增長或體內抗氧化劑不足時，攝入功能性的抗氧化食品也可以起到補充體內抗氧化劑的作用。研究表明，廣東涼茶之所以具有清熱解毒、下火祛濕等功效，原因可能來自其原料中多種中草藥含有的活性物質[21-23]?；鹛磕缸鳛閺V東涼茶的主要原料之一，富含多酚、多糖及黃酮類物質，可以作為天然抗氧劑的重要來源。該研究以火炭母水提液為對象，對其進行體外抗氧化活性及秀麗線蟲體內的抗氧化活性研究。體外試驗結果表明，火炭母水提液對超氧陰離子自由基和羥基自由基具有一定的清除能力，隨著濃度的增加，自由基清除率逐漸增強，并且在相同濃度條件下，火炭母水提液對羥基自由基清除效果更好。體內試驗結果表明，經50 mg/mL火炭母水提液處理后的線蟲平均壽命延長了16.61%，同時，在急性應激條件下火炭母水提液對秀麗線蟲具有一定的保護作用。由此可見，火炭母水提液具有良好的抗氧化活性，在天然抗氧化劑的開發(fā)方面具有潛在的應用價值。

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