王 曼，孟戎茜，周興隆

（太原工業(yè)學(xué)院化學(xué)與化工系，山西 太原 030008）

引言

蘆丁（rutin，Rt）又稱蕓香苷，屬于生物類黃酮，有著很好的藥理性質(zhì)[1]。蘆丁也稱維生素P，可增強(qiáng)毛細(xì)血管壁，具有細(xì)胞保護(hù)、降低炎癥和抗病毒[2-3]等作用。分析蘆丁的方法有很多，已發(fā)表測(cè)定蘆丁含量的方法有HPLC、CE、ECL 和FILDS 等。相比常用檢測(cè)方法，分子印跡傳感器具有選擇性強(qiáng)、檢測(cè)線低、成本低等優(yōu)點(diǎn)。分子印跡技術(shù)（molecular imprinting technology,MIT）是指在模板分子上留下特異匹配功能單體的空腔，從而制備具有特異選擇性的聚合物[4]。由于具有很好的識(shí)別性和實(shí)用性等特點(diǎn)，至今MIT在很廣的領(lǐng)域進(jìn)行了研究，包括色譜分離、固相萃取、模擬酶催化、生物醫(yī)藥等，并且在檢測(cè)傳感技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用取得了長(zhǎng)足進(jìn)展。分子印跡技術(shù)示意圖見(jiàn)圖1。

圖1 分子印跡技術(shù)示意圖[6]

電化學(xué)傳感器能將被檢測(cè)物質(zhì)的濃度和所反饋的電信號(hào)連結(jié)在一起，從而提供被檢測(cè)體系的信息[5]。電化學(xué)傳感器因?yàn)榉答佇畔⒖?、操作容易、低成本等?yōu)勢(shì)，在食品分析和醫(yī)療檢測(cè)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。

分子印跡聚合物（MIPs）對(duì)模板分子有優(yōu)異的選擇吸附性，MIPs 穩(wěn)定、易保存，因此，由此制備的分子印跡電化學(xué)傳感器有著更高的識(shí)別性和適應(yīng)環(huán)境的能力。所以在藥物分析及其他領(lǐng)域，分子印跡電化學(xué)傳感器應(yīng)用廣泛。

本文是通過(guò)構(gòu)建一種分子印跡電化學(xué)傳感器，來(lái)對(duì)蘆丁進(jìn)行檢測(cè)研究，最終使得蘆丁的回收率達(dá)到目標(biāo)結(jié)果。

1）考察電極制備、檢測(cè)條件，并將最佳的條件用于修飾電極，使得電極對(duì)蘆丁有良好的選擇性。

2）確定不同濃度RT 與檢測(cè)出的響應(yīng)電流之間的線性關(guān)系。再根據(jù)線性關(guān)系的濃度范圍確定研磨蘆丁成品的實(shí)際量。

3）進(jìn)行阻抗實(shí)驗(yàn)，比較MIP/GCE 電極洗脫前、洗脫后、富集后、非印跡液洗脫后測(cè)蘆丁的阻抗大小。

4）用修飾后的電極檢測(cè)一定濃度比的蘆丁成品與蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的混合溶液的蘆丁回收率，多次實(shí)驗(yàn)得出平均回收率。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 處理GCE

分別使用0.3 mm、0.05 mm 的氧化鋁漿對(duì)玻碳電極進(jìn)行打磨。過(guò)程中，按“8”字形的打磨方式進(jìn)行。用去離子水洗凈。

在鐵氰化鉀溶液中，采用CV 法對(duì)電極進(jìn)行校正檢測(cè)，最后觀察峰電位，要求氧化還原峰差在90 mV 以內(nèi)，再得以進(jìn)行后續(xù)的操作。

1.2 溶液的配制

配制12.5 mmol/L 蘆丁溶液：稱取0.194 7 g 蘆丁，用無(wú)水乙醇定容至25 mL。

配制2 mmol/Lp-AP 溶液：稱取0.005 5 g 對(duì)氨基苯酚固體，置入10 mL 0.05 mol/L 硫酸溶液，再進(jìn)行超聲溶解。

配制質(zhì)量濃度比為4∶1 的p-AP 與蘆丁聚合物溶液：量取1 mL 蘆丁溶液加入含有0.005 5 g P-AP 的非印跡溶液中，再用0.05 mol/L 硫酸溶液定容至25 mL 容量瓶中。隨后按照相同的方法分別配置2∶1、1∶1、0.5∶1、0.25∶1、0.125∶1 不同濃度的聚合物比例。

配制0.05 mol/L 硫酸溶液：稱量2.72 mL 98%的濃硫酸，用去離子水定容至1 L。

洗脫液的配制：10 mL 的無(wú)水乙醇溶液和10 mL氫氧化鈉溶液。

配制乙酸緩沖溶液：依次配制pH 分別為2.20、2.86、3.35、3.74、4.24、4.68 的乙酸緩沖溶液。

配制氫氧化鈉：稱取2.083 g 氫氧化鈉，用去離子水定容至100 mL。

1.3 沉積圈數(shù)的考察

將清洗干凈的玻碳電極放入先前配置的聚合物溶液中，在循環(huán)伏安法下依次改變沉積圈數(shù)（8、12、16、20、24、28 圈）對(duì)電極進(jìn)行沉積，沉積參數(shù)為掃速：0.1 V/s，掃描范圍：-0.2 V～0.8 V。然后將修飾過(guò)的電極經(jīng)洗脫后放在10 μmol/L 的蘆丁-乙酸緩沖溶液混合液中富集10 min，再在掃描速度為0.05 V/s，掃描范圍為0 V～0.7 V 工作站中對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，記錄不同沉積圈數(shù)的電極對(duì)混合溶液檢測(cè)的CV 曲線。通過(guò)對(duì)比不同圈數(shù)的峰電流大小，確定最佳沉積圈數(shù)。

1.4 分子印跡聚合物比例的考察

分別配制p-AP 與RT 的濃度比為6∶1、4∶1、2∶1、1∶1、0.5∶1、0.25∶1、0.125∶1 的聚合物溶液。在0.1 V/s 掃速、-0.2 V～0.8 V 掃描范圍，沉積圈數(shù)為12 圈的條件下依次按比例對(duì)玻碳電極進(jìn)行沉積。然后將修飾過(guò)的電極經(jīng)洗脫后放在10 μmol/L 的蘆丁-乙酸緩沖溶液混合液中富集10 min，再在掃速為0.05 V/s，掃描范圍為0 V～0.7 V 工作站中對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，記錄不同分子印跡聚合物比例的電極對(duì)混合溶液檢測(cè)的CV 曲線。通過(guò)對(duì)比不同分子印跡聚合物比例的峰電流大小，確定最佳分子印跡聚合物比例。

1.5 洗脫時(shí)間的考察

在電化學(xué)工作站中設(shè)置參數(shù)，0.1 V/s 的掃描速度、-0.2 V～0.8 V 的電位范圍，12 圈的沉積圈數(shù)，0.125∶1 的分子印跡聚合物比例。在此沉積條件下對(duì)玻碳電極進(jìn)行沉積。然后選擇洗脫時(shí)間為35、45、55、65、75 min 依次對(duì)玻碳電極進(jìn)行洗脫。將洗脫完的電極放在10 μmol/L 的蘆丁-乙酸緩沖溶液混合液中富集10 min，再在掃描速度為0.05 V/s，掃描范圍為0 V～0.7 V 工作站中對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，記錄不同洗脫時(shí)間的電極對(duì)混合溶液檢測(cè)的CV 曲線。通過(guò)對(duì)比不同洗脫時(shí)間CV 曲線的峰電流大小，確定最佳洗脫時(shí)間。

1.6 富集時(shí)間的考察

在電化學(xué)工作站中設(shè)置參數(shù)，0.1 V/s 的掃描速度、-0.2 V～0.8 V 的電位范圍，12 圈的沉積圈數(shù)，0.125∶1 的分子印跡聚合物比例，55 min 的洗脫時(shí)間。在此沉積條件下對(duì)玻碳電極進(jìn)行沉積。然后將修飾過(guò)的電極經(jīng)洗脫后放在10 μmol/L 的蘆丁-乙酸緩沖溶液混合液中富集0、2、5、8、10、12、15、18 min，再在掃描速度為0.05 V/s，掃描范圍為0 V～0.7 V 工作站中對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，記錄不同富集時(shí)間的電極對(duì)混合溶液檢測(cè)的CV 曲線。通過(guò)對(duì)比不同富集時(shí)間的峰電流大小，確定最佳富集時(shí)間。

1.7 掃描速度的考察

在電化學(xué)工作站中設(shè)置參數(shù)，0.1 V/s 的掃描速度、-0.2 V～0.8 V 的電位范圍，12 圈的沉積圈數(shù)，0.125∶1 的分子印跡聚合物比例，55 min 的洗脫時(shí)間。在此沉積條件下對(duì)玻碳電極進(jìn)行沉積。然后將修飾過(guò)的電極經(jīng)洗脫后放在10 μmol/L 的蘆丁-乙酸緩沖溶液混合液中富集12 min，再在掃描速度為0.01、0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 V/s，掃描范圍為0 V～0.7 V工作站中對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，記錄不同掃速的電極對(duì)混合溶液檢測(cè)的CV 曲線。

1.8 乙酸緩沖液pH 的考察

用冰醋酸和無(wú)水乙酸鈉分別配制pH 為2.20、2.86、3.35、3.74、4.24、4.68 的乙酸緩沖液備用。

在電化學(xué)工作站中設(shè)置參數(shù)，0.1 V/s 的掃描速度、-0.2 V～0.8 V 的電位范圍，12 圈的沉積圈數(shù)，0.125∶1 的分子印跡聚合物比例，55 min 的洗脫時(shí)間。在此沉積條件下對(duì)玻碳電極進(jìn)行沉積。然后將修飾過(guò)的電極經(jīng)洗脫后放在10 μmol/L 的蘆丁-乙酸緩沖溶液混合液中富集12 min，混合溶液中加入的乙酸緩沖溶液pH 分別是2.20、2.86、3.35、3.74、4.24、4.68。再在掃描速度為0.05 V/s，掃描范圍為0 V～0.7 V 工作站中對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，記錄CV 曲線。

1.9 線性關(guān)系和線性范圍的考察

在電化學(xué)工作站中設(shè)置參數(shù)，0.1V/s 的掃描速度、-0.2 V～0.8 V 的電位范圍，12 圈的沉積圈數(shù)，0.125∶1 的分子印跡聚合物比例，55 min 的洗脫時(shí)間。在此沉積條件下對(duì)玻碳電極進(jìn)行沉積。然后將修飾過(guò)的電極經(jīng)洗脫后放在10 μmol/L 的蘆丁-乙酸緩沖溶液混合液中富集12 min，混合溶液中蘆丁的濃度分別為0.25、0.5、0.7、1.0、1.5、5、7.5、8、9.5、10 μmol/L。再在掃描速度為0.05V/s，掃描范圍為0 V～0.7 V 工作站中對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，記錄不同蘆丁濃度的電極對(duì)混合溶液檢測(cè)的CV 曲線。

處理CV 圖上的峰電流值數(shù)據(jù)，并在坐標(biāo)系中以此為y 軸，蘆丁濃度為x 軸作散點(diǎn)圖。繪制出響應(yīng)峰電流與蘆丁濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，構(gòu)建線性關(guān)系，并確定與其對(duì)應(yīng)的線性范圍。

1.10 阻抗實(shí)驗(yàn)

阻抗實(shí)驗(yàn)一共進(jìn)行4 組，分別是印記液洗脫前進(jìn)行表征、印記液洗脫后進(jìn)行表征、印記液經(jīng)富集后進(jìn)行表征以及非印記液經(jīng)洗脫后進(jìn)行表征。

在電化學(xué)工作站中設(shè)置參數(shù)，0.1 V/s 的掃描速度、-0.2 V～0.8 V 的電位范圍，12 圈的沉積圈數(shù)，然后對(duì)將玻碳電極放在溶液中進(jìn)行沉積。沉積結(jié)束將玻碳電極放在鐵氰化鉀溶液中，對(duì)電位進(jìn)行估測(cè)，最后使用阻抗曲線檢測(cè)，記錄曲線。

在電化學(xué)工作站中設(shè)置參數(shù)，0.1 V/s 的掃描速度、-0.2 V～0.8 V 的電位范圍，12 圈的沉積圈數(shù)，然后對(duì)將玻碳電極放在溶液中進(jìn)行沉積。沉積結(jié)束將玻碳電極放在洗脫液中洗脫55 min，之后將其放在鐵氰化鉀溶液中，對(duì)電位進(jìn)行估測(cè)，最后使用阻抗曲線檢測(cè)，記錄曲線。

在電化學(xué)工作站中設(shè)置參數(shù)，0.1 V/s 的掃描速度、-0.2 V～0.8 V 的電位范圍，12 圈的沉積圈數(shù)，然后對(duì)將玻碳電極放在溶液中進(jìn)行沉積。沉積結(jié)束將玻碳電極放在洗脫液中洗脫55 min，之后放入乙酸緩沖溶液-蘆丁混合液中富集12 min。然后將其放在鐵氰化鉀溶液中，對(duì)電位進(jìn)行估測(cè)，最后使用阻抗曲線檢測(cè)，記錄曲線。

在電化學(xué)工作站中設(shè)置參數(shù)，0.1 V/s 的掃描速度、-0.2 V～0.8 V 的電位范圍，12 圈的沉積圈數(shù)，然后對(duì)將玻碳電極放在非印跡溶液中進(jìn)行沉積。沉積結(jié)束將玻碳電極放在洗脫液中洗脫55 min，之后將其放在鐵氰化鉀溶液中，對(duì)電位進(jìn)行估測(cè)，最后使用阻抗曲線檢測(cè)，記錄曲線。

對(duì)比4 組數(shù)據(jù)，得出結(jié)論。

1.11 蘆丁片實(shí)品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

沉積參數(shù)為掃描速度0.1 V/s，掃描范圍：-0.2 V～0.8 V，圈數(shù)12 圈，分子印跡聚合物比例0.125∶1，洗脫時(shí)間55 min。在此沉積條件下對(duì)玻碳電極進(jìn)行沉積。取2 片蘆丁片，研磨、過(guò)濾、用無(wú)水乙醇定容至25 mL。然后將修飾過(guò)的電極經(jīng)洗脫后放在加入20 μL 蘆丁樣品溶液的蘆丁-乙酸緩沖溶液混合液中富集12 min，再在掃速為0.05 V/s，掃描范圍為0 V～0.7 V 工作站中對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，記錄蘆丁實(shí)物混合液檢測(cè)的CV 曲線。通過(guò)響應(yīng)峰電流，帶入線性關(guān)系將其轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)的實(shí)物樣品溶液濃度。之后，依次考察80%的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液加100%的蘆丁成品液、100%的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液加100%的蘆丁試樣液、120%的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液加100%的蘆丁成品液。分別記錄CV 曲線，觀察響應(yīng)峰電流，將數(shù)據(jù)代回線性方程求出對(duì)應(yīng)的濃度，最后計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 電極分子印跡電化學(xué)傳感器沉積圈數(shù)的確定

分別采用6 種不同的沉積圈數(shù)在玻碳電極上進(jìn)行沉積，記錄不同沉積圈數(shù)的電極對(duì)混合溶液檢測(cè)的CV 曲線。

從圖2 可以看出，沉積圈數(shù)為12 圈時(shí)，響應(yīng)峰電流達(dá)到最大值，而隨著沉積圈數(shù)的減少或增加，響應(yīng)峰電流都表現(xiàn)出小幅度的下降。所以在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)電極的沉積圈數(shù)選擇為12 圈。

圖2 沉積圈數(shù)對(duì)響應(yīng)峰電流的影響

2.2 分子印跡聚合物比例的確定

分別采用7 種不同的p-AP 與Rt 的比例，記錄不同分子印跡聚合物比例的電極對(duì)混合溶液檢測(cè)的CV 曲線。

由第4 頁(yè)圖3 可以看出，隨著濃度比例的增大，蘆丁的電響應(yīng)都隨之減小，當(dāng)濃度比例為0.125∶1時(shí)，由于所稱取p-AP 的質(zhì)量已經(jīng)很低，再繼續(xù)減少p-AP 的質(zhì)量可能會(huì)降低對(duì)峰電流的檢測(cè)的效果，故選擇最佳的聚合物比例為0.125∶1。

圖3 分子印跡聚合物比例對(duì)響應(yīng)峰電流的影響

2.3 洗脫時(shí)間的確定

分別用6 種不同洗脫時(shí)間對(duì)修飾后的玻碳電極進(jìn)行洗脫，記錄不同洗脫時(shí)間的電極對(duì)混合溶液檢測(cè)的CV 曲線。

由第4 頁(yè)圖4 可以看出，最高峰電流的洗脫時(shí)間為55 min，以10 min 為單位，不論是減少或增加對(duì)電極的洗脫時(shí)間，表現(xiàn)出來(lái)的峰電流高度都會(huì)有著明顯的下降。同時(shí)，在進(jìn)行先洗脫40 min，再洗脫15 min 的情況下，所表現(xiàn)出的峰電流最強(qiáng)。所以在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，所選擇的洗脫時(shí)間為二次洗脫的55 min。

圖4 洗脫時(shí)間對(duì)響應(yīng)峰電流的影響

2.4 富集時(shí)間的確定

分別用8 種不同的富集時(shí)間來(lái)檢測(cè)最后蘆丁的電響應(yīng)程度，記錄不同富集時(shí)間的電極對(duì)混合溶液檢測(cè)的CV 曲線。

從圖5 可以看出，電響應(yīng)隨著電極在蘆丁混合溶液中富集時(shí)間的增加先升高再降低，在富集時(shí)間為12 min 時(shí)達(dá)到最高，隨之產(chǎn)生輕微的下降。導(dǎo)致此現(xiàn)象的原因可能是因?yàn)樽铋_(kāi)始由于空腔的存在，蘆丁會(huì)一直選擇性吸附在模板分子上，所以在12 min前，響應(yīng)峰電流響應(yīng)增加，而在之后，由于富集時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，電極表面的蘆丁會(huì)掉落一些，重新回到溶液，所以電流響應(yīng)會(huì)下降。

圖5 富集時(shí)間對(duì)響應(yīng)峰電流的影響

2.5 掃描速度的確定

分別采用6 種不同的掃描速度來(lái)檢測(cè)蘆丁，記錄不同掃速的電極對(duì)混合溶液檢測(cè)的CV 曲線，最后整合在一個(gè)坐標(biāo)系內(nèi)。

由圖6 可以看出，隨著掃描速度的增加，響應(yīng)峰逐漸升高，表明該實(shí)驗(yàn)過(guò)程是一個(gè)吸附過(guò)程。

圖6 對(duì)掃描速度的考察

2.6 pH 的確定

分別采用6 種不同的pH 緩沖溶液，記錄不同pH 的電極對(duì)混合溶液檢測(cè)的CV 曲線。

由圖7 可知，隨著pH 的變化，峰電流并沒(méi)有表現(xiàn)出絕對(duì)的規(guī)律，但在重復(fù)實(shí)驗(yàn)下，當(dāng)pH 為4.24時(shí)，響應(yīng)峰電流顯然高于其他情況，故最佳pH 為4.24。

圖7 pH 對(duì)響應(yīng)峰電流的影響

2.7 線性關(guān)系及線性范圍的確定

分別檢測(cè)了10 種不同濃度的蘆丁，記錄不同蘆丁濃度的電極對(duì)混合溶液檢測(cè)的CV 曲線。

由第5 頁(yè)圖8 可以看出，響應(yīng)峰電流與蘆丁濃度存在一定的聯(lián)系，分為小濃度的蘆丁濃度[圖8A）]和大濃度的蘆丁濃度[圖8B）]。其中小濃度是在0.2 μmol/L～1.6μmol/L 的濃度范圍內(nèi)，響應(yīng)峰電流與RT 濃度的線性直線為I=1.1196×10-6c+6.27×10-9，R2=0.987 7；大濃度在5 μmol/L～10 μmol/L 的濃度范圍內(nèi)，響應(yīng)峰電流與RT 濃度的線性直線為I=2.101 3×10-7c+9.625 7×10-7，R2=0.987 8。

圖8 蘆丁濃度和響應(yīng)峰電流的線性關(guān)系

2.8 阻抗結(jié)論

在洗脫前、洗脫后、富集后及非印跡電極依次放在鐵氰化鉀中進(jìn)行阻抗實(shí)驗(yàn)，記錄實(shí)驗(yàn)曲線圖。

由圖9 可以看出，由于在沉積后會(huì)有蘆丁附著在電極表面，而蘆丁的導(dǎo)電性并不好，所以沉積后的電阻是最大的，又因?yàn)楦患^(guò)程中，蘆丁會(huì)進(jìn)入分子印跡的空穴，因此就會(huì)使電極阻抗進(jìn)一步增大，而在洗脫后，由于附著在電極表面的蘆丁已經(jīng)洗脫干凈，因此電極表面的電阻是最小的。

圖9 阻抗表征圖

2.9 蘆丁片成品檢測(cè)

本論文檢測(cè)蘆丁回收率采用2 片蘆丁片進(jìn)行研磨、溶解。然后將修飾過(guò)的電極經(jīng)洗脫后放在加入20μL 蘆丁樣品溶液的蘆丁-乙酸緩沖溶液混合液中富集12 min，再在掃描速度為0.05 V/s，掃描范圍為0 V～0.7 V 工作站中對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，記錄蘆丁實(shí)物混合液檢測(cè)的CV 曲線。通過(guò)響應(yīng)峰電流，帶入線性關(guān)系將其轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)的實(shí)物樣品溶液濃度。之后，依次考察不同比例的蘆丁成品液。分別記錄CV 曲線，觀察響應(yīng)峰電流，將數(shù)據(jù)代回線性方程求出對(duì)應(yīng)的濃度，最后計(jì)算回收率和蘆丁片的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。見(jiàn)表1。

表1 樣品回收率表

3 結(jié)論

本文用于蘆丁的檢測(cè)，構(gòu)建了一種基于對(duì)氨基苯酚的分子印跡電化學(xué)傳感器。研究了不同制備和檢測(cè)條件響應(yīng)峰電流的影響。用洗脫前、洗脫后、富集后及非印跡電極在鐵氰化鉀溶液中進(jìn)行阻抗表征。最后用最佳的制備檢測(cè)條件來(lái)對(duì)蘆丁片進(jìn)行實(shí)物樣品的檢測(cè)，計(jì)算出回收率。具體結(jié)論如下：

1）最優(yōu)制備條件是沉積圈數(shù)12 圈，分子印跡聚合物濃度比例為0.125∶1。

2）最優(yōu)的檢測(cè)條件是洗脫時(shí)間為55 min，富集時(shí)間為12 min，最佳緩沖液pH=4.24。

3）在掃速實(shí)驗(yàn)中，表明了此次實(shí)驗(yàn)過(guò)程是一個(gè)吸附過(guò)程。

4）在小濃度范圍即0.2μmol/L～1.6μmol/L內(nèi)，線性關(guān)系為I=1.119 6×10-6c+6.27×10-9，R2=0.987 7；在大濃度范圍即5 μmol/L～10 μmol/L 內(nèi)，線性關(guān)系為I=2.101 3×10-7c+9.625 7×10-7，R2=0.987 8。

5）在阻抗實(shí)驗(yàn)中，洗脫前、洗脫后、富集后及非印跡電極，這四種電極在鐵氰化鉀溶液中進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明洗脫后的阻抗最小。

6）計(jì)算回收率時(shí)，得出平均回收率為94.84%，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為39.22%。